Name: Recuperación de fluorescencia cigóticos después del blanqueamiento foto análisis de cromatina holgura que permite el desarrollo del Full-term (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprende el método zFRAP para evaluar la holgura de la cromatina en cigotos sin dañar su viabilidad. Esta técnica permite el desarrollo a término y ayuda a estudiar el potencial embrionario en biología del desarrollo.

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Agradecemos a Satoshi Kishigami, Sayaka Wakayama, Hiroaki Nagatomo, Satoshi Kamimura y Kana Kishida para proporcionar comentarios críticos y soporte técnico. Este trabajo fue parcialmente financiado por el programa Ministerio de educación, cultura, deportes, ciencia y tecnología para promover la reforma de las universidades nacionales a M.O.; la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (16H 02593), Asada Science Foundation y la Fundación de ciencia de Takeda a T.W. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito.

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<li>Okada, Y., Yamaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+modifications+and+reprogramming+in+paternal+pronucleus%3A+sperm%2C+preimplantation+embryo%2C+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic modifications and reprogramming in paternal pronucleus: sperm, preimplantation embryo, and beyond.</a> Cell Mol Life Sci. 74, 1957-1967 (2017).</li>
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<li>Ooga, M., Wakayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+analysis+of+chromatin+looseness+in+mouse+zygotes+that+allows+full-term+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">FRAP analysis of chromatin looseness in mouse zygotes that allows full-term development.</a> PLoS One. 12, e0178255(2017).</li>
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<li>Dieteren, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+mitochondrial+translation+differently+affects+the+live+cell+dynamics+of+complex+I+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Defective mitochondrial translation differently affects the live cell dynamics of complex I subunits.</a> Biochim Biophys Acta. 1807, 1624-1633 (2011).</li>
<li>Subramanian, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2A.Z+acidic+patch+couples+chromatin+dynamics+to+regulation+of+gene+expression+programs+during+ESC+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">H2A.Z acidic patch couples chromatin dynamics to regulation of gene expression programs during ESC differentiation.</a> PLoS Genet. 9, e1003725(2013).</li>
<li>Hayashi-Takanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+epigenetic+histone+modifications+in+single+cells+using+Fab-based+live+endogenous+modification+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Tracking epigenetic histone modifications in single cells using Fab-based live endogenous modification labeling.</a> Nucleic Acids Res. 39, 6475-6488 (2011).</li>
<li>Yamazaki, T., Yamagata, K., Baba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+and+retrospective+analysis+of+DNA+methylation+in+mouse+preimplantation+embryos+by+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse and retrospective analysis of DNA methylation in mouse preimplantation embryos by live cell imaging.</a> Dev Biol. 304, 409-419 (2007).</li>
<li>Puschendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRC1+and+Suv39h+specify+parental+asymmetry+at+constitutive+heterochromatin+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">PRC1 and Suv39h specify parental asymmetry at constitutive heterochromatin in early mouse embryos.</a> Nat Genet. 40, 411-420 (2008).</li>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Según lo revelado en este estudio, el análisis de zFRAP no hace daño crítico al termino desarrollo, lo que sugiere que este método es una herramienta muy útil para mostrar la asociación entre eventos moleculares y el potencial del desarrollo embrionario. Durante la reprogramación, en la célula dos como estado de células madre embrionarias, por que el potencial diferencial de esas células llega a ser tan alto como la de embriones en estadío de dos células, flojedad de la cromatina cambia en eso comparable con la etapa de ...

Después de la fertilización, la estructura de la cromatina se altera la dinámica y estructura de la cromatina cigóticos es entonces finalmente establecido1,2. Durante este período, en pronúcleos paternos, la proteína dominante de la cromatina cambia de protamina en histonas. La cromatina resultante es muy diferente de la de espermatozoides y ovocitos femeninos en varios puntos (por ejemplo, composición variante de histonas, modificación de histonas). Por lo tanto, cromatina cigóticas formada cree que es importante para el posterior desarrollo embrionario. Sin embargo, a pesar de los esfuerzos para revelar los detalles de la estructura de la cromatina cigóticos durante largos períodos, nunca han sido los métodos para evaluar la calidad de cigotos o predecir su desarrollo de término de la etapa de una célula mediante el análisis de su estructura de la cromatina establecido.
En el estudio anterior, se descubre que los cigotos tienen una estructura de cromatina muy flojos3. Actualmente, se cree que un factor importante para la diferenciación celular potencial de células madre embrionarias (ES)4flojedad de cromatina o apertura. Células madre embrionarias no presentan homogeneidad en la naturaleza, pero son bastante heterogéneos; en las colonias de células ES, algunas transitoriamente adquieren un mayor potencial de diferenciación comparable a blastómeros de embriones en estadío de dos células. Durante esta transición en la célula dos como estado, flojedad de la cromatina en ES células cambios en lo que es comparable con la etapa de dos células de embriones5. Así, flojedad de cromatina parece ser importante para el potencial de diferenciación celular y es posible que abra ampliamente la cromatina en cigotos es útil para la evaluación del potencial de desarrollo cigóticos.
En proyección de imagen es una poderosa herramienta que permite para el análisis de eventos moleculares durante la ontogénesis, ya que este método permite el posterior desarrollo y desarrollo incluso termino6. Como uno de los métodos de proyección de imagen vivo, análisis FRAP se ha utilizado para examinar la holgura de la cromatina en embriones preimplantación y ES células3,4,5. Si flojedad de cromatina cigóticos puede analizarse sin un efecto perjudicial sobre el desarrollo del término por el FRAP análisis, puede ser una valiosa herramienta para la evaluación de la calidad de los embriones en la etapa de una célula. Sin embargo, no se han examinado los efectos sobre el desarrollo del término por este método experimental. Recientemente, se desarrolló un sistema experimental con FRAP para evaluar la flojedad de cromatina cigóticos. Porque esto era un nuevo sistema de observación de cigotos, se dice que como FRAP cigóticos (zFRAP). zFRAP no afectó críticamente el término desarrollo y ha sido divulgado a otra parte7. En este informe se describe el protocolo de este método experimental.

<table><tbody><tr><td>Microscopio de escaneo láser confocal</td><td>Olympus</td><td>FV1200</td><td>FV1000 también se puede utilizar para el análisis FRAP (referencia #7)</td></tr><tr><td>Placa térmica</td><td>Tokai Hit</td><td>TP-110RH26</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Micro manupilador</td><td>Narishige</td><td>MMO-202ND</td><td></td></tr><tr><td>Pieze Micro Micromanipulador</td><td>Prime tech</td><td>PMAS-CT150</td><td></td></tr><tr><td>Plato de cultivo de 35 mm</td><td>Falcom</td><td>351008</td><td>35 x 100 mm; para FIV</td></tr><tr><td>Plato de cultivo de 60 mm</td><td>Falcom</td><td>351007</td><td>60 x 15 mm; para cultivo de embriones</td></tr><tr><td>plato de cultivo de 50 mm</td><td>Falcom</td><td>351006</td><td>estilo de 50 x 9 mm; para la manipulación en el escenario</td></tr><tr><td>Plato con fondo de vidrio de 50 mm</td><td>Matsunami</td><td>D910400</td><td>plato de 50 mm, 27 mm y tamaño del orificio; para análisis FRAP</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Espeialidad orgánica Productos químicos</td><td>625071</td><td>Para el análisis FRAP en los platos con fondo de vidrio</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma</td><td>M8410-1L</td><td>Para FIV y cultivo de embriones</td></tr><tr><td>capilar de vidrio</td><td>Drummond</td><td>1-000-1000</td><td>Para el manejo de cigotos de ratón</td></tr><tr><td>Vidrio de borosilicato</td><td>Prime tech</td><td>B100-75-10-PT</td><td>Para microinyección de ARNm Extractor de</td></tr><tr><td>micropipetas</td><td>Instrumento Sutter</td><td>P-97/FIV</td><td>Para la preparación de la inyección o la retención de la red (diámetro exterior: 80 y micro; m, diámetro interior: 10 y micro; m)&nbsp;</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>&nbsp; Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE MACHINE SP6 Kit</td><td>de transcripción Thermo Fisher scientific</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Kit de relaves Poly (A)</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>PVP solution 10% (PVP-HTF)</td><td>IrvineSceientific</td><td>99311</td><td>HEPES tamponado HTF que contiene 10% PVP</td></tr><tr><td>Sodium HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>pTOPO eGFP-H2B</td><td></td><td></td><td>Plásmido de plantilla para eGFP-H2B mRNA (referencia #6)</td></tr><tr><td>NorthernMax Gly Colorante de carga de muestras&nbsp;</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>AM8551</td><td>Para la electroforesis de ARNm transcrito in vitro</td></tr><tr><td>Fenol cloroformo isamil alcohol</td><td>nacalai tesque</td><td>25970-14</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>nacalai tesque</td><td>&nbsp; 08401-65</td><td></td></tr><tr><td>Not I</td><td>TOYOBO</td><td>NOT-111X</td><td></td></tr><tr><td>Ethachinmate</td><td>WAKO</td><td>318-01793</td><td></td></tr><tr><td>3664 Medidor de potencia Otical</td><td>Hioki</td><td>3664</td><td>&nbsp; Medidor de potencia para la potencia del láser</td></tr><tr><td>Microscopio Estereoscópico</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td></td></tr></tbody></table>

recuperación de fluorescencia cigóticos después del blanqueamiento foto análisis de cromatina holgura que permite el desarrollo del full-term

Zygotic Fluorescence Recovery After Photo-bleaching Analysis for Chromatin Looseness That Allows Full-term Development

En proyección de imagen es una poderosa herramienta que permite el análisis de los eventos moleculares durante la ontogénesis. Recientemente, flojedad de la cromatina o apertura ha demostrado para estar implicado en el potencial de diferenciación celular de células madre embrionarias pluripotenciales. Previamente se informó de que, en comparación con las células madre embrionarias, cigotos albergan una estructura de cromatina muy flojos, lo que sugiere su asociación con su totipotencia. Sin embargo, hasta ahora, no ha sido abordada si esta estructura de la cromatina abierta muy aflojado es importante para el potencial de desarrollo embrionario. En el presente estudio, para examinar esta hipótesis, se desarrolló un sistema experimental en que cigotos que fueron analizadas por fluorescencia recuperación después del blanqueamiento foto puede convertirse a término sin ningún daño significativo. Lo importante, este sistema experimental necesita solamente un calentador termo placa además de un láser confocal de barrido microscopio. Los resultados de este estudio sugieren que la recuperación de la fluorescencia después de blanqueo foto (FRAP) análisis puede utilizarse para investigar si los eventos moleculares en cromatina cigóticas son importantes para el desarrollo del término.

Análisis de zFRAP con eGFP-H2B
Correctamente producen mRNA codificación eGFP-H2B, que es visto como una banda cambiada de puesto había causada por poly un tizón (figura 2A), fue inyectado en el citoplasma de cigotos con un 2 º cuerpo polar en 1-3 h después de la inseminación (figura 2B). Ocho a 12 h después de la inseminación, cigotos con 2 pronúcleos mostrando la expresió...

Flojedad de cromatina parece estar involucrada en el desarrollo potencial de blastómeros. Sin embargo, no se sabe si flojedad de la cromatina puede utilizarse como un índice confiable para el potencial desarrollo de embriones. Aquí, se ha descrito un sistema experimental en el que pueden desarrollar cigotos evaluados flojedad de cromatina a término.

Recuperación de fluorescencia cigóticos después del blanqueamiento foto análisis de cromatina holgura que permite el desarrollo del Full-term

Live imaging is a powerful tool that allows for the analysis of molecular events during ontogenesis. Recently, chromatin looseness or openness has been ...

El objetivo general de este FRAP cigótico o zFRAP es examinar la asociación entre la laxitud de la cromatina cigótica y el potencial de desarrollo embrionario a término. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, como el desarrollo embrionario. La principal ventaja de esta técnica es que permite que el cigoto analizado se desarrolle a término completo sin daños significativos.La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos del análisis zFRAP son difíciles de aprender porque la configuración de la condición experimental y el funcionamiento de este análisis son muy complejos. Después de preparar el ARN eGFP-H2B de acuerdo con el protocolo de texto, use agua sin nucleasas para diluirlo a 250 nanogramos por microlitro. En un plato de 60 milímetros, coloque dos o tres gotas de PVP-HTF, cinco o seis gotas de CZB tamponado con Hepes y ARNm de eGFP-H2B.Luego, usa aceite mineral para cubrir las gotas. Con un extractor de pipetas, tire del vidrio de borosilicato. Después de romper la punta, utilice una microforja para doblar la pipeta de vidrio a unos 30 grados.Antes de la microinyección, confirme que el calentador de placas en la etapa del micromanipulador esté apagado para evitar que maten los cigotos durante la inyección de ARNm. Luego, usando 10%PVP-HTF, lave y cubra el interior de las agujas de inyección. A continuación, desde las puntas, llene los capilares de vidrio con el ARNm diluido de eGFP-H2B.Recoja los cigotos fertilizados con un segundo cuerpo polar y transfiera de 20 a 25 de ellos a la cámara de la etapa del microscopio. A continuación, con una pipeta de sujeción, sujete el cigoto y rompa la zona pelúcida y la membrana citosólica con un accionamiento piezoeléctrico. Inyecte unos 10 picolitros de ARNm en el citoplasma de cada cigoto.Complete las inyecciones dentro de los 10 minutos para evitar daños causados por el cultivo de los cigotos fuera de la incubadora. 10 minutos después de la microinyección, lave los cigotos en al menos tres gotas de CZB y cultívelos a 38 grados Celsius hasta el análisis FRAP. Una hora antes del análisis zFRAP, encienda el láser y la placa calefactora conectada a la platina del microscopio confocal.Ajuste la temperatura a 38 grados centígrados. En un plato de 60 milímetros con fondo de vidrio, pipetee de seis a 10 microlitros de medio CZB tamponado con Hepes y cúbralo con aceite mineral. Luego, caliente el plato en el calentador hasta la recolección del cigoto.Para que sea fácil encontrar el cigoto con el microscopio confocal, es importante colocar las gotas en todo el centro del plato. De ocho a 12 horas después de la inseminación, recoja de cinco a 10 cigotos que expresen eGFP-H2B y transfiéralos a una gota de seis a 10 microlitros de medio CZB precalentado con tamponamiento Hepes. Para realizar un análisis cuantitativo preciso, es importante colocar el cigoto hacia el centro de las gotas de CZB tamponadas con Hepes.Configure las condiciones de blanqueo e imagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, en Configuración de adquisición, establezca la velocidad de escaneo en cuatro microsegundos por píxel y el tamaño en quinientos doce. Aumente el zoom digital a cinco, abra la Lista de tintes "y elija eGFP" Luego, establezca el tiempo de observación en un punto seis segundos y el número de imágenes en 12.A continuación, inicie el panel Configuración de estímulo y en Usar escáner "haga clic en Principal "Establezca la velocidad de escaneo en 10 microsegundos por píxel. Haga clic en Activación en serie"Establecer preactivación" en tres fotogramas y el tiempo de activación en cinco segundos. Luego, haga clic en Enfoque x2 "y haga clic en Detener"En el panel de configuración de estímulo, haga clic en Recortar rectángulo"Establezca el ROI en 40 por 40 píxeles.Haga clic en Tiempo" y XY" Luego, use un medidor de potencia óptica para acceder a la potencia del láser. Es importante tener las luces apagadas al medir el láser. Después de ajustar el medidor láser para configurar la potencia del láser de blanqueo e imagen, en la barra de herramientas, haga clic en En vivo y luego inicie el gráfico en vivo "Coloque el aceite en la lente del objetivo.Coloca la cámara en el escenario y luego encuentra los cigotos en las gotas. Después de encontrar cigotos, determine la posición del ROI haciendo clic en Enfoque x2 "Y luego, en la ventana Gráfico en vivo", ajuste el medidor de potencia de alta tensión para la intensidad de fluorescencia del canal eGFP a alrededor de 2, 000. Para iniciar el análisis zFRAP, haga clic en XY"Después del análisis FRAP, haga clic en Serie Hecho"Obtener los datos analizados de FRAP", luego haga clic en Guardar como"para guardar la imagen de vista 2D del archivo" como un archivo con nombre preferido.Utilice Copiar "ROI y Pegar" ROI para preparar una región de referencia y para el fondo respectivamente. A continuación, seleccione ROI, REF y BG, y luego en la ventana de imagen Vista 2D, haga clic en Análisis en serie"Obtener datos RoFRAP y luego en la ventana Gráfico en vivo" haga clic en el botón Guardar". Realizar cálculos de datos según el protocolo de texto.De ocho a 12 horas después de la inseminación, se recolectaron cigotos con dos pronucleai que mostraban la expresión de eGFP-H2B y se sometieron al análisis zFRAP. Después del blanqueo, la intensidad de la señal fluorescente de eGFP-H2B se recuperó ligeramente debido a la entrada de eGFP-H2B en el ROI desde el área no blanqueada en el nucleoplasma. Las curvas de recuperación revelan que los pronucleai masculinos se recuperaron más rápidamente y con más fracciones móviles que los pronucleai femeninos.Como se demuestra en estas imágenes y gráfico, después del análisis de zFRAP, los cigotos lavados y cultivados en medio CZB evolucionaron hasta la etapa de blastocisto sin daños significativos. Para analizar el desarrollo a término, los embriones en la etapa de dos células se transfirieron a los ovoductos de madres pseudo-embarazadas. Como se informa en esta tabla, la tasa de natalidad de los embriones analizados con zFRAP fue ligera, pero significativamente más baja que la de los embriones intactos, pero fue la misma que la de los pacientes sin zFRAP.Además, las crías derivadas de los cigotos analizados con zFRAP parecían sanas y completamente desarrolladas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe esperar a la otra expansión. Toda la objeción presupuestaria para evitar la deriva del enfoque.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo analizar la laxitud de la cromatina en los cigotos.

zygotic-fluorescence-recovery-after-photo-bleaching-analysis-for

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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Photobleaching ensayos (FRAP y FLIP) para medir la dinámica de la cromatina de proteínas en células vivas madre embrionarias

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Recuperación de fluorescencia cigóticos después del blanqueamiento foto análisis de cromatina holgura que permite el desarrollo del Full-term (Video) | JoVE Journal

Recuperación de fluorescencia cigóticos después del blanqueamiento foto análisis de cromatina holgura que permite el desarrollo del Full-term

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