Cristales de proteína creciente con distintas dimensiones usando automatizado de cristalización juntada con In Situ dispersión ligera dinámica

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la cristalización de proteínas, como el punto de tiempo de la nucleación, el mecanismo de crecimiento de los cristales o cómo preparar nano/microcristales, según lo investigado por el Centro de Imágenes Ultrarrápidas de Hamburgo. La principal ventaja de esta técnica es la monitorización de la evolución de la muestra en tiempo real, lo que permite la adquisición de información valiosa, como la distribución radial de las partículas en solución en diferentes etapas de cristalización. Aunque este método puede proporcionar información sobre la microcristalización de proteínas, también se puede utilizar para proteínas que se utilizan para la cristalografía clásica o para el crecimiento de grandes cristales de proteínas que se utilizarán para la difracción de neutrones.

La demostración visual de este método es importante, ya que muestra el principio de funcionamiento de un dispositivo de cristalización único. Para empezar, filtre 16 mililitros de solución de tartrato de sodio 1,2 molar y 16 mililitros de agua destilada, utilizando un filtro de jeringa estéril de 2 micras. Llene el precipitante y las botellas de agua con cinco mililitros de las soluciones filtradas.

A continuación, monte los frascos en los soportes de la bomba de la cámara experimental. En la ventana del software, configure los parámetros experimentales con una temperatura de 20 grados centígrados, una humedad relativa de 20 y agua como disolvente. Abra la puerta frontal de la cámara experimental y retire el portacubreobjetos.

Coloque un cubreobjetos limpio y siliconado en el soporte y vuelva a colocarlo en el dispositivo. Cierre la cámara experimental para asegurar las condiciones ambientales. Encienda Pump Zero, utilizando las características principales de la bomba que se encuentran en el protocolo de texto y cree un flujo de agua.

Ajuste el chorro de agua, apuntando la posición hacia el centro del cubreobjetos operando manualmente el tornillo de ajuste designado. Apague la bomba cero, luego encienda la bomba uno y cree un chorro de líquido, como antes. Ajuste la posición del flujo de la bomba uno hacia la posición fija para la bomba cero.

Después de apagar la Bomba Uno, reemplace el cubreobjetos usado por un cubreobjetos nuevo y limpio para el experimento de cristalización. Cree un nuevo archivo experimental utilizando el paquete de software. En el archivo experimental, ingrese la proteína como Taumatina, de Thaumatococcus daniellii; la concentración de proteína como 14 miligramos por mililitro, el precipitante como tartrato de sodio y la concentración de precipitante como 1,2 molar.

Después de cargar el nuevo archivo del experimento para activar esta información, marque la posición en la gota de proteína agregando una pequeña gota de agua, usando Pump Zero. Pulse el botón Tara' para poner a cero la microbalanza. Abra la tapa superior de la cámara experimental y pipetee 8 microlitros de solución de taumatina en el punto de referencia de agua.

Para registrar la nueva gota de taumatina, primero haga clic en el botón Nueva gota'para atribuir las condiciones iniciales del archivo experimental. A continuación, haga clic en el botón "Constante" para compensar la evaporación natural del agua de la gota. Utilice la cámara CCD para comprobar si Pump Zero está apuntando a la gota de proteína.

Vuelva a ajustar la posición de la bomba cero si el chorro de agua apunta hacia fuera de la gota. Encienda el láser DLS y coloque el rayo láser en la gota de proteína manualmente con los tornillos de ajuste. Introduzca los parámetros DLS con una duración de medición de 60 segundos, un tiempo de espera entre dos mediciones de 10 segundos y un número de mediciones de 300.

Haga clic en el botón Inicio' para iniciar las mediciones de DLS. Compruebe la calidad de la muestra seleccionando una de las representaciones gráficas DLS. Introduzca las condiciones para la etapa de evaporación en la tabla de programación, como se muestra en el protocolo de texto.

A continuación, active el paso de evaporación de la muestra haciendo clic en el botón Automatización. Haga clic en el botón Detener' cuando haya finalizado el paso de evaporación de la muestra. Active el botón constante para mantener constante el peso de la gota.

Esta característica compensará la eventualidad de la evaporación natural de la muestra y asegurará que no se puedan producir cambios en la concentración hasta que se tomen medidas adicionales. A continuación, introduzca las condiciones para el paso de adición de precipitante en la tabla de programación, tal como se indica en el protocolo de texto. Active el paso de adición de precipitante haciendo clic en el botón Automatización.

Para seguir la evolución de la gota de cristalización a lo largo del tiempo, compruebe la apariencia de los cristales de taumatina utilizando la cámara CCD. Compruebe la distribución del tamaño de partícula utilizando las representaciones gráficas DLS. Compruebe también la evolución del peso y los parámetros experimentales mediante la ventana de visualización.

Toda la información que se muestra en esta ventana se calcula y se muestra en tiempo real, en función de los cambios de peso durante la cristalización, que son registrados en línea por la balanza ultrasensible. Cubra un plato Terasaki estándar limpio agregando 3 mililitros de aceite de parafina al plato. Desembolse el aceite de parafina en los pocillos de la placa moviendo suavemente la placa en diferentes ángulos para que el aceite cubra los 72 pocillos.

Retire el exceso de aceite de parafina vertiendo cualquier aceite que flote en el plato. Haga clic en el botón Detener' para finalizar el experimento de cristalización. Extraiga con cuidado el portador de muestra que contiene la gota de cristalización.

Con el uso de una pipeta, coloque dos alocuotas de microlitros de la gota de cristalización en los pocillos de la placa Terasaki. Al recuperar la gota de cristalización en una placa bajo aceite, se puede verificar periódicamente la estabilidad de la muestra en el crecimiento de cristales con el uso de un microscopio u otras técnicas diolistas que funcionan con placas de Terasaki. Aquí se muestra una distribución de gráfico de radio que muestra el crecimiento del tamaño de partícula en la caída de proteína durante todo el proceso de cristalización, desde la proteína monomérica hasta la formación de núcleos, nanocristales y microcristales.

Aquí, los gráficos representan la evolución a lo largo del tiempo para el peso de la gota de proteína, junto con la concentración de proteína calculada y la concentración de precipitante. Aquí se muestra una fotografía grabada de microcristales de taumatina al final del experimento. La gota muestra una cantidad muy abundante de pequeños microcristales saturados en solución proteica.

Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en una hora y 30 minutos, si se hace correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante que ajuste el láser DLS en los sistemas de microdosificación en la gota de proteína. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manejar fácilmente este dispositivo de cristalización para cristalizar con éxito una muestra de proteína.

Este método es posible gracias a la dispersión dinámica de la luz in situ que se acopla directamente a la gota de cristalización. Esto nos permite monitorear todos los cambios en la distribución del radio y, por lo tanto, podemos identificar ciertos patrones de distribución para la cristalización o la precipitación de proteínas. Siguiendo este procedimiento, se pueden aplicar otros métodos como la criomicroscopía electrónica o la difracción de electrones para responder preguntas adicionales y verificar el estado cristalino de partículas de tamaño submicrométrico en solución.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la teoría de dos pasos de la nucleación, ya que los mapas DLS muestran un patrón claro de una distribución de doble tamaño de partículas en solución, que son anteriores al crecimiento de los cristales.