Evaluación de la función de la vesícula extracelular durante la infección de la Malaria

En este trabajo, describimos protocolos para investigar el papel de las vesículas extracelulares (EVs) liberado por los eritrocitos Plasmodium falciparum infectados. En particular, nos centramos en las interacciones de EVs con las células endoteliales.

El objetivo general de este procedimiento es investigar la función de las vesículas extracelulares liberadas por los glóbulos rojos infectados con el parásito de la malaria. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la malaria, como la forma en que los parásitos regulan la comunicación parásito-huésped. La principal ventaja de esta técnica es la visualización del arbitraje vesicular por células indoterot bajo el estudio de la función reguladora del ARN vesicular por células indoteroid.

Los que demuestren el procedimiento serán Mya Alondez, Smartin Bagu y Bayo Babatunde, todos estudiantes graduados de mi laboratorio. En un tubo de microcentrífuga añadir 100 microgramos de vesículas extracelulares y un mililitro de solución salina tamponada con fosfato. A continuación, centrifugar las vesículas extracelulares a una velocidad máxima de 20.000 veces g durante siete minutos para formar una pastilla.

Una vez finalizada la centrifugación, deseche el sobrenadante sin alterar el pellet. A continuación, disuelva el pellet de vesícula extracelular en 100 microlitros de dilumato, C.To asegurar una mezcla completa, pipetearlo varias veces. A continuación, en un nuevo tubo de microcentrífuga, agregue cuatro microlitros de la solución de colorante etanólico PKH67 a 100 microlitros de dilmant C. Luego vórtee bien la mezcla.

Prepare la solución de tinte 2XPKH67 de 40 micromolares justo antes del proceso de tinción. A continuación, combine rápidamente 100 microlitros de dos suspensiones vesiculares extracelulares con el mismo volumen de la solución de colorante etanólico PKH67. A continuación, pipetea la mezcla 10 veces para asegurar una mezcla adecuada.

Después de completar la mezcla, incube la solución de colorante vesicular extracelular y etanólico PKH67 durante cinco minutos lejos de la luz. En el curso de la incubación, siga agitando la mezcla en vórtice tres o cuatro veces. Para detener la reacción de tinción, agregue 200 microlitros de suero a la mezcla e incube durante un minuto para que se adhiera el exceso de tinte.

A continuación, lavar las vesículas extracelulares con solución salina tamponada con fosfato tres veces. Después del lavado, centrifugar la muestra a 20.000 veces g durante cinco minutos. A continuación, disuelva el pellet vesicular extracelular en 100 microlitros de solución salina tamponada con fosfato para alcanzar una concentración final de un microgramo por microlitro.

Transfiera las células endoteliales en un mililitro de medio de crecimiento completo de células endoteliales a un cubreobjetos recubierto de poli-eliteno. Permita que las células desarrollen una monocapa en el cubreobjetos. Después de formar la monocapa, retire el medio con cuidado y agregue un mililitro de medio fresco para lavar las celdas dos veces.

A continuación, añada 50 microgramos de vesículas extracelulares teñidas con PKH67 al cubreobjetos e incube durante cuatro horas. Después de la incubación, aspire el medio. Para eliminar todas las vesículas extracelulares no unidas, lave las células con solución salina tamponada con fosfato tres veces.

Se debe tener mucho cuidado durante la manipulación de las tinciones de los cubreobjetos mediante el uso de pinzas finas para evitar la pérdida de células y la rotura del cubreobjetos. Después del lavado, use un tres por ciento de solución de paraformaldehído en solución salina tamponada con fosfato para fijar las células durante 15 minutos. Nuevamente, lave las células con solución salina tamponada con fosfato tres veces y agregue 250 microlitros de tritán al 0,1 por ciento x 100 en solución salina tamponada con fosfato para permeabilizar las células e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos.

A continuación, lave las células con solución salina tamponada con fosfato tres veces y agregue 400 microlitros de tampón bloqueante a las celdas. A continuación, incubar las células a temperatura ambiente durante treinta minutos para evitar la unión inespecífica. Después del bloqueo, lave las células una vez con solución salina tamponada con fosfato.

A continuación, diluya cinco microlitros de solución madre de faloidal en 200 microlitros de solución salina tamponada con fosfato con albúmina sérica bovina al uno por ciento para preparar la solución de tinción para cada cubreobjetos. A continuación, añada 200 microlitros de la solución de tinción en el cubreobjetos e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos. Una vez finalizada la incubación, lavar las células con solución salina tamponada con fosfato tres veces.

A continuación, utilice la concentración final de dos microgramos por mililitro de 3342 enganchado en 200 microlitros de solución salina tamponada con fosfato para contrarrestar la tinción del ADN durante 30 segundos. Después de teñir, agregue 400 microlitros de solución salina tamponada con fosfato para lavar el cubreobjetos dos veces. A continuación, levante con cuidado el cubreobjetos con la ayuda de unas pinzas e inviértalo en la parte superior de una gota de papel de montaje antidecoloración en un portaobjetos de cristal.

Use un pañuelo de papel para eliminar suavemente el exceso de medios y luego selle el entorno con esmalte de uñas. También se debe tener mucho cuidado de no exponer las células a una cantidad excesiva de tinte durante la microscopía para evitar el blanqueamiento celular. En un inserto de cultivo de tejido de 24 pocillos con un tamaño de vertido de 0,4 micromolares, siembra células endoteliales.

A continuación, deje que las células crezcan en el cultivo durante cinco días sin ser perturbadas para formar una monocapa diferenciada. Siga cambiando el medio cada dos días. Una vez que se haya formado la monocapa, siembre 50 microgramos en un mililitro de vesículas extracelulares en la cámara superior.

Luego agregue 20 miligramos por mililitro de rotomina dextrano al pozo superior e incube a 37 grados centígrados con cinco por ciento de dióxido de carbono. Monitoree la migración del dextrano fluorescente al fondo del pozo midiendo la misión de fluorescencia de 40 microlitros de medio avocuto. A continuación, programe la longitud de onda de excitación a 544 nanómetros y la longitud de onda de emisión a 590 nanómetros para un lector de microplacas multietiqueta.

Use un hemocitómetro para contar el número de células. A continuación, vuelva a suspender las células endoteliales en un medio de cultivo endotelial completo y siembre las células en una placa de 96 pocillos en 100 microlitros de medio de crecimiento de células endoteliales. Para lograr una concentración de 0,1 a diez microgramos por mililitro, agregue 100 microlitros de medio que contenga antibiótico.

Monitoree la viabilidad de las células cada dos días usando un objetivo de 20 veces bajo microscopio óptico. Continúe cultivando las células durante otros 10 a 14 días y reemplace el medio que contiene antibiótico cada dos o tres días, dependiendo del crecimiento celular. A continuación, agregue 10 microlitros de reactivo MTS en cada pocillo y mezcle el reactivo.

Incube la placa de 96 pocillos a 37 grados centígrados durante cuatro horas. Después de cuatro horas, agite brevemente el plato en una coctelera. A continuación, lea los absorbentes de las células tratadas y no tratadas utilizando un lector de placas a 490 nanómetros.

Un día antes de la transducción lentiviral, siembra las células endoteliales en un mililitro de medio completo. Espere hasta que las células alcancen el 50 al 80 por ciento de confluencia para la transducción lentiviral Antes de abrir el tubo, centrifugue la suspensión lentiviral a 200 veces g durante 30 segundos para evitar que se derrame. A continuación, añada bromuro de hexidimetrina a las células para ajustarlas a una concentración final de ocho microgramos por mililitro y agite suavemente la placa.

Agregue el lentivirus a las células y nuevamente agite la placa suavemente durante 30 segundos para asegurar una mezcla adecuada. Para aumentar la eficiencia de la transducción lentiviral, centrifugue la mezcla célula y viral a 300 veces g durante 45 minutos a temperatura ambiente. A continuación, incubar la mezcla célula y viral a 37 grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, deseche el medio que contiene partículas virales y reemplácelo con un medio de cultivo precalentado, fresco y completo. El segundo día, comience la selección de puromicina. Reemplace el medio de cultivo completo con un medio que contenga puromicina.

Después de la selección de puromicina, coseche las células. Siguiendo las instrucciones del fabricante, aísle el ARN de las células utilizando un kit de aislamiento de ARN. Utilice un kit de transcripción inversa para aislar el ADN complementario con los micro-ARN seleccionados.

A continuación, configure la reacción cuantitativa de PCR. Para monitorizar la internalización de las vesículas extracelulares por las células endoteliales, se analizaron vesículas verdes marcadas con PKH67 mediante microscopía confocal. En el ensayo, se utilizan faloudina y hookst 33342, cuyas tinciones actúan en rojo y azul de nucleidos, respectivamente, para rastrear la translocación de las vesículas dentro de las células endoteliales.

Las imágenes confocales obtenidas muestran la absorción inmediata de las vesículas por parte de las células endoteliales después de cuatro horas. A continuación, se analizó la permeabilidad de la capacidad de difusión monocapa de las células endoteliales de rodamina b isotiosionadextran. Este ensayo muestra que la incubación de las células endoteliales con 50 y 100 microgramos por mililitro de vesículas extracelulares aumentó la permeabilidad endotelial de la monocapa después de dos horas.

En el gráfico, el eje x representa la concentración de las vesículas extracelulares y el eje y representa los cambios de pliegue en la permeabilidad endotelial leída a 590 nanómetros. A continuación, para determinar la sensibilidad de las células endoteliales con el tratamiento con puromicina, se trazó una curva de muerte. La curva de muerte muestra que tan solo 0,15 microgramos por mililitro de puromicina es suficiente para matar todas las células.

Además, para determinar el nivel de expresión del micro-RNA451a aislado de las células endoteliales, se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real. Los diagramas de barras muestran una sobreexpresión significativa de la transcripción del micro-RNA451a contra el gen U6 del ama de llaves. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las enfermedades infecciosas exploraran el papel de las Evs en la interacción con el huésped y la comunicación celular a través de la transferencia de material genético. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar la absorción de EV por parte de las células receptoras y cómo investigar la función pequeña, incluida la del ARN, en la regulación de las células endoteliales.

No olvide que trabajar con los parásitos de la malaria y la sangre humana puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como usar guantes, batas de laboratorio y trabajar bajo una capucha estéril mientras se realiza este procedimiento.