Extracción de hemocitos de larvas de Drosophila melanogaster para infección microbiana y análisis

Esta técnica puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la infección celular y la microbiología, como la forma en que los hemocitos contribuyen a la respuesta inmunitaria general de las moscas de la fruta. La principal ventaja de esta técnica es que se puede realizar en el laboratorio, utilizando larvas previamente infectadas. Alternativamente, los hemocitos de larvas no infectadas se pueden utilizar para la infección ex vivo.

La demostración visual de este método es fundamental porque los pasos de la obtención de imágenes son difíciles de aprender debido a las complejidades del microscopio confocal y las opciones para la reconstrucción de modelos 3D. Para comenzar el protocolo, coloque dos o tres piezas de película de parafina de diez centímetros por diez centímetros bajo un microscopio estereoscópico. A continuación, prepare el capilar de vidrio ajustando el calentador polar capilar al 55% del máximo.

Coloque el tubo capilar en un punto afilado de aproximadamente diez micrómetros. Rellene el capilar con aceite mineral. Ensamble el tubo capilar lleno en el nanoinyector.

Y abra la punta del tubo capilar fusionado rompiendo la punta con pinzas. Expulse la mayor cantidad de aceite posible de la punta del tubo capilar y, a continuación, llene el tubo con medio aislante de hemocitos de Drosophila (DHIM). Para una fácil visualización del borde del aceite de hemolinfán, incluya una burbuja de aire entre el aceite y el DHIM.

Con pinzas, recoja suavemente diez larvas de drosophila de tercer estadio de la pared interior de los viales de alimentos y colóquelas en un colador de 100 micrómetros. Vierta cinco mililitros de agua estéril sobre las larvas y agite el colador durante cinco segundos. Coloque el colador en una toallita para eliminar el exceso de agua.

Transfiera las larvas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, anestesiándolas con gas CO2 durante cinco segundos. Luego, coloque las larvas en una película de parafina bajo el microscopio estereoscópico, con el lado dorsal hacia arriba. Coloque el capilar de vidrio ligeramente sobre el cuerpo posterior de la larva para mantenerlo en su lugar y abra la cutícula posterior con pinzas de punta fina.

Permita que la hemolinfa fluya sobre la película de parafina. Haga un grupo de hemolinfa, incluidos los hemocitos, de 20 a 50 larvas a la vez, en la película de parafina. Utilice el capilar de vidrio del nanoinyector para absorber la hemolinfa agrupada.

Expulse la hemolinfa en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga 500 microlitros de DHIM. Coloque la pasta de levadura en un plato de agar jugo de uva. Haz un corte fino en el agar donde las larvas puedan migrar para evitar que se sequen.

Ensamble una aguja de tungsteno puntiaguda de 0,001 milímetros con pinzas de sujeción con película de parafina. Pipetear 50 microlitros de C.Burnetii de alto título, que expresa mCherry, en la película de parafina bajo el microscopio estereoscópico y colocar las larvas en el charco de bacterias. Pincha las larvas con una aguja de tungsteno.

Transfiera las larvas a una placa de agar. Transfiera el medio patógeno restante a la placa de agar y selle la placa con una película de parafina. Mantenga las larvas en el plato en aire húmedo hasta el momento deseado después de la infección.

Deje las larvas infectadas con C. Burnetii en el plato durante 24 horas. Coloque un cubreobjetos redondo de 12 milímetros en un pocillo de una placa de 24 pocillos. Pipetear 500 microlitros de DHIM en el pocillo.

Extraiga y absorba la hemolinfa de las larvas previamente infectadas, luego expulse la hemolinfa al pozo. Centrifugar la placa a 1000 G durante cinco minutos. Configure el microscopio confocal para obtener imágenes de tres colores de DAPI, EGFP y mCherry.

Coloque la muestra en el microscopio y concéntrela con un objetivo de apertura numérica de 63x 1,4. Ubique los hemocitos deseados en el campo de visión para la obtención de imágenes. A continuación, ajuste la potencia del láser y las ganancias del detector para lograr la exposición adecuada de la muestra.

Compruebe varios planos Z para asegurarse de que el nivel de exposición es el adecuado para todo el grosor de la muestra. A continuación, encuentre la posición superior e inferior en el eje Z de un hemocito completo. Establezca estas posiciones como las posiciones inicial y final para la sección Z.

Utilice el zoom de escaneo para obtener una imagen del área que contiene el hemocito. Recopile la serie de imágenes con la resolución adecuada, como 1024 por 1024 píxeles en el plano X Y y un espaciado de 0,3 micrómetros en la dimensión Z. Importe el archivo de la serie de imágenes seccionadas Z en el software asociado con el microscopio confocal para la reconstrucción de modelos 3D.

Seleccione una colocalización celular de los núcleos teñidos con DAPI y C. Burnetii que expresa mCherry en un hemocitto que expresa EGFP. Recorte la serie de imágenes para que contenga solo una celda. Seleccione la opción de visor 3D, que reconstruye el modelo 3D utilizando el algoritmo preempaquetado del software.

Elija el tipo de imagen deseado para la representación 3D entre las opciones de mezcla, superficie y mezcla. En este método, los hemocitos, los núcleos y C. Burnetii se muestran utilizando modelos de superficie. Observe la celda reconstruida en 3D desde varias posiciones de visualización manteniendo pulsado el botón del ratón y arrastrando el cursor por la pantalla.

Ajuste la orientación y la posición de la celda de la fuente de luz modelada para optimizar la imagen. Por último, tome secciones transversales a través del modelo utilizando los comandos de recorte y sección para visualizar el contenido interior del hemocito. La visualización de los hemocitos vivos extraídos que expresan EGFP bajo el control del controlador de hemolectina a partir de múltiples imágenes muestra que la mayoría de las células DAPI positivas también son EGFP positivas.

Las secciones transversales de hemocitos infectados por Coxiella burnetii confirman la presencia de bacterias que expresan mCherry en el interior de la célula. Las imágenes se reconstruyeron en modelos 3D y observamos que los hemocitos infectados in vivo exhibían mayores extensiones citoplasmáticas y eran de naturaleza más plana. Mientras que los hemocitos infectados ex vivo eran más esféricos.

Las secciones transversales de cualquiera de los modelos confirman la presencia de Coxiella que expresa mCherry en el interior de la célula. Los hemocitos extraídos se infectaron con IIV6 y se aplicaron al análisis de PCR qRT, que mostró niveles significativamente más altos de la transcripción IIV6-193R entre las células simuladas e infectadas con IIV6. Al intentar este procedimiento, es importante recordar tener todos los medios preparados con anticipación y equilibrados a temperatura ambiente para que las células no se queden sin los nutrientes adecuados durante demasiado tiempo.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la búsqueda de ARN de una sola célula, para responder preguntas adicionales, como la respuesta general del huésped a la infección. Después de su desarrollo, esta técnica ayuda a los investigadores en inmunología y microbiología a explorar la invasión de patógenos y las respuestas del huésped en moscas de la fruta u otros animales con sistemas circulatorios abiertos.