Detección de una variante rara transcripción de CDH1 en tejidos de cáncer gástrico congelado por PCR Digital basado en el Chip

El objetivo general de este método es detectar variantes raras de transcripción en tejidos frescos congelados mediante PCR digital basada en chip. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del cáncer, como la detección de variantes raras de transcripción que pueden estar involucradas en la carcinogénesis. La principal ventaja de esta técnica es que permite la detección de dianas de baja abundancia, mejorando la precisión y la reproducibilidad con respecto a la PCR cuantitativa estándar de oro.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la detección de un número bajo de moléculas de ADNc en tejidos humanos recién congelados, también se puede aplicar a otros tipos de muestras biológicas. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque es necesario adquirir cierta habilidad en la preparación de las fichas y la definición de los parámetros para el análisis. Para comenzar, deje que la mezcla maestra y el ensayo se descongelen a temperatura ambiente durante al menos 20 minutos.

A continuación, cargue tubos de 0,5 mililitros con seis alícuotas de microlitros de las muestras de ADNc. Además, haga un tubo de control sin plantilla. A continuación, vórtice suavemente la mezcla maestra y alícuota 8,7 microlitros por reacción en un tubo estéril.

A continuación, para cada reacción, añada 0,87 microlitros del cebador de ensayo personalizado y 1,83 microlitros de agua sin nucleasa. Mezcle la combinación suavemente y transfiera 11,4 microlitros a cada tubo que contenga ADNc y al control sin plantilla. Luego, mezcle los tubos suavemente y agrupe el contenido del tubo mediante centrifugación por pulsos.

Para obtener resultados óptimos, cargue las fichas lo antes posible. Conecte el cargador de chips y espere hasta que la luz indicadora se vuelva verde. Luego, prepare la jeringa de líquido de inmersión tirando suavemente del émbolo hasta uno o dos milímetros, luego retire la tapa y agregue la punta.

A continuación, tome nota del código escrito en la tapa de un nuevo chip. Luego, sostenga la tapa con cuidado por un lado, retire la película protectora y colóquela en el nido de la tapa con el lado adhesivo hacia arriba. Ahora, presione la palanca para abrir la abrazadera y cargue con cuidado el chip en el nido de chips.

A continuación, coloque una nueva cuchilla de carga en el cargador. Empújelo suavemente para asegurarse de que esté firmemente en su lugar. Ahora, transfiera 14,5 microlitros de mezcla de reacción a la cuchilla de carga.

No haga burbujas de aire y no desvíe la cuchilla. Luego, presione el botón negro de carga para distribuir el volumen en el chip. Es importante confirmar que la cuchilla de carga esté en su lugar.

Luego, mientras llena la cuchilla, no presione la pipeta hasta el segundo tope, para evitar la introducción de burbujas. Además, no desvíe la hoja con la punta. Proceda utilizando la jeringa para transferir unas 20 gotas de líquido de inmersión sobre la superficie del chip.

Tenga cuidado de no tocar la superficie con la punta y cubra completamente la superficie sin desbordarla. A continuación, gire el brazo del cargador para que la tapa entre en contacto con el chip y presione hacia abajo durante 15 segundos. Luego, presione el botón de la tapa para liberar el chip y devuelva el brazo del cargador a su posición de reposo.

Ahora, abra la abrazadera y sostenga el chip ensamblado en un ángulo de 45 grados para dispensar cuidadosamente el líquido de inmersión a través del puerto de llenado a través de una jeringa. Luego, gire ligeramente el chip para eliminar las burbujas de aire y luego elimine el exceso de líquido con una toallita estéril. Evite derramar líquido de inmersión en el borde del chip.

Si eso sucede, retire con cuidado el exceso antes de sellar. Finalmente, selle la caja de chips despegando suavemente la etiqueta de la tapa y luego bloquee el puerto de llenado durante al menos cinco segundos. Ahora, use el chip dentro de las dos horas y, hasta entonces, guárdelo en la oscuridad.

Para configurar la reacción, abra la tapa e instale los adaptadores en ambos bloques, incluso cuando se utilice un solo bloque. A continuación, coloque un chip en los bloques de muestra y oriente sus puertos de llenado hacia la parte delantera del termociclador, y eleve ligeramente el puerto. Usa fichas vacías para equilibrar los dos bloques.

A continuación, coloque la almohadilla térmica sobre la configuración para cubrir completamente los chips. Luego, programe los ciclos, cierre la tapa e inicie la reacción. Cuando termine la reacción, apague el termociclador, retire las almohadillas térmicas y luego retire las virutas.

Deje que las papas fritas se descongelen a temperatura ambiente durante al menos 10 minutos en la oscuridad y analícelas dentro de una hora. Limpie la superficie de la viruta con isopropanol mientras la inspecciona en busca de fugas u otros problemas. Para guardar los datos, inserte una memoria USB en el sistema de detectores, donde se pueden guardar los datos.

A continuación, abra la bandeja de chips del sistema detector y cargue el chip boca arriba. Cierre la bandeja y espere 30 segundos para que se procesen los datos. Luego, retire el chip y repita el proceso para el siguiente chip.

A continuación, mueva la memoria USB del detector a una computadora y transfiera los archivos. Abra el software basado en la nube, luego cree un proyecto e importe todos los archivos de datos para los chips de interés. A continuación, en la pestaña Definir virutas, seleccione el tinte y el ensayo utilizados.

Determine si el chip es aceptable visualizándolo en la pestaña Revisar datos. Si la muestra se cargó correctamente, al menos 13.000 puntos deberían ser utilizables. A continuación, observe el diagrama de dispersión de la ficha seleccionada.

Allí, aplique un umbral definido por el tipo de ensayo. Para la señal de colorante reportero de amidita fluoresceína, utilice un umbral de 6.000. Ahora, elimine cualquier señal dudosa que pueda dar lugar a falsos positivos.

Seleccione el punto cuestionable en el diagrama de dispersión con la herramienta Lazo y seleccione la opción Indeterminado. Todos los puntos positivos restantes indican la presencia de copias de ADNc del raro objetivo analizado. Utilizando el procedimiento presentado aquí, comprobamos la expresión de la rara variante de transcripción CDH1a en tejidos gástricos frescos congelados.

Si el chip tenía varias burbujas, una sola burbuja grande o menos de 13.000 puntos de datos, se omitía del análisis. No había señales positivas por encima del umbral seleccionado de 6.000 para el canal FAM en el control sin plantilla. Los puntos amarillos indican que no hay amplificación.

Un análisis fino filtró los puntos de datos de baja calidad y eliminó el riesgo de resultados ambiguos. Cuando se localizaba una señal azul, que indicaba amplificación, si estaba en los bordes del chip o alrededor de burbujas, la señal se omitía. Del mismo modo, para evitar aún más el riesgo de falsos positivos, es probable que las señales por encima del umbral de FAM seleccionado y en el extremo derecho de la gráfica sean específicas y también se filtraron.

Se analizaron 21 muestras pareadas de tejido normal y canceroso y 11 muestras tumorales adicionales. En general, la transcripción poco frecuente CDH1a fue detectable en 15 de los 32 tumores. Por el contrario, ninguna de las 21 muestras de tejido de control mostró la presencia de esta rara transcripción.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo detectar una variante de transcripción rara en tejido fresco congelado mediante PCR digital basada en chip. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en seis u ocho horas, dependiendo del número de muestras, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar cargar con precisión la muestra en la cuchilla.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del diagnóstico molecular exploraran variantes de secuencia raras en pacientes con cáncer.