Name: Evaluación de la función de la vesícula extracelular durante la infección de la Malaria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Aprende a evaluar la función de vesículas extracelulares durante la infección de malaria usando Plasmodium falciparum. Este método permite visualizar la internalización por células endoteliales y estudiar el ARN vesicular.

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Este estudio fue apoyado en parte por la Fundación Novartis para el médico y biológico investigación (PYM), el Gottfried y Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (a MW y PYM) y el grupo de investigación de la Universidad de Friburgo (a PYM). Subvenciones adicionales incluyen las becas de excelencia de gobierno suizo para académicos extranjeros (a KAB y SM). Agradecemos a Isabelle Fellay y Solange Kharoubi Hess para el soporte técnico.

Glóbulos rojos humanos fueron obtenidos de la sangre de donantes sanos, siguiendo las directrices de Swissethics (swissethics.ch).
Nota: Culturas de parásito p. falciparum (3 7) y la producción de EV fueron descritos previamente en Mbagwu, et al. 11 debido a p. falciparum es un patógeno humano, consulte las normas locales para el manejo. Las culturas deben conservarse estéril todo el tiempo.
1. fluorescencia de etiquetado de los vehículos eléctricos
Nota: El siguiente procedimiento aprovecha la tecnología de etiquetado estable incorporación de un colorante fluorescente verde (PKH67) con grandes colas alifáticas en la región del lípido de la membrana EV. La reacción se realiza en un volumen que contiene una concentración final de 20 μm de PKH67 la coloración final de 200 μl. Realizar todos los pasos en la temperatura ambiente (20-25 ° C)
<ol><li>Coloque 100 μg de EVs en 1 mL de PBS en un tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Centrifugue lo EVs en un tubo de microcentrífuga a máxima velocidad (20.000 x g) durante 7 minutos para que sedimenten. Nota: Puesto que leucocito-asociado de malaria está presente en EVs, debe observar un pellet marrón rojo oscuro. Si el sobrenadante es rojizo, con lisis del EVs.</li>
	<li>Después de la centrifugación, aspirar el sobrenadante con cuidado, para evitar retirar cualquier EVs. Nota: Minimizar la cantidad de buffer restante antes de resuspender EVs en diluyente C para aumentar la reproducibilidad y eficacia de la tinción.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de EV en 100 μl de diluyente de C (2 X EV suspensión) y pipetee suavemente para asegurar la completa dispersión.</li>
	<li>Preparar un tubo nuevo de microcentrífuga y añadir 4 μL de la solución de tinte etanólico de PKH67 a 100 μl de diluyente C. Vortex bien para mezclar. Preparar esta solución colorante de 2 x (40 μm) inmediatamente antes de la tinción. Nota: Para evitar coloración heterogénea, no agregue la solución de colorante etanol PKH67 directamente a la pelotilla de EV.</li>
	<li>Rápidamente, se combinan los 100 μl de 2 X EV suspensión (paso 1.4) con 100 μl de 2 X solución de colorante (criterio 1.5). Luego, mezcle la muestra mediante pipeteo arriba y abajo 10 veces.</li>
	<li>Incubar la suspensión EV/tinte de paso 1.6 durante 5 minutos protegida de la luz y mezcla por Vortex 3 - 4 veces durante la incubación de 5 minutos. Nota: Incubando la suspensión EV/tinte por más tiempo no proporciona ninguna ventaja, ya que la coloración es tan rápida.</li>
	<li>Detener la reacción de tinción mediante la adición de un volumen igual (200 μL) de suero e incubar durante 1 min permitir la Unión de exceso de tinte. Nota: Antes de parar la tinción, agotan el suero de EVs por centrifugación a 20.000 x g durante 20 minutos.</li>
	<li>Lavar 3 veces con PBS y giro a 20.000 x g durante 5 minutos vuelva a suspender el servicio voluntario europeo en 100 μl de PBS a una concentración final de 1 μg/μl.</li>
</ol>2. visualizar la absorción de EVs por Microscopía Confocal
Nota: El siguiente protocolo describe el seguimiento de la internalización de la EV por las células endoteliales cultivadas en cubreobjetos de vidrio. Las células endoteliales son las células endoteliales de la médula ósea humanas semi inmortalizadas como se describe en12.
<ol><li>Trabajar en un ambiente estéril, cubrir el cubreobjetos con un exceso de 0.01% poly-L-lisina 10 min a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Aspirar la solución de poli-l-lisina y permita que el cubreobjetos se seque por completo.</li>
	<li>Realizar un recuento de células endoteliales viables mediante exclusión del azul tripán y un hemocitómetro.</li>
	<li>Transferencia de 1 x 105 células endoteliales en 1 mL de endotelial célula crecimiento medio completo que contiene la mezcla del suplemento a los cubreobjetos poly-L-lisina-revestida y dejar que las células crecen a una monocapa. Nota: El medio contiene factores de crecimiento que permiten a las células para formar una monocapa y forman a uniones estrechas.</li>
	<li>Una vez que las células forman una capa monomolecular, cuidadosamente aspirar el medio y añadir 1 mL de medio fresco para lavar las células. Repita el lavado una vez más. Añadir 50 μg de PKH67 marca EVs e incubar durante 4 h. Nota: Para encontrar el momento óptimo para la absorción, puede realizarse un curso de tiempo.</li>
	<li>Después de 4 h, Aspire el medio y lavar las células 3 veces con PBS para eliminar el exceso y EVs. Fijar las células con solución de paraformaldehído al 3% en PBS durante 15 minutos. Nota: El metanol puede interrumpir actina durante el proceso de fijación; por lo tanto, es mejor evitar cualquier metanol con fijadores u otros fijadores disolventes. Se recomienda usar el formaldehido libre de metanol como fijador.</li>
	<li>Lavar las células 3 veces con PBS. Añadir cuidadosamente 250 μl de 0,1% Tritón X-100 en PBS para permeabilizar las células. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.</li>
	<li>Lavar 3 veces con PBS. Añadir 400 μL de solución amortiguadora de bloqueo (5% de BSA en PBS) durante 30 min a RT para bloquear la fijación no específica.</li>
	<li>Lavar las células una vez con PBS. Prepare la solución de tinción por dilución 5 μl de la solución madre phalloidin en 200 μL BSA de PBS/1% por cada cubreobjetos. Pipetee 200 μL de la solución de tinción en el cubreobjetos e incubar por 20 min a TA.</li>
	<li>Lavar 3 veces con PBS. Contratinción al ADN para 30 s con Hoechst 33342 a una concentración final de 2 μg/mL en 200 μL de PBS.</li>
	<li>Lavar 2 x el cubreobjetos por añadir 400 μL de PBS. Cuidadosamente tomar el cubreobjetos con el fórceps e invertir en la parte superior una gota de los medios de montaje en un portaobjetos de vidrio de preservador de fluorescencia. Retire suavemente el exceso de medio con un pañuelo y sello de cada lado con esmalte de uñas.</li>
	<li>Almacenar las diapositivas protegidas de la luz a 4 ° C.</li>
	<li>Visualizar las células utilizando un microscopio confocal de láser excitaciones 405 488 y 543 nm y un 63 X, objetivo de aceite de 1,3 NA con emisiones fluorescentes en 450-470 nanómetro (azul), 505-530 nm (verde) y 620 nm. Nota: Resultados de tinción de F-actina típica se muestran en la figura 1.</li>
</ol>3. permeabilidad de la célula endoteliales
Nota: Permeabilidad de la célula endotelial se evaluó mediante la medición de la transferencia de rodamina B isotiocianato-dextrano (promedio MW 70.000) a través de la monocapa de células endoteliales. Dextran proporciona una excelente herramienta para estudiar la permeabilidad vascular.
<ol><li>Recuento viable las células endoteliales mediante la exclusión de azul de tripano 0.4% y un hemocitómetro.</li>
	<li>Las células endoteliales con una densidad de 0.6 x 105 células a confluencia en cultivo de tejido de 24 pocillos rellenos (0,4 μm tamaño de poro) y deja inalterado durante al menos 5 días formar monocapas diferenciadas de la placa. Actualizar el medio cada dos días.</li>
	<li>Una vez que las células alcancen una monocapa, cargar el EVs (50 μg en 1 mL) en la cámara alta. Agregue rodamina-dextran para la superior a una concentración final de 20 mg/mL. Incube las células a 37 ° C con 5% CO2.</li>
	<li>Supervisar a la transferencia de los dextranos fluorescentes en la parte inferior bien mediante la medición de emisión de fluorescencia de alícuotas medias de 40 μl. Configurar el lector de microplacas de varias etiquetas en el 544 de nm de excitación y 590 emisiones nm para mediciones. Nota: La cantidad de dextrano difusa puede cuantificarse usando curvas de calibración con la solución. Además, experimentos cinéticos pueden realizarse mediante la eliminación de pequeñas muestras del medio exterior de la cámara durante un tiempo (figura 2). Incluso sin tratamiento, el dextrano se difundirá a través de la monocapa celular.</li>
</ol>4. determinar la sensibilidad de puromicina
Nota: Antes de transducción de las líneas celulares con lentivirus, es importante determinar la curva de la muerte de un medicamento seleccionado para esa línea celular particular. Para determinar la cantidad mínima de concentración de fármaco necesaria para matar todas las células, realizar un experimento de respuesta de dosis con dosis incrementales de la droga seleccionada. Porque cada línea de células de mamífero tiene una sensibilidad diferente, antes de experimentación, debe determinarse la concentración óptima de los antibióticos mediante el desarrollo de la valoración de la curva de muerte como se detalla a continuación.
<ol><li>Contar las células con el hemocitómetro. Resuspender las células endoteliales a una concentración de 1 x 105 células/mL en endotelial célula crecimiento medio completo que contiene la mezcla del suplemento.</li>
	<li>Placa de 1 x 104 células en una placa de 96 pocillos en un volumen final de 100 μl del medio de crecimiento celular endotelial.</li>
	<li>Añada 100 μl de medio con antibióticos para obtener una concentración de 0.1-10 μg/mL (ver figura 3).</li>
	<li>Examinar la viabilidad de la célula cada 2 días un microscopio óptico con objetivo 20 X. Las células de la cultura durante 10-14 días y reemplazar los medios de comunicación que contiene puromicina cada 2-3 días dependiendo del crecimiento de la célula.</li>
	<li>Añadir 10 μL/pocillo MTS reactivo en cada pocillo, mezclar e incubar durante 4 h a 37 ° C en condiciones de cultivo estándar.</li>
	<li>Agitar brevemente la placa sobre un agitador y medir la absorbancia de las células tratadas y no tratadas usando un lector de placas a 490 nm (figura 3).</li>
</ol>5. transducción de las células endoteliales con vectores lentivirales
<ol><li>Placa de 1 x 105 células endoteliales en 1 mL de medio completo el día antes de transducción de señales. Realizar la transducción de señales cuando las células han llegado a 50-80% de confluencia.</li>
	<li>Descongelar los lentivirus en hielo y hacer alícuotas de las poblaciones virales para evitar ciclos de congelación-descongelación. Girar hacia abajo el material a 200 x g durante 30 s, en los tubos antes de abrir para evitar derrames.</li>
	<li>Añadir bromuro de hexadimethrine a las células a una concentración final de 8 μg/mL. Nota: El bromuro de Hexadimethrine ayuda a la eficiencia de la transducción de señales, sin embargo en algunos casos pueden ser tóxico para las células. Por lo tanto, la concentración óptima debe determinarse mediante la realización de una curva de la muerte antes de la transducción.</li>
	<li>Agitar la placa suavemente para mezclar. Añadir la cantidad de partículas virales (entre 0.5-2 x 106 partículas) en una conveniente multiplicidad de infección (MOI) y agitar la placa suavemente por 30 s para mezclar.</li>
	<li>Centrifugar la mezcla de la partícula viral a la célula en la centrifugadora a temperatura ambiente por 45 min a 300 x g para aumentar la eficiencia de la transducción de señales. Incubar la mezcla de la partícula viral a la célula a 37 ° C durante la noche.</li>
	<li>Retire con cuidado el medio que contiene la partícula viral y deseche adecuadamente. Reemplazar con dulce, con medio de cultivo completo.</li>
	<li>Comenzar la selección con puromicina en el segundo día: Quite el medio y sustituirlo con medio fresco que contiene la concentración correcta de puromicina determinada previamente en la sección 4 (figura 3).</li>
	<li>Cosecha de células después de la selección de puromicina y aislar RNA usando un RNA aislar kit siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Realizar síntesis de cDNA con el seleccionado miRNAs mediante una transcripción reversa kit (véase la Tabla de materiales).</li>
	<li>Configurar la reacción de qPCR según el citado Protocolo13.</li>
</ol>

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.who.int/malaria/publications/world-malaria-report-2015/report/en/">WHO Malaria Report 2015</a>. , (2015).</li>
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<li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infected+erythrocyte-derived+extracellular+vesicles+alter+vascular+function+via+regulatory+Ago2-miRNA+complexes+in+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria.</a> Nat Commun. 7, 12727(2016).</li>
<li>Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+Characterization+of+Extracellular+Vesicles+in+Malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria.</a> Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).</li>
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<li>Jambou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+adhesion+on+human+brain+microvascular+endothelial+cells+involves+transmigration-like+cup+formation+and+induces+opening+of+intercellular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions.</a> PLoS Pathog. 6 (7), e1001021(2010).</li>
<li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-secreted+miR-105+destroys+vascular+endothelial+barriers+to+promote+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis.</a> Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Varias parásitos, incluyendo el Toxoplasma, Trypanosoma, Leishmania y Trichomonas desencadenan la liberación de los vehículos eléctricos por la célula huésped infectada. Dependiendo de los patógenos, el EVs liberado puede modular la respuesta inmune del huésped o median la comunicación celular entre los parásitos6. Sin embargo, hay poca evidencia que sugiere cómo estas vesículas pequeñas contribuyen a la enfermedad de la malaria. Aquí, hemos descrito varias maneras de investigar la función de los ...

Según la Organización Mundial de la salud, había 212 millones de nuevos casos de malaria en todo el mundo en 2015 y aproximadamente 429.000 personas murieron, principalmente a niños menores de cinco años de edad1. Los mecanismos que conducen a la enfermedad severa, que a menudo se asocia con disfunción vascular, siendo mal definidas2. Plasmodium- iRBCs secretan esferas pequeñas de bi-lípidos de membrana conocidas como vesículas extracelulares (EVs). Es sabido que los EVs son potencialmente relevantes para el proceso de infección y la respuesta inmune del huésped a la infección; sin embargo, poco se sabe sobre la función exacta de estas vesículas pequeñas durante la infección de la malaria3. Es posible que juegan dos papeles importantes: por un lado, podría contribuir a la patogenesia activando macrófagos4,5; y por otro lado, podría mediar comunicación celular entre parásitos y entre parásitos y huésped6,7. De hecho, parásitos pueden transferir proteínas o ácidos nucleicos entre sí a través de EVs. Por ejemplo, Trypanosoma brucei rhodesiense EVs puede transferir factor de virulencia Serum Resistance-Associated (SRA) y puede dirigirse a otros T. brucei y host eritrocitos8. Además, por p. falciparum- iRBCs comunicarse entre sí mediante la transferencia de ácidos nucleicos dentro de EVs. Esto permite que los parásitos optimizar y sincronizar su crecimiento. De hecho, EVs podría ser el regulador principal de conversión gametocyte y por lo tanto contribuir a la regulación de la fase de transmisión7.
No sólo lo EVs regulan los parásitos, también median las interacciones huésped parásito. Recientemente hemos descubierto que los EVs de iRBCs contienen microRNAs derivados del host (miRNAs; especies pequeñas de RNA en el rango de 21-25 nucleótidos9) que son tomados por células endoteliales humanas. Los miRNAs en el EVs forman un complejo con antes2 estable (un miembro de la RNA-inducido silenciando complejo), que una vez entregado a las células del receptoras, es capaz de silenciar genes específicamente y que afectan a las propiedades de barrera de las células10. Protocolos se han desarrollado para investigar la función de los vehículos eléctricos. Aquí, describimos primero un protocolo que permite el etiquetado fluorescente de EVs para investigar su absorción por las células del receptoras. Además, mediante el uso de un microscopio confocal, es posible rastrear el destino de la EV interior de la célula. Varios tintes fluorescentes pueden utilizarse para rastrear la EVs. El tinte reactivo amino, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein diacetato Succinimidyl (CFSE) y fluorescente de calceína-AM se convierten una vez dentro de las vesículas. Preferimos utilizar la etiqueta anfifílicas, PKH, porque da una señal más brillante y más uniforme. Este enfoque proporciona información importante para entender las interacciones entre células receptores y EVs. Mientras que en algunos casos EVs se unen a la superficie de las células, algunas vesículas se toman rápidamente. A absorción, EVs entregar sus cargas a las células, en el cual ejercen sus funciones reguladoras.
Aquí, describimos un protocolo para medir la función de barrera de las células endoteliales en vitro mediante la cuantificación de la transferencia de un dextrano fluorescente a través de una monocapa celular. Marcadores más sensibles pueden utilizarse como marcadores radiactivos. Sin embargo, requieren precauciones especiales para el uso. Otros ensayos existen para medir la función de barrera en vitro como resistencia eléctrica transendothelial (TEER), que mide la integridad de la ensambladura apretada. Finalmente visualizar ZO-1, una proteína de Unión estrecha, por inmunofluorescencia permite la evaluación de la integridad de la ensambladura apretada bien10. Como EVs son entidades complejas y heterogéneas que contienen varias cargas con característica reguladora potencial, es útil para sobreexpresar un ARN específico para estudiar su efecto sobre la célula receptora. Por lo tanto, definimos también un protocolo que pretende generar líneas celulares estables expresando la miRNA de interés10.

<table><tbody><tr><td>PKH67 Verde Enlazador de Celdas Fluorescentes Mini Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Diluyente C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8278</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher - Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Faloidina CF594</td><td>Biotio</td><td>#00045</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Mountant Antidecoloración</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Isotiocianato de rodamina B&ndash; Dextran</td><td>ThermoFisher</td><td>R9379-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Inserto con membrana de PET Falcon transparente&nbsp; para placa de 24 pocillos</td><td>Falcon</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Crecimiento de células endoteliales&nbsp; Medio MV</td><td>Promocell</td><td>C-22020</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina diclorhidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>MTS Kit de ensayo colorimétrico de proliferación celular</td><td>Biovision</td><td>K300-500</td><td></td></tr><tr><td>bromuro de hexadimetrina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td></td></tr><tr><td>MISSION&nbsp; MicroARN de Lenti, Humano has-miR-451a</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HLMIR0583</td><td></td></tr><tr><td>MISIÓN MicroARN de Lenti, ath-miR416, Partículas de transducción de control negativo 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NCLMIR001</td><td></td></tr><tr><td>MISIÓN&nbsp; MicroARN de Lenti,</td><td>Sigma-Aldrich</td> humano <td>NCLMIR0001</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Kit de transcripción inversa de microARN 1000 reacciones</td><td>ThermoFisher</td><td>4366597</td><td></td></tr><tr><td>has-mir-451a&nbsp; RT/750 PCR rxns</td><td>ThermoFisher</td><td>001141</td><td></td></tr><tr><td>U6 snRNA</td><td>ThermoFisher</td><td>001973</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, con UNG</td><td>ThermoFisher</td><td>4440038</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Sistema de PCR en tiempo real</td><td>ThermoFisher</td><td>4376600</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación de la función de la vesícula extracelular durante la infección de la malaria

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

La malaria es una enfermedad potencialmente mortal causada por parásitos de Plasmodium , p. falciparum siendo la más frecuente en el continente africano y responsable de la mayoría de las muertes relacionadas con el paludismo a nivel mundial. Varios factores, incluyendo el secuestro de parásito en los tejidos, disfunción vascular y las respuestas inflamatorias influyen en la evolución de la enfermedad en personas infectadas por la malaria. P. falciparum-glóbulos rojos infectados (iRBCs) liberar pequeñas vesículas extracelulares (EVs) que contiene diferentes tipos de carga moléculas que median la comunicación celular y patogénesis entre parásitos y huésped. EVs se toman eficientemente por las células en las que modula su función. Aquí se discuten estrategias para abordar el papel de EVs en las interacciones huésped parásito. En primer lugar, se describe un método sencillo para el etiquetado y seguimiento EV internalización por las células endoteliales, usando un tinte de vinculador de celda verde. En segundo lugar, se presenta una forma sencilla de medir permeabilidad en una monocapa de células endoteliales mediante el uso de un fluorescente etiquetado dextrano. Por último, os mostramos cómo investigar el papel de pequeñas moléculas de ARN no codificante en función de la célula endotelial.

Aquí, describimos protocolos para investigar las interacciones de EVs con las células del huésped. La absorción de la fluorescencia etiquetadas EVs es supervisada por microscopía confocal (figura 1). Las células endoteliales toman eficientemente EVs, sin embargo el tiempo de incubación con EVs puede optimizarse para el seguimiento de la absorción. Para una mejor localización de los vehículos eléctricos dentro de las células, mancha de actina con phalloidin. A...

En este trabajo, describimos protocolos para investigar el papel de las vesículas extracelulares (EVs) liberado por los eritrocitos Plasmodium falciparum infectados. En particular, nos centramos en las interacciones de EVs con las células endoteliales.

Evaluación de la función de la vesícula extracelular durante la infección de la Malaria

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

El objetivo general de este procedimiento es investigar la función de las vesículas extracelulares liberadas por los glóbulos rojos infectados con el parásito de la malaria. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la malaria, como la forma en que los parásitos regulan la comunicación parásito-huésped. La principal ventaja de esta técnica es la visualización del arbitraje vesicular por células indoterot bajo el estudio de la función reguladora del ARN vesicular por células indoteroid.Los que demuestren el procedimiento serán Mya Alondez, Smartin Bagu y Bayo Babatunde, todos estudiantes graduados de mi laboratorio. En un tubo de microcentrífuga añadir 100 microgramos de vesículas extracelulares y un mililitro de solución salina tamponada con fosfato. A continuación, centrifugar las vesículas extracelulares a una velocidad máxima de 20.000 veces g durante siete minutos para formar una pastilla.Una vez finalizada la centrifugación, deseche el sobrenadante sin alterar el pellet. A continuación, disuelva el pellet de vesícula extracelular en 100 microlitros de dilumato, C.To asegurar una mezcla completa, pipetearlo varias veces. A continuación, en un nuevo tubo de microcentrífuga, agregue cuatro microlitros de la solución de colorante etanólico PKH67 a 100 microlitros de dilmant C. Luego vórtee bien la mezcla.Prepare la solución de tinte 2XPKH67 de 40 micromolares justo antes del proceso de tinción. A continuación, combine rápidamente 100 microlitros de dos suspensiones vesiculares extracelulares con el mismo volumen de la solución de colorante etanólico PKH67. A continuación, pipetea la mezcla 10 veces para asegurar una mezcla adecuada.Después de completar la mezcla, incube la solución de colorante vesicular extracelular y etanólico PKH67 durante cinco minutos lejos de la luz. En el curso de la incubación, siga agitando la mezcla en vórtice tres o cuatro veces. Para detener la reacción de tinción, agregue 200 microlitros de suero a la mezcla e incube durante un minuto para que se adhiera el exceso de tinte.A continuación, lavar las vesículas extracelulares con solución salina tamponada con fosfato tres veces. Después del lavado, centrifugar la muestra a 20.000 veces g durante cinco minutos. A continuación, disuelva el pellet vesicular extracelular en 100 microlitros de solución salina tamponada con fosfato para alcanzar una concentración final de un microgramo por microlitro.Transfiera las células endoteliales en un mililitro de medio de crecimiento completo de células endoteliales a un cubreobjetos recubierto de poli-eliteno. Permita que las células desarrollen una monocapa en el cubreobjetos. Después de formar la monocapa, retire el medio con cuidado y agregue un mililitro de medio fresco para lavar las celdas dos veces.A continuación, añada 50 microgramos de vesículas extracelulares teñidas con PKH67 al cubreobjetos e incube durante cuatro horas. Después de la incubación, aspire el medio. Para eliminar todas las vesículas extracelulares no unidas, lave las células con solución salina tamponada con fosfato tres veces.Se debe tener mucho cuidado durante la manipulación de las tinciones de los cubreobjetos mediante el uso de pinzas finas para evitar la pérdida de células y la rotura del cubreobjetos. Después del lavado, use un tres por ciento de solución de paraformaldehído en solución salina tamponada con fosfato para fijar las células durante 15 minutos. Nuevamente, lave las células con solución salina tamponada con fosfato tres veces y agregue 250 microlitros de tritán al 0,1 por ciento x 100 en solución salina tamponada con fosfato para permeabilizar las células e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.A continuación, lave las células con solución salina tamponada con fosfato tres veces y agregue 400 microlitros de tampón bloqueante a las celdas. A continuación, incubar las células a temperatura ambiente durante treinta minutos para evitar la unión inespecífica. Después del bloqueo, lave las células una vez con solución salina tamponada con fosfato.A continuación, diluya cinco microlitros de solución madre de faloidal en 200 microlitros de solución salina tamponada con fosfato con albúmina sérica bovina al uno por ciento para preparar la solución de tinción para cada cubreobjetos. A continuación, añada 200 microlitros de la solución de tinción en el cubreobjetos e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos. Una vez finalizada la incubación, lavar las células con solución salina tamponada con fosfato tres veces.A continuación, utilice la concentración final de dos microgramos por mililitro de 3342 enganchado en 200 microlitros de solución salina tamponada con fosfato para contrarrestar la tinción del ADN durante 30 segundos. Después de teñir, agregue 400 microlitros de solución salina tamponada con fosfato para lavar el cubreobjetos dos veces. A continuación, levante con cuidado el cubreobjetos con la ayuda de unas pinzas e inviértalo en la parte superior de una gota de papel de montaje antidecoloración en un portaobjetos de cristal.Use un pañuelo de papel para eliminar suavemente el exceso de medios y luego selle el entorno con esmalte de uñas. También se debe tener mucho cuidado de no exponer las células a una cantidad excesiva de tinte durante la microscopía para evitar el blanqueamiento celular. En un inserto de cultivo de tejido de 24 pocillos con un tamaño de vertido de 0,4 micromolares, siembra células endoteliales.A continuación, deje que las células crezcan en el cultivo durante cinco días sin ser perturbadas para formar una monocapa diferenciada. Siga cambiando el medio cada dos días. Una vez que se haya formado la monocapa, siembre 50 microgramos en un mililitro de vesículas extracelulares en la cámara superior.Luego agregue 20 miligramos por mililitro de rotomina dextrano al pozo superior e incube a 37 grados centígrados con cinco por ciento de dióxido de carbono. Monitoree la migración del dextrano fluorescente al fondo del pozo midiendo la misión de fluorescencia de 40 microlitros de medio avocuto. A continuación, programe la longitud de onda de excitación a 544 nanómetros y la longitud de onda de emisión a 590 nanómetros para un lector de microplacas multietiqueta.Use un hemocitómetro para contar el número de células. A continuación, vuelva a suspender las células endoteliales en un medio de cultivo endotelial completo y siembre las células en una placa de 96 pocillos en 100 microlitros de medio de crecimiento de células endoteliales. Para lograr una concentración de 0,1 a diez microgramos por mililitro, agregue 100 microlitros de medio que contenga antibiótico.Monitoree la viabilidad de las células cada dos días usando un objetivo de 20 veces bajo microscopio óptico. Continúe cultivando las células durante otros 10 a 14 días y reemplace el medio que contiene antibiótico cada dos o tres días, dependiendo del crecimiento celular. A continuación, agregue 10 microlitros de reactivo MTS en cada pocillo y mezcle el reactivo.Incube la placa de 96 pocillos a 37 grados centígrados durante cuatro horas. Después de cuatro horas, agite brevemente el plato en una coctelera. A continuación, lea los absorbentes de las células tratadas y no tratadas utilizando un lector de placas a 490 nanómetros.Un día antes de la transducción lentiviral, siembra las células endoteliales en un mililitro de medio completo. Espere hasta que las células alcancen el 50 al 80 por ciento de confluencia para la transducción lentiviral Antes de abrir el tubo, centrifugue la suspensión lentiviral a 200 veces g durante 30 segundos para evitar que se derrame. A continuación, añada bromuro de hexidimetrina a las células para ajustarlas a una concentración final de ocho microgramos por mililitro y agite suavemente la placa.Agregue el lentivirus a las células y nuevamente agite la placa suavemente durante 30 segundos para asegurar una mezcla adecuada. Para aumentar la eficiencia de la transducción lentiviral, centrifugue la mezcla célula y viral a 300 veces g durante 45 minutos a temperatura ambiente. A continuación, incubar la mezcla célula y viral a 37 grados centígrados durante la noche.Al día siguiente, deseche el medio que contiene partículas virales y reemplácelo con un medio de cultivo precalentado, fresco y completo. El segundo día, comience la selección de puromicina. Reemplace el medio de cultivo completo con un medio que contenga puromicina.Después de la selección de puromicina, coseche las células. Siguiendo las instrucciones del fabricante, aísle el ARN de las células utilizando un kit de aislamiento de ARN. Utilice un kit de transcripción inversa para aislar el ADN complementario con los micro-ARN seleccionados.A continuación, configure la reacción cuantitativa de PCR. Para monitorizar la internalización de las vesículas extracelulares por las células endoteliales, se analizaron vesículas verdes marcadas con PKH67 mediante microscopía confocal. En el ensayo, se utilizan faloudina y hookst 33342, cuyas tinciones actúan en rojo y azul de nucleidos, respectivamente, para rastrear la translocación de las vesículas dentro de las células endoteliales.Las imágenes confocales obtenidas muestran la absorción inmediata de las vesículas por parte de las células endoteliales después de cuatro horas. A continuación, se analizó la permeabilidad de la capacidad de difusión monocapa de las células endoteliales de rodamina b isotiosionadextran. Este ensayo muestra que la incubación de las células endoteliales con 50 y 100 microgramos por mililitro de vesículas extracelulares aumentó la permeabilidad endotelial de la monocapa después de dos horas.En el gráfico, el eje x representa la concentración de las vesículas extracelulares y el eje y representa los cambios de pliegue en la permeabilidad endotelial leída a 590 nanómetros. A continuación, para determinar la sensibilidad de las células endoteliales con el tratamiento con puromicina, se trazó una curva de muerte. La curva de muerte muestra que tan solo 0,15 microgramos por mililitro de puromicina es suficiente para matar todas las células.Además, para determinar el nivel de expresión del micro-RNA451a aislado de las células endoteliales, se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real. Los diagramas de barras muestran una sobreexpresión significativa de la transcripción del micro-RNA451a contra el gen U6 del ama de llaves. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las enfermedades infecciosas exploraran el papel de las Evs en la interacción con el huésped y la comunicación celular a través de la transferencia de material genético. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar la absorción de EV por parte de las células receptoras y cómo investigar la función pequeña, incluida la del ARN, en la regulación de las células endoteliales.No olvide que trabajar con los parásitos de la malaria y la sangre humana puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como usar guantes, batas de laboratorio y trabajar bajo una capucha estéril mientras se realiza este procedimiento.

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Research

Investigación

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Métodos para investigar el papel de Regulación de pequeños ARN ribosomal y ocupación de<em&gt; Plasmodium falciparum</em

Describimos aquí un protocolo para aislar células mieloides de la piel del ratón y drenar el ganglio linfático después de la inyección intradérmica de esporozoítos de Plasmodium. La citometría de flujo de las células recolectadas proporciona un ensayo confiable para caracterizar la respuesta inflamatoria de la piel y los ganglios linfáticos de drenaje al parásito.

El aislamiento de las células mieloides de ratón de la piel y el drenaje de ganglios linfáticos Siguiendo intradérmica La inmunización con viva atenuada<em&gt; Plasmodium</emLos esporozoitos&gt;

El objetivo general de este protocolo es proporcionar instrucciones sobre cómo medir la capacidad de los anticuerpos presentes en los sueros o plasma de individuos, expuestos naturalmente a la infección por Plasmodium falciparum, para opsonizar e inducir la fagocitosis de los eritrocitos infectados por parásitos (IE).

Medición de anticuerpos que inducen la fagocitosis adquirida naturalmente a los parásitos plasmodium falciparum mediante un ensayo basado en citometría de flujo

Aquí describimos un nuevo método para ayudar a dilucidar los mecanismos de inmunidad celular a Plasmodium durante la etapa sanguínea de la infección. Este es un ensayo in vitro que mide la destrucción de glóbulos rojos infectados por linfocitos citotóxicos.

In vitro Ensayo de destrucción de glóbulos rojos infectados con plasmodio por linfocitos citotóxicos

Aprende a evaluar la función de vesículas extracelulares durante la infección de malaria usando Plasmodium falciparum. Este método permite visualizar la internalización por células endoteliales y estudiar el ARN vesicular.

Evaluación de la función de la vesícula extracelular durante la infección de la Malaria

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