Un método sencillo y eficaz para la manipulación In Vivo de Gene cardiaco específico por inyección intramiocárdica en ratones

El objetivo general de este procedimiento es lograr la manipulación génica específica del corazón in vivo, mediante la inyección intramiocárdica de adenovirus en ratones adultos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación cardiovascular sobre los mecanismos moleculares y la alineación de las lesiones cardíacas, y la eficacia de la terapia génica. Las principales ventajas de esta técnica son que está libre de ventilación, que los ratones se recuperan rápidamente de la cirugía y que es reproducible y fácil de realizar.

Así que ahora, comencemos. El día del procedimiento, calentar la solución de vector de adenovirus purificada a 80 grados centígrados negativos, almacenarla en hielo. Cuando el adenovirus se haya descongelado, colóquese una mascarilla, una bata estéril y guantes estériles.

Y rocíe el tubo de adenovirus con etanol al 75%. Transfiera el virus a una campana de flujo laminar estéril y aspire 50 microlitros de la solución del virus en una jeringa Hamilton esterilizada de 50 microlitros. Coloque una aguja de calibre 30 en la jeringa.

Gire la jeringa a la posición vertical. Presione suavemente el émbolo, hasta que se vea una gota de solución en la punta de la aguja, para llenar la punta de la aguja con virus. Luego, aspire cuidadosamente otros 30 microlitros de solución de adenovirus en la jeringa y coloque la jeringa en hielo.

Para inyectar el adenovirus en el corazón de un ratón, confirme el nivel adecuado de sedación por la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie y aplique ungüento en los ojos del animal. Afeitar la parte superior del pecho y el abdomen del animal. Aplique la crema depilatoria disponible en el mercado sobre la piel expuesta.

Usar una gasa húmeda para eliminar la crema y el vello restante después de un minuto. Usando tres exfoliantes antisépticos a base de clorhexidina yodado, estéril la parte inferior izquierda del tórax. Luego, cubra al animal con un paño quirúrgico, con un agujero cortado sobre el área quirúrgica, y póngase un nuevo par de guantes estériles.

A continuación, utilizando técnica e instrumentos estériles, haga una incisión cutánea de 0,5 centímetros desde el xifoides hasta la axila, y utilice pinzas y un hemostático Micro Mosquito para diseccionar sin rodeos los músculos pectorales mayores y menores. Retraiga los músculos pectorales mayores y menores para exponer el espacio intercostal. Y use el hemostático Micro Mosquito para perforar y abrir el cuarto espacio intercostal.

Presione suavemente contra el lado derecho de la pared torácica con el dedo índice de la mano no dominante para mover el corazón hacia la incisión. A continuación, asegure cuidadosamente el corazón externalizado con el dedo índice y el pulgar de la misma mano, y utilice la mano dominante para inyectar 10 microlitros de solución de adenovirus en el miocardio de cada una de las paredes ventral, dorsal y lateral del ventrículo izquierdo. Después de la última inyección, regrese inmediatamente el corazón al espacio intratorácico.

Y presione suavemente la pared torácica hacia el sitio de la incisión, para evacuar manualmente el aire del espacio intratorácico. Cierre la piel con una sutura de seda de cinco ott, en un patrón de colchón horizontal, y coloque el mouse sobre una almohadilla térmica de 37 grados centígrados con monitoreo hasta la recuperación completa. Luego, esterilice la jeringa Hamilton usada y la aguja de calibre 30 en un esterilizador de alta temperatura y alta presión, y deseche la aguja esterilizada en un recipiente adecuado para objetos punzocortantes.

Cinco días después de la inyección intramiocárdica de adenovirus que encierra luciferasa, las imágenes in vivo indican una sobreexpresión robusta de luciferasa, específicamente en el corazón, que puede confirmarse mediante análisis de Western blot, lo que sugiere la ausencia de transducción de órganos no diana. El análisis de Western blot también indica un aumento significativo de la expresión del receptor de vitamina D. Y el ventrículo izquierdo de ratones inyectados con adenovirus que codifica el receptor de vitamina D.

Con una expresión reducida del receptor evidente en animales inyectados con adenovirus que codifica un alfiler de pelo corto dirigido al receptor de ARN de la vitamina D. Por el contrario, la expresión del receptor de vitamina D no se altera significativamente en los ventrículos derechos de ninguno de los animales inyectados con ventrículo izquierdo. Una vez dominado, este método se puede terminar en dos minutos, si se realiza correctamente.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la inyección de células cardíacas, para responder preguntas adicionales, como la eficacia de terapias celulares específicas en los infartos de miocardio.