Name: Recuperación de fluorescencia cigóticos después del blanqueamiento foto análisis de cromatina holgura que permite el desarrollo del Full-term (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprende el método zFRAP para evaluar la holgura de la cromatina en cigotos sin dañar su viabilidad. Esta técnica permite el desarrollo a término y ayuda a estudiar el potencial embrionario en biología del desarrollo.

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Agradecemos a Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura y Kana Kishida para proporcionar comentarios críticos y soporte técnico. Este trabajo fue parcialmente financiado por el programa Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología para promover la reforma de las universidades nacionales a M.O.; la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (16H 02593), Asada Science Foundation y la Fundación de ciencia de Takeda a T.W. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito.

<ol><li>Burton, A., Torres-Padilla, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+and+development%3A+a+unique+heterochromatin+organization+in+the+preimplantation+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Funct+Genomics%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming and development: a unique heterochromatin organization in the preimplantation mouse embryo.</a> Brief Funct Genomics. 9, 444-454 (2010).</li>
<li>Okada, Y., Yamaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+modifications+and+reprogramming+in+paternal+pronucleus%3A+sperm%2C+preimplantation+embryo%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond.</a> Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).</li>
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<li>Meshorer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperdynamic+plasticity+of+chromatin+proteins+in+pluripotent+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Hyperdynamic plasticity of chromatin proteins in pluripotent embryonic stem cells.</a> Dev Cell. 10, 105-116 (2006).</li>
<li>Boskovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+chromatin+mobility+supports+totipotency+and+precedes+pluripotency+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Higher chromatin mobility supports totipotency and precedes pluripotency in vivo.</a> Genes Dev. 28, 1042-1047 (2014).</li>
<li>Yamagata, K., Ueda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live-cell+imaging+of+mammalian+preimplantation+development+and+derivation+process+of+pluripotent+stem+cells+from+the+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Long-term live-cell imaging of mammalian preimplantation development and derivation process of pluripotent stem cells from the embryos.</a> Dev Growth Differ. 55, 378-389 (2013).</li>
<li>Ooga, M., Wakayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+analysis+of+chromatin+looseness+in+mouse+zygotes+that+allows+full-term+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">FRAP analysis of chromatin looseness in mouse zygotes that allows full-term development.</a> PLoS One. 12, e0178255(2017).</li>
<li>Quinn, P., Begley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+human+seminal+plasma+and+mouse+accessory+gland+extracts+on+mouse+fertilization+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+journal+of+biological+sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of human seminal plasma and mouse accessory gland extracts on mouse fertilization in vitro.</a> Australian journal of biological sciences. 37, 147-152 (1984).</li>
<li>Chatot, C. L., Lewis, J. L., Torres, I., Ziomek, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+1-cell+embryos+from+different+strains+of+mice+in+CZB+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+reproduction%22%5BJournal%5D)">Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium.</a> Biology of reproduction. 42, 432-440 (1990).</li>
<li>Bae, J., Sung, B. H., Cho, I. H., Song, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F-actin-dependent+regulation+of+NESH+dynamics+in+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">F-actin-dependent regulation of NESH dynamics in rat hippocampal neurons.</a> PLoS One. 7, e34514(2012).</li>
<li>Dieteren, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+mitochondrial+translation+differently+affects+the+live+cell+dynamics+of+complex+I+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits.</a> Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).</li>
<li>Subramanian, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2A.Z+acidic+patch+couples+chromatin+dynamics+to+regulation+of+gene+expression+programs+during+ESC+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation.</a> PLoS Genet. 9, e1003725(2013).</li>
<li>Hayashi-Takanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+epigenetic+histone+modifications+in+single+cells+using+Fab-based+live+endogenous+modification+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling.</a> Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).</li>
<li>Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+and+retrospective+analysis+of+DNA+methylation+in+mouse+preimplantation+embryos+by+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging.</a> Dev Biol. 304, 409-419 (2007).</li>
<li>Puschendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRC1+and+Suv39h+specify+parental+asymmetry+at+constitutive+heterochromatin+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos.</a> Nat Genet. 40, 411-420 (2008).</li>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Según lo revelado en este estudio, el análisis de zFRAP no hace daño crítico al termino desarrollo, lo que sugiere que este método es una herramienta muy útil para mostrar la asociación entre eventos moleculares y el potencial del desarrollo embrionario. Durante la reprogramación, en la célula dos como estado de células madre embrionarias, por que el potencial diferencial de esas células llega a ser tan alto como la de embriones en estadío de dos células, flojedad de la cromatina cambia en eso comparable con la etapa de ...

Después de la fertilización, la estructura de la cromatina se altera la dinámica y estructura de la cromatina cigóticos es entonces finalmente establecido1,2. Durante este período, en pronúcleos paternos, la proteína dominante de la cromatina cambia de protamina en histonas. La cromatina resultante es muy diferente de la de espermatozoides y ovocitos femeninos en varios puntos (por ejemplo, composición variante de histonas, modificación de histonas). Por lo tanto, cromatina cigóticas formada cree que es importante para el posterior desarrollo embrionario. Sin embargo, a pesar de los esfuerzos para revelar los detalles de la estructura de la cromatina cigóticos durante largos períodos, nunca han sido los métodos para evaluar la calidad de cigotos o predecir su desarrollo de término de la etapa de una célula mediante el análisis de su estructura de la cromatina establecido.
En el estudio anterior, se descubre que los cigotos tienen una estructura de cromatina muy flojos3. Actualmente, se cree que un factor importante para la diferenciación celular potencial de células madre embrionarias (ES)4flojedad de cromatina o apertura. Células madre embrionarias no presentan homogeneidad en la naturaleza, pero son bastante heterogéneos; en las colonias de células ES, algunas transitoriamente adquieren un mayor potencial de diferenciación comparable a blastómeros de embriones en estadío de dos células. Durante esta transición en la célula dos como estado, flojedad de la cromatina en ES células cambios en lo que es comparable con la etapa de dos células de embriones5. Así, flojedad de cromatina parece ser importante para el potencial de diferenciación celular y es posible que abra ampliamente la cromatina en cigotos es útil para la evaluación del potencial de desarrollo cigóticos.
En proyección de imagen es una poderosa herramienta que permite para el análisis de eventos moleculares durante la ontogénesis, ya que este método permite el posterior desarrollo y desarrollo incluso termino6. Como uno de los métodos de proyección de imagen vivo, análisis FRAP se ha utilizado para examinar la holgura de la cromatina en embriones preimplantación y ES células3,4,5. Si flojedad de cromatina cigóticos puede analizarse sin un efecto perjudicial sobre el desarrollo del término por el FRAP análisis, puede ser una valiosa herramienta para la evaluación de la calidad de los embriones en la etapa de una célula. Sin embargo, no se han examinado los efectos sobre el desarrollo del término por este método experimental. Recientemente, se desarrolló un sistema experimental con FRAP para evaluar la flojedad de cromatina cigóticos. Porque esto era un nuevo sistema de observación de cigotos, se dice que como FRAP cigóticos (zFRAP). zFRAP no afectó críticamente el término desarrollo y ha sido divulgado a otra parte7. En este informe se describe el protocolo de este método experimental.

<table><tbody><tr><td>Microscopio de escaneo láser confocal</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td>FV1000 también se puede utilizar para el análisis FRAP (referencia #7)</td></tr><tr><td>Placa térmica</td><td>Tokai Hit</td><td>TP-110RH26</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Micro manupilador</td><td>Narishige</td><td>MMO-202ND</td><td></td></tr><tr><td>Pieze Micro Micromanipulador</td><td>Prime tech</td><td>PMAS-CT150</td><td></td></tr><tr><td>Plato de cultivo de 35 mm</td><td>Falcom</td><td>351008</td><td>35 x 100 mm; para FIV</td></tr><tr><td>Plato de cultivo de 60 mm</td><td>Falcom</td><td>351007</td><td>60 x 15 mm; para cultivo de embriones</td></tr><tr><td>plato de cultivo de 50 mm</td><td>Falcom</td><td>351006</td><td>estilo de 50 x 9 mm; para la manipulación en el escenario</td></tr><tr><td>Plato con fondo de vidrio de 50 mm</td><td>Matsunami</td><td>D910400</td><td>plato de 50 mm, 27 mm y tamaño del orificio; para análisis FRAP</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Espeialidad orgánica Productos químicos</td><td>625071</td><td>Para el análisis FRAP en los platos con fondo de vidrio</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma</td><td>M8410-1L</td><td>Para FIV y cultivo de embriones</td></tr><tr><td>capilar de vidrio</td><td>Drummond</td><td>1-000-1000</td><td>Para el manejo de cigotos de ratón</td></tr><tr><td>Vidrio de borosilicato</td><td>Prime tech</td><td>B100-75-10-PT</td><td>Para microinyección de ARNm Extractor de</td></tr><tr><td>micropipetas</td><td>Instrumento Sutter</td><td>P-97/FIV</td><td>Para la preparación de la inyección o la retención de la red (diámetro exterior: 80 y micro; m, diámetro interior: 10 y micro; m)&nbsp;</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>&nbsp; Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE MACHINE SP6 Kit</td><td>de transcripción Thermo Fisher scientific</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Kit de relaves Poly (A)</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>PVP solution 10% (PVP-HTF)</td><td>IrvineSceientific</td><td>99311</td><td>HEPES tamponado HTF que contiene 10% PVP</td></tr><tr><td>Sodium HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>pTOPO eGFP-H2B</td><td></td><td></td><td>Plásmido de plantilla para eGFP-H2B mRNA (referencia #6)</td></tr><tr><td>NorthernMax Gly Colorante de carga de muestras&nbsp;</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>AM8551</td><td>Para la electroforesis de ARNm transcrito in vitro</td></tr><tr><td>Fenol cloroformo isamil alcohol</td><td>nacalai tesque</td><td>25970-14</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>nacalai tesque</td><td>&nbsp; 08401-65</td><td></td></tr><tr><td>Not I</td><td>TOYOBO</td><td>NOT-111X</td><td></td></tr><tr><td>Ethachinmate</td><td>WAKO</td><td>318-01793</td><td></td></tr><tr><td>3664 Medidor de potencia Otical</td><td>Hioki</td><td>3664</td><td>&nbsp; Medidor de potencia para la potencia del láser</td></tr><tr><td>Microscopio Estereoscópico</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr></tbody></table>

recuperación de fluorescencia cigóticos después del blanqueamiento foto análisis de cromatina holgura que permite el desarrollo del full-term

Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development

En proyección de imagen es una poderosa herramienta que permite el análisis de los eventos moleculares durante la ontogénesis. Recientemente, flojedad de la cromatina o apertura ha demostrado para estar implicado en el potencial de diferenciación celular de células madre embrionarias pluripotenciales. Previamente se informó de que, en comparación con las células madre embrionarias, cigotos albergan una estructura de cromatina muy flojos, lo que sugiere su asociación con su totipotencia. Sin embargo, hasta ahora, no ha sido abordada si esta estructura de la cromatina abierta muy aflojado es importante para el potencial de desarrollo embrionario. En el presente estudio, para examinar esta hipótesis, se desarrolló un sistema experimental en que cigotos que fueron analizadas por fluorescencia recuperación después del blanqueamiento foto puede convertirse a término sin ningún daño significativo. Lo importante, este sistema experimental necesita solamente un calentador termo placa además de un láser confocal de barrido microscopio. Los resultados de este estudio sugieren que la recuperación de la fluorescencia después de blanqueo foto (FRAP) análisis puede utilizarse para investigar si los eventos moleculares en cromatina cigóticas son importantes para el desarrollo del término.

Análisis de zFRAP con eGFP-H2B
Correctamente producen mRNA codificación eGFP-H2B, que es visto como una banda cambiada de puesto había causada por poly un tizón (figura 2A), fue inyectado en el citoplasma de cigotos con un 2 º cuerpo polar en 1-3 h después de la inseminación (figura 2B). Ocho a 12 h después de la inseminación, cigotos con 2 pronúcleos mostrando la expresió...

Flojedad de cromatina parece estar involucrada en el desarrollo potencial de blastómeros. Sin embargo, no se sabe si flojedad de la cromatina puede utilizarse como un índice confiable para el potencial desarrollo de embriones. Aquí, se ha descrito un sistema experimental en el que pueden desarrollar cigotos evaluados flojedad de cromatina a término.

Recuperación de fluorescencia cigóticos después del blanqueamiento foto análisis de cromatina holgura que permite el desarrollo del Full-term

Live imaging is a powerful tool that allows for the analysis of molecular events during ontogenesis. Recently, chromatin looseness or openness has been ...

El objetivo general de este FRAP cigótico o zFRAP es examinar la asociación entre la laxitud de la cromatina cigótica y el potencial de desarrollo embrionario a término. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como el desarrollo embrionario. La principal ventaja de esta técnica es que permite que el cigoto analizado se desarrolle a término completo sin daños significativos.La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos del análisis zFRAP son difíciles de aprender porque la configuración de la condición experimental y el funcionamiento de este análisis son muy complejos. Después de preparar el ARN eGFP-H2B de acuerdo con el protocolo de texto, use agua sin nucleasas para diluirlo a 250 nanogramos por microlitro. En un plato de 60 milímetros, coloque dos o tres gotas de PVP-HTF, cinco o seis gotas de CZB tamponado con Hepes y ARNm de eGFP-H2B.Luego, usa aceite mineral para cubrir las gotas. Con un extractor de pipetas, tire del vidrio de borosilicato. Después de romper la punta, utilice una microforja para doblar la pipeta de vidrio a unos 30 grados.Antes de la microinyección, confirme que el calentador d

zygotic-fluorescence-recovery-after-photo-bleaching-analysis-for

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Se describen los métodos de photobleaching incluyendo recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) y la pérdida de fluorescencia en photobleaching (FLIP) para controlar la dinámica de la cromatina de proteínas en células madre embrionarias (ES) las células. Dinámica de la cromatina proteína, que es considerado como uno de los medios para estudiar la plasticidad de la cromatina, es mayor en las células pluripotentes.

Photobleaching ensayos (FRAP y FLIP) para medir la dinámica de la cromatina de proteínas en células vivas madre embrionarias

El cinetocoro es donde el SAC inicia su señal de control de la segregación mitótica de las cromátidas hermanas. Se describe un método para visualizar la contratación y la rotación de una de las kinetochore proteínas y su coordinación con el movimiento de los cromosomas...

El estudio de puesto de control mitótico, ilustrando comportamiento dinámico de proteínas cinetocoro y el movimiento de cromosomas en vivo<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones Sincitial

Los niveles de proteína en células y tejidos son a menudo estrechamente regulada por el equilibrio de la producción y eliminación de proteínas. Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP), la cinética de eliminación de proteínas pueden ser medidos experimentalmente in vivo.

Medición de la estabilidad de proteínas en la sala de embriones de pez cebra Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP)

Los mecanismos moleculares de la descondensación de la cromatina mitótica altamente compactada están mal definidos. Presentamos un ensayo libre de células basado en clústeres de cromatina mitótica aislados de células HeLa y extracto de huevo de Xenopus laevis que reconstituye fielmente el proceso de descondensación in vitro.

Una célula de ensayo libre para el Estudio de la cromatina descondensación en la final de la mitosis

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Aprende el método zFRAP para evaluar la holgura de la cromatina en cigotos sin dañar su viabilidad. Esta técnica permite el desarrollo a término y ayuda a estudiar el potencial embrionario en biología del desarrollo.

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