Name: Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de modificaciones de las histonas de Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Aprende a realizar inmunoprecipitación de cromatina para analizar modificaciones de histonas en Saccharomyces cerevisiae. Este protocolo versátil permite estudiar la regulación de la expresión génica en levadura.

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Los autores desean agradecer a miembros del laboratorio verde para discusiones útiles. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de NIH R03AG052018 y R01GM124342 a E.M.G.

1. atar los anticuerpos bolas magnéticas
<ol>
	<li>Mezcla bien las bolas magnéticas de proteína A/G y transferir 20 μl de granos magnéticos por una inmunoprecipitación (IP) muestra a un tubo de 1,5 mL. Nota: Cuando el pipeteo granos, utilizar puntas de ancha, baja retención.</li>
	<li>Coloque el tubo con los granos en un soporte magnético y permitir cuentas recoger en el lado del tubo. Eliminar el sobrenadante.</li>
	<li>Lavar los granos 3 veces con 1 mL de solución salina fría tamponada con Tris (TBS) (50 mM Tris-HCl de pH 7.5, 150 mM NaCl).</li>
	<li>Añadir 200 μL de TBS para granos y la cantidad adecuada de anticuerpos. Gire a 8 rpm durante la noche a 4 ° C. Nota: Para muchos anticuerpos PTM de las histonas, 1-3 μg de anticuerpo por IP es suficiente. Sin embargo, experimentos de titulación se recomiendan determinar las concentraciones adecuadas. Concentraciones recomendadas para los anticuerpos del PTM histona bien caracterizado, comerciales a menudo son precisas y pueden encontrarse en los informes publicados o literatura del producto.</li>
	<li>Colocar los granos en un soporte magnético y eliminar el sobrenadante. Lave con 1 mL de TBS.</li>
	<li>Resuspender los granos en 20 μl de TBS por muestra IP además de 5 μl adicionales (en caso de error de pipeteo) de TBS. Nota: Los granos pueden almacenarse a corto plazo a 4 ° C hasta su uso.</li>
</ol>
2. cultivar las células de levadura
<ol>
	<li>Inocular 10 mL de YPD (Extracto de levadura 10%, 20% peptona y dextrosa 20%) con una sola Colonia de la cepa adecuada y cultivarlo a 30 ° C durante la noche en un incubador de agitación a 220 rpm.</li>
	<li>Medir la densidad óptica a 600 nm (OD600) de la cultura de la levadura utilizando un espectrofotómetro. Diluir la cultura a un OD600 = 0.2 en YPD en un nuevo frasco de 100 mL.</li>
	<li>Crecer las células en 30 ° C en un incubador de agitación en rpm 220 hasta llegar a fase media logarítmica (OD600 = 0.6-0.8).</li>
</ol>
3. en Vivo reticulación de las proteínas al ADN
<ol>
	<li>Cuando las culturas llegan a fase logarítmica media, añadir 2,7 mL de formaldehído al 37% directamente al medio, para una concentración final de 1% de formaldehído. Transferir el matraz a un agitador a 25 ° C (o temperatura ambiente) y agitar a 50 rpm por 15 minutos.</li>
	<li>Añadir 5 mL de 2,5 M glicina al medio y continúe la agitación a 50 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos calmar el formaldehído.</li>
	<li>Transferencia de las células para botellas de centrífuga y centrifugar las células a 5800 x g durante 5 min a 4 ° C. Decantar el sobrenadante.
	<ol>
		<li>Lavar las células a resuspender en 45 mL de TBS frío y transferir la suspensión a un tubo cónico de 50 mL. Girar el tubo a 2800 x g durante 3 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.</li>
		<li>Lavado de que las células en 10 mL de frío chIP tampón de lisis (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM ácido de etilendiaminotetracético (EDTA), 1% nonidet octil phenoxypolyethoxylethanol (NP-40), almacenado a 4 ° C).</li>
		<li>Girar las células a 2800 x g durante 3 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. Nota: Las células pueden ser congeladas con nitrógeno líquido y almacenadas a-80 ° C hasta el procesamiento posterior.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. hacer lisados de levadura
<ol>
	<li>Resuspender las células en 1 mL de tampón de lisis ChIP frío con fluoruro (PMSF) del phenylmethylsulfonyl de 1 mM y 1:1,000 dilución del inhibidor de proteasa de levadura cóctel. Transferir la suspensión a un tubo de tapón de rosca 2.0 mL que contiene 200 μL de perlas de vidrio.</li>
	<li>Transferir las células a una tira a aparatos para la agitación de alta velocidad a 4 ° C y grano supera 6 veces para 30 s cada uno. Mantener las células en hielo para por lo menos 1 minuto entre cada grano superando.</li>
	<li>Transferir el lisado a un tubo de 1,5 mL gel de puntas de carga. Centrifugue el lisado a 15.500 x g por 20 min a 4 ° C.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en 250 μl de tampón de digestión MNase (pH de 10 mM Tris-HCl 7.5, 10 mM de NaCl, 3 mM MgCl2, 21 m m CaCl2, 1% NP-40, almacenados a 4 ° C) transfiriendo suavemente hacia arriba y hacia abajo.</li>
	<li>Añadir 2,5 μl de MNase a las reacciones. Mezclar suavemente por inversión 4 - 6 veces e inmediatamente lo Incube en un baño de agua de 37 ° C por 20 min. Nota: Condiciones de digerir deben ser optimizadas cuando se utiliza un nuevo stock de MNase. Consulte el paso 10 del protocolo.</li>
	<li>Inmediatamente Coloque los tubos en hielo para detener la reacción y añadir 5 μl de EDTA de 0,5 M para una concentración final de 10 mM, EDTA. Mezclar suavemente por inversión.</li>
	<li>Centrífuga de la reacción a 15.500 x g durante 15 min a 4 ° C y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mL. Nota: Será Soluble cromatina (digerida) en el sobrenadante. El precipitado contiene restos celulares cualquier cosa sin digerir e insoluble.</li>
</ol>
5. Immunoprecipitate (IP) modifica las histonas
<ol>
	<li>Determinar la concentración de proteínas de cada fracción de la cromatina MNase lanzado usando un análisis de Bradford. Añadir 1 mL de reactivo de Bradford a cada uno de 8 cubetas desechables plus 1 cubeta adicional para cada muestra de la proteína a probar.
	<ol>
		<li>Prepare una solución de 2 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA).</li>
		<li>Añadir el volumen adecuado para conseguir las siguientes concentraciones de BSA en 1 mL de reactivo de Bradford: 0 μg/mL, 0.5 μg/mL, 1 μg/mL, 2 μg/mL, 4 μg/mL, 6 μg/mL, 8 μg/mL y 10 μg/mL. Añadir 2 μL de la fracción de la cromatina MNase lanzado a cubetas adicionales.</li>
		<li>Cubrir la parte superior de cada cubeta con un pequeño trozo de parafilm e invertir las cubetas de 4 a 6 veces para mezclar bien la solución. Incubar las cubetas a temperatura ambiente durante 15 minutos.</li>
		<li>Utilizando un espectrofotómetro de luz visible, medir la absorbancia a 595 nm para la curva estándar y las muestras experimentales. Nota: Utilice la cubeta sin BSA (0 μg/mL) y en blanco el espectrofotómetro antes de realizar la primera medición.</li>
		<li>Trazar una curva estándar utilizando los valores de absorbancia para las distintas concentraciones de BSA en software de hoja de cálculo o software asociado con el espectrofotómetro. Basado en la curva estándar y utilizadas el factor de dilución (1: 500), utilizar los valores de absorbancia para calcular la concentración de proteína de cada una de las muestras de la fracción de la cromatina.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Para cada IP, añadir 50 μg de proteínas totales de la fracción de la cromatina MNase lanzado a tampón de lisis de ChIP para llegar a un volumen final de 1 mL. Nota: Si configurar más de una IP por lisado, hacer una mezcla maestra de lisado y ChIP de tampón de lisis y alícuota 1 mL a tubos individuales para la IP.</li>
	<li>Saque 100 μl de la mezcla IP al proceso como la muestra de entrada. Congelar la entrada muestra a-20 ° C hasta el paso 7.1. Nota: Cualquier muestra restante de la cromatina puede congelarse a-20 ° C y utilizar una IP posterior si se desea.</li>
	<li>Añadir 20 μl de granos magnéticos de A/G de proteína previamente atado con anticuerpo para cada muestra IP.</li></ol>Girar la muestra a 8 rpm durante 3 h (estándar) o durante la noche (si se prefiere) a 4 ° C.

6. lavar las IPs y eluir complejos histona-ADN
<ol>
	<li>Colocar los tubos en un soporte magnético y dejar granos de recoger en el lado del tubo. Quite el sobrenadante con una pipeta. Lavar los granos con 1 mL de cada uno de los amortiguadores a continuación.
	<ol>
		<li>Realizar cada lavado girando a 8 rpm por 5 min a 4 ° C, colocar los granos en un soporte magnético, retirar el sobrenadante y añadir tampón próximo: x 2 - ChIP de tampón de lisis, 2 x - alta sal tampón de lavado (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA El 1% NP-40, almacenados a 4 ° C), 1 x - LiCl y detergente lavado Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, desoxicolato de sodio al 1%, almacenado a 4 ° C), 1 x - TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA, almacenado a 4 ° C) y 1 x - TE.</li>
		<li>Con el último lavado TE, transferencia de cuentas a un nuevo tubo con 0,5 mL de TE para transferir la mayor parte de los granos, luego otro 0,5 mL de TE Lave el tubo y transferir los granos restantes.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Añadir 250 μl de la fresca viruta tampón de elución (1% SDS, 1 mM NaHCO3). Vórtice la solución brevemente. Rotar las muestras a 8 rpm durante 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloque el tubo en un soporte magnético y recoger los granos. Cuidadosamente transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y evitar los granos. Nota: El efluente contiene immunoprecipitated proteínas y ADN asociado.</li>
	<li>Añadir otro 250 μl de tampón de elución de la viruta a los granos. Rotar las muestras a 8 rpm durante 15 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Cuidadosamente transfiera el sobrenadante a tubo que contiene la primera elución. Si es necesario, retire un volumen menor (240 μL) para que todas las IPs evitar molestar a los granos.</li>
</ol>
7. Invierta la proteína ADN reticulaciones
<ol>
	<li>Descongelar las muestras de entrada y añadir 400 μL de tampón de elución de ChIP a cada entrada.</li>
	<li>Entrada tanto muestras IP, añadir 20 μl de NaCl 5 M, 5 μl de glucógeno 20 mg/mL y μl 12.5 de 20 mg/mL de proteinasa K. mezcla bien invertir o agitando los tubos. Incubar las muestras en un baño de agua de 65 ° C durante la noche.</li>
</ol>
8. purificar y concentrar el ADN
<ol>
	<li>Añadir 10 μl de ARNasa A 10mg/mL a la entrada y las muestras de la IP. Incubar las muestras en un baño de agua de 37 ° C durante 30 minutos.</li>
	<li>Añadir 600 μl de fenol: chlorofrom:isoamyl alcohol (25:24:1 PCI) a la solución acuosa y mezclar bien. Los hace girar a 15.500 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
	<ol>
		<li>Retirar la capa acuosa a un tubo nuevo. Añadir 600 μl de PCI y mezclar bien. Girar el tubo a 15.500 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Transferir la capa acuosa a un tubo nuevo. PRECAUCIÓN: En la campana y usar equipo de protección personal al trabajar con PCI. Disponer residuos líquidos y sólidos por las directrices.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Agregar 0.1 volumen x de acetato de sodio de 3 M y 1 mL de etanol al 100% frío para precipitar el ADN. Invertir el tubo 4 - 6 veces para mezclar bien la solución. Incubar a-20 ° C durante la noche.
	<ol>
		<li>Girar el tubo a 15.500 x g por 20 min a 4 ° C. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta.</li>
		<li>Lavar el precipitado en 1 mL de etanol frío al 70%. Vuelta a 15.500 x g por 10 min a 4 ° C. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta.</li>
		<li>Secar el pellet en la campana por aproximadamente 20 min (hasta totalmente seco). Resuspender las muestras IP en 50 μl de agua libre de nucleasas y resuspender entradas muestras en 100 μl de agua libre de nucleasa. Almacenar las muestras de ADN a-20 ° C hasta realizar qPCR.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. cuantitativo PCR (qPCR) para detectar enriquecido regiones genómicas
<ol>
	<li>Hacer una mezcla maestra de qPCR para cada juego de iniciadores. Una reacción contiene 5 μl de la mezcla de x qPCR 2, 0.25 μl de cebador forward de 20 μm y 0.25 μl de cebador inverso de 20 μm. Nota: Primer apropiado diseño y pruebas para los experimentos de qPCR son describen en otros lugares14,15,16.</li>
	<li>Hacer mezclas principales de ADN para cada muestra de ADN. Una reacción contiene 0,5 μl de ADN y 4,0 μL de agua libre de nucleasa.</li>
	<li>Agregar 5.5 μl de la mezcla principal de imprimación adecuada y 4.5 μl de la mezcla principal de ADN apropiada a cada pocillo de una placa de 384 pozos qPCR. Nota: Comience con la adición de 5.5 μl de la mezcla de la cartilla a cada pocillo. Haga girar la placa a 200 x g durante 1 min a temperatura ambiente antes de agregar 4.5 μl de la mezcla de ADN.</li>
	<li>Adherir el sello de la placa y la vuelta a 200 x g durante 1 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Realizar qPCR utilizando un sistema qPCR en tiempo real con las siguientes condiciones: 95 ° C por 3 min; 40 ciclos de 95 ° C durante 10 s, 55 ° C por 30 s; curva fusión 65 º C a 95 ° C con incrementos de 0,5 ° C, 5 s.</li>
	<li>Para cada par de la cartilla, calcular la entrada por ciento de la muestra de la propiedad intelectual en relación con la muestra de entrada 5% usada en la qPCR. Utilizar los medios de las técnica PCR triplicados para realizar los cálculos. Nota: Si se observa una variación sustancial en el triplicado de la polimerización en cadena, es mejor repetir la qPCR con atención a la composición de la mezcla principal, pipeteo errores y contaminación cruzada entre pozos en la placa de 384 pozos.<ol>
		<li>Ajuste los valores de Cq para la entrada al 100% restando el número de ciclos que representan el factor de dilución de los valores crudos de Cq. Nota: La entrada de cinco por ciento representa un factor de dilución de 20-fold, que equivale a 4,32 ciclos (sesión2 20 = 4.32).</li>
		<li>Calcular el porcentaje de entrada como 2 ^ (Cqentrada - CqIP) multiplicado por 100.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. determinar las condiciones del MNase Digest (recomendado antes chIP completo primer experimento)
<ol>
	<li>Siga los pasos 2.1 por 4.4 del protocolo anterior. Ampliar el protocolo para generar suficiente lisado para muestras múltiples de la digestión MNase de la pelotilla que contiene la cromatina. En paso 4.4, Resuspender el pellet en 1,25 mL de tampón de digestión MNase. Alícuota de las muestras a 5 tubos hasta que cada uno contiene 250 μl de la pelotilla de cromatina que se resuspendió en Buffer de digestión MNase.</li>
	<li>Añadir 0, 1.5, 2.5 o 5 μl de MNase a cada tubo. Mezclar suavemente por inversión 4 - 6 veces e inmediatamente incubar los tubos en un baño de agua de 37 ° C por 20 min.</li>
	<li>Inmediatamente colocar los tubos en hielo y añadir 5 μl de EDTA de 0,5 M para una concentración final de 10 mM para detener las reacciones.</li></ol>Mezcle la solución suavemente por inversión.
	<li>Centrifugar los tubos a 15.500 x g durante 15 min a 4 ° C y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mL.</li>
	<li>Añadir SDS a concentración final de 1% (25 μl de solución stock de 10%) y NaHCO3 a concentración final de 0,1 M (25 μl de solución de 1 M) para las muestras en los tubos de 1,5 mL.</li>
	<li>Añadir 20 μl de NaCl 5M, 5 μl de glucógeno y 12,5 μl de proteinasa K de 20mg/mL para las muestras en los tubos de 1,5 mL. Les incubar a 65 ° C durante la noche.</li>
	<li>Añadir 10 μl de RNaseA 10 mg/mL. Incubar a 37 ° C durante 30 minutos.</li>
	<li>Añadir 300 μL de PCI a la solución acuosa y mezclar bien. Vuelta a 15.500 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
	<ol>
		<li>Retire la capa acuosa a un tubo nuevo. Añadir 300 μL de PCI y mezclar bien. Vuelta a 15.500 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Transferir la capa acuosa a un tubo nuevo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Agregar 0.1 volumen x de 3 M acetato de sodio (generalmente 30 μL) y 1 mL de etanol al 100% frío para precipitar el ADN. Invertir el tubo 4 - 6 veces para mezclar bien. Incubar el tubo a-80 ° C por 1 h o -20 ° C durante la noche.
	<ol>
		<li>Girar el tubo a 15.500 x g por 20 min a 4° C. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta.</li>
		<li>Lavar el pellet en 1 mL de etanol frío al 70%. Vuelta a 15.500 x g por 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Deje que las pastillas deje secar al aire en el campana aproximadamente 20 minutos (o hasta totalmente seco). Resuspender el pellet en 30 μl de agua libre de nucleasa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Añadir el ADN carga del tinte y ejecutar 20 μl en una agarosa 2% gel para visualizar digiere ADN.</li>

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<li>Pokholok, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+map+of+nucleosome+acetylation+and+methylation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast.</a> Cell. 122 (4), 517-527 (2005).</li>
<li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Paf1+complex+is+required+for+histone+H3+methylation+by+COMPASS+and+Dot1p%3A+linking+transcriptional+elongation+to+histone+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation.</a> Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).</li>
<li>South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K4+methyltransferase+Set1+is+involved+in+maintenance+of+ergosterol+homeostasis+and+resistance+to+Brefeldin+A%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A.</a> P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).</li>
<li>Margaritis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+repressive+mechanisms+for+histone+3+lysine+4+methylation+through+promoting+3%27-end+antisense+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3'-end antisense transcription.</a> PLoS Genet. 8 (9), e1002952(2012).</li>
<li>Jezek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+methyltransferases+Set5+and+Set1+have+overlapping+functions+in+gene+silencing+and+telomere+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance.</a> Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).</li>
<li>Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sir2p+and+Sas2p+opposingly+regulate+acetylation+of+yeast+histone+H4+lysine16+and+spreading+of+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin.</a> Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).</li>
<li>Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+gradient+of+histone+acetylation+established+by+Sas2p+and+Sir2p+functions+as+a+shield+against+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing.</a> Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).</li>
<li>Rothbart, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Interactive+Database+for+the+Assessment+of+Histone+Antibody+Specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity.</a> Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El procedimiento aquí descrito permite la eficiente recuperación de ADN asociada con histonas modificadas en las células de levadura por la inmunoprecipitación. Esto es seguido por qPCR utilizando cebadores que amplifican regiones de interés para determinar el enriquecimiento local o el agotamiento de las modificaciones específicas de histonas. A pesar de ser desarrollado como un método hace casi 20 años, chIP sigue siendo el ensayo definitorio para investigar el estado de modificación de las histonas en diferentes regio...

La modificación poste-de translación dinámica (PTM) de las histonas es un mecanismo regulador fundamental para muchos procesos con plantilla de ADN, incluyendo transcripción, replicación y reparación de ADN1,2. La capacidad para determinar la abundancia y la localización precisa de las histonas modificadas concomitantes con estos procesos por lo tanto es fundamental para entender la regulación bajo diferentes condiciones en la célula. El desarrollo de inmunoprecipitación de cromatina (chIP) como un método en gran parte provino de los estudios bioquímicos de las interacciones de proteínas con el ADN, particularmente en vitro métodos reticulantes químicos, junto con la necesidad de evaluar la carácter dinámico de las interacciones DNA proteína en vivo y en regiones específicas del genoma3,4,5. El avance de las tecnologías de secuenciación y la PCR cuantitativa (qPCR) también ha ampliado la capacidad para realizar experimentos de chIP con comparaciones cuantitativas y a través de genomas enteros, lo que es una herramienta poderosa para disecar las interacciones DNA-proteína en múltiples niveles.
Actualmente, la viruta es un método necesario para cualquier grupo de investigación interesado en la regulación de cromatina mediada del genoma como no existen métodos comparables para interrogar directamente el enlace físico entre una histona modificado y un locus genómico específico en vivo. Aunque existen variaciones de este método con secuencia de la generación siguiente a modificaciones de las histonas a lo largo del genoma6,7 , estos enfoques pueden abordar diversas cuestiones científicas y su escala, costo y recursos técnicos pueden ser limitantes para algunos grupos de investigación. Además, chIP-qPCR específica es necesario para complementar estos enfoques proporcionando métodos tanto optimización el protocolo de la viruta antes de iniciar la secuencia y validar los resultados de los conjuntos de datos epigenómica. Espectrometría de masas basado en enfoques para identificar el complemento completo de la histona marcas asociadas con regiones genómicas también han surgido8,9,10,11, sin embargo, estos enfoques tienen algunas limitaciones con respecto a qué regiones del genoma pueden ser sondeadas y requieren conocimientos técnicos y la instrumentación que no estará disponible para todos los grupos de investigación. Por lo tanto, el chIP sigue siendo un método fundamental para el análisis de la abundancia y la distribución de modificaciones de las histonas bajo diversas condiciones para todos los grupos de investigación interesados en epigenética, la cromatina y la regulación de funciones genómicas.
Aquí, describimos un método para modelo de chIP con la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) para investigar la distribución de PTMs histonas en la cromatina. Este enfoque se basa en una serie de componentes de la base de protocolos chIP desarrollado en la levadura y también se aplica a modelo diversos sistemas12,13. Las interacciones entre las histonas modificadas y ADN en la célula se conservan por entrecruzamiento con formaldehído. Tras preparación lisada, fragmentos de cromatina son solubilizados en fragmentos de tamaño uniformemente por digestión con nucleasa micrococcal. Inmunoprecipitación de las histonas modificadas se realiza con anticuerpos comerciales o generados por el laboratorio y cualquier ADN asociado es aislado y analizado para el enriquecimiento en determinadas regiones genomic usando qPCR (figura 1). Para muchas modificaciones de las histonas, la cantidad de ADN obtenido de este protocolo es suficiente para probar más de 25 diferentes loci genómicos por qPCR.
Este método de chIP es muy versátil para el control de la distribución de una modificación de las histonas solo a través de múltiples cepas mutantes o las condiciones ambientales, o para probar múltiples modificaciones de las histonas en las células de tipo salvaje en un número de loci genómicos. Además, numerosos componentes del protocolo son fácilmente ajustables para optimizar la detección de cualquiera de los dos altamente o humildes-abundantes marcas de histona. Finalmente, realizar chIP de histonas modificadas en levadura de florecimiento ofrece la oportunidad de utilizar los controles claves para especificidad de anticuerpos que no están ampliamente disponibles en otros sistemas. Es decir, se pueden generar cepas de levadura que llevan las mutaciones de punto en los residuos de las histonas que son objeto de modificación y, en algunos casos, existe solamente una sola enzima que cataliza un residuo particular histona modificación (ej. lisina de las histonas metiltransferasas). Por lo tanto, chIP puede realizarse en cualquiera de los dos las histona mutante o enzima eliminación cepas analizar la medida en que Unión inespecífica del anticuerpo se puede que ocurre y generar falsos positivos. Este control es particularmente valioso para los anticuerpos del recién desarrollado y puede incluso ser utilizado para validar la especificidad del anticuerpo por modificaciones de las histonas conservados antes de su uso en otros sistemas. Este enfoque complementa otros métodos para probar la especificidad del anticuerpo que distinguen entre Estados de modificación diferentes (por ejemplo, mono-, di - y tri-metilación), incluyendo matrices de péptidos modificados de sondeo y realizar western blot de las histonas o nucleosomas con modificaciones definidas. En general, chIP en levadura de florecimiento es un método eficaz para evaluar la dinámica de la histona MPa por todo el genoma y los mecanismos que regulan su regulación de disección.

<table><tbody><tr><td>Extracto de levadura Productos de</td><td>investigación internacional (RPI)</td><td>Y20025-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Peptona</td><td>Productos de investigación internacional (RPI)</td><td>P20250-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Dextrosa</td><td>ThermoScientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC12007-0050</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ThermoScientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>4-nonilfenil-polietilenglicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td>Equivalente a NP-40</td></tr><tr><td>MgCl</td><td></td><td>ThermoScientific S25533</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20899-25G-F</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>ThermoScientific</td><td>AC413271000</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sodio</td><td>Amresco</td><td>M107-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de Sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970-100G</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>ThermoScientific</td><td>S25533</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-5G</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de la proteasa de levadura</td><td>VWR</td><td>10190-076</td><td></td></tr><tr><td>25 Fenol:24 Cloroformo:1 Alcohol isoamílico</td><td>VWR Life Science</td><td>97064-824</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Agua sin nucleasas</td><td>VWR</td><td>100720-992</td><td></td></tr><tr><td>Nucleasa</td> <td>microcócicaWorthington Biochemical</td><td>LS004797</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>ThermoScientific</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Research Products International (RPI)</td><td>P50220-0.1</td><td></td></tr><tr><td>RNasa A&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513-50MG</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; reactivo de ensayo Bradford ThermoScientific</td><td></td><td>23238</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Estándar BSA 2 mg/mL</td><td>ThermoScientific</td><td>23210</td><td></td></tr><tr><td>&alfa; H4</td><td>EMD Millipore</td><td>04-858</td><td></td></tr> <tr><td>y alfa; H4K16ac</td><td>EMD Millipore</td><td>ABE532</td><td></td></tr> <tr><td>y alfa; H3</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td></td></tr> <tr><td>y alfa; H3K4me2</td><td>Motivo Activo</td><td>39142</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Mezcla de qPCR de alta resistencia</td><td>Accuris qMax verde, mezcla de qPCR de baja resistencia</td><td>ACC-PR2000-L-1000</td><td></td></tr><tr><td>Proteínas A/G Perlas magnéticas</td><td>ThermoScientific</td><td>88803</td><td></td></tr><tr><td>soporte magnético para tubos de 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-21359</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de vidrio lavadas con ácido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Homogeneizador de microtubos</td><td>Benchmark</td><td>D1030</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de rosca de 2,0 mL con anillos de sellado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z763837-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de carga de gel</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-288</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-476-476</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos de 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Placa de PCR de 384 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>AB-1384W</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Agitador de piso giratorio</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Model G10</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>ThermoScientific</td><td>ND-2000c</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; sistema de detección por PCR en tiempo real</td><td>Bio-Rad</td><td>1855485</td><td></td></tr></tbody></table>

inmunoprecipitación de cromatina (chip) de modificaciones de las histonas de saccharomyces cerevisiae

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Histone Modifications from Saccharomyces cerevisiae

Modificaciones post-traduccionales de las histonas (PTMs), como acetilación, metilación y fosforilación, dinámicamente son reguladas por una serie de enzimas que añadir o quitar estas marcas en respuesta a las señales recibidas por la célula. Estos MPa es principales contribuyentes a la regulación de procesos tales como control de expresión del gene y de reparación del ADN. Inmunoprecipitación de cromatina (chIP) ha sido un acercamiento instrumental para disección de la abundancia y la localización de muchos PTMs histonas por todo el genoma en respuesta a las diversas perturbaciones a la celda. Aquí, se describe un método versátil para la realización de chIP de modificación postraduccional histonas de la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) . Este método se basa en el entrecruzamiento de las proteínas y el ADN mediante tratamiento de formaldehído de las culturas de levadura, generación de lisados de levadura por cordón latiendo, solubilización de fragmentos de cromatina por nucleasa micrococcal e inmunoprecipitación de ADN histonas complejos. ADN asociado con la marca de la histona de interés es purificado y sometido a análisis PCR cuantitativo para evaluar su enriquecimiento en múltiples loci por todo el genoma. Experimentos representativos sondeo la localización de las marcas de histonas H3K4me2 y H4K16ac en wildtype y levadura mutada se discuten para demostrar la interpretación y análisis de datos. Este método es conveniente para una variedad de la histona PTMs y puede realizarse con diferentes cepas mutantes o en presencia de diversas presiones ambientales, lo que es una excelente herramienta para investigar cambios en la dinámica de la cromatina en condiciones diferentes.

Un componente clave de este protocolo es optimizar la concentración de nucleasa micrococcal (MNase) utilizada para digerir la cromatina en fragmentos solubles, como se indica en el paso 10. Esto es fundamental para la obtención de datos de alta resolución con respecto a la distribución de modificaciones de las histonas en regiones genómicas de interés. Debe realizarse una valoración de MNase para determinar la concentración más adecuada para lograr principalmente mono-nucleosomas con una ...

Aquí, describimos un protocolo para la inmunoprecipitación de cromatina de histonas modificadas de la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated ADN se utiliza posteriormente para PCR cuantitativa para interrogar la abundancia y localización de modificaciones post-traduccionales de las histonas por todo el genoma.

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de modificaciones de las histonas de Saccharomyces cerevisiae

Histone post-translational modifications (PTMs), such as acetylation, methylation and phosphorylation, are dynamically regulated by a series of enzymes ...

El objetivo general de este protocolo de inmunoprecipación de cromatina es determinar la abundancia y localización de las modificaciones de histonas en regiones definidas a lo largo del genoma de la levadura en ciernes. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la regulación de la cromatina, como cómo las modificaciones de las histonas están relacionadas con el control de la expresión génica y cómo estas modificaciones cambian en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Un protocolo extremadamente versátil que se puede utilizar para investigar muchas modificaciones de histonas diferentes y múltiples cepas E a la vez.Aunque este método puede proporcionar información sobre las modificaciones de las histonas, también se puede aplicar a la investigación de otras proteínas de unión a la cromatina mediante el uso de etiquetas de epítopos o anticuerpos disponibles. Comience este procedimiento cultivando las células de levadura, inoculando 10 mililitros de medio YPD con una sola colonia de cada cepa apropiada, y cultivándola a 30 grados centígrados en una incubadora agitadora a 220 rpm durante la noche. Al día siguiente, después de medir la densidad óptica a 600 nanómetros o OD600 del cultivo, diluir el cultivo a un OD600 de 0,2 en 100 mL de YPD en un matraz nuevo.Haga crecer las células a 30 grados centígrados en una incubadora agitadora a 220 rpm hasta que alcancen la fase logarítmica media. Cuando los cultivos hayan alcanzado la fase logarítmica media, agregue 2,7 mililitros de formaldehído al 37% directamente al medio en cada matraz para obtener una concentración final de 1% de formaldehído. Transfiera los matraces a una coctelera a temperatura ambiente y agite a 50 rpm durante 15 minutos.Agregue cinco mililitros de glicina molar 2.5 al medio y continúe agitando a 50 rpm a temperatura ambiente durante cinco minutos para enfriar el formaldehído. Posteriormente, centrifuga las celdas y lávalas como se describe en el protocolo de texto. Retire el sobrenadante después del último centrifugado y proceda a hacer lisados de levadura.Vuelva a suspender las células en un mililitro de precipitación de aminoácidos de cromatina fría o tampón ChIP Lysis con PMSF 1 milimolar y dilución 1:1000 de un cóctel de inhibidores de la proteasa de levadura. Transfiera la suspensión a un tubo de rosca de 2.0 mililitros que contenga 200 microlitros de perlas de vidrio. Transfiera las celdas a un aparato de batido de cuentas para una agitación a alta velocidad a cuatro grados centígrados.Batir con perlas durante 30 segundos y congelar durante un minuto. Batir con cuentas un total de seis veces, manteniendo las células en hielo durante al menos un minuto entre cada batido de 30 segundos. Con una punta de carga de gel, transfiera el lisado a un tubo de 1,5 mililitros.Centrifugar el lisado a 15.500 g a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 250 microlitros de tampón de digestión de nucleasa microcócica pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Añadir 2,5 microlitros de nucleasa microcócica a cada reacción.Mezcle suavemente invirtiendo de cuatro a seis veces e incube inmediatamente en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Después de 20 minutos, detenga la reacción colocando los tubos en hielo, agregando cinco mililitros de EDTA 0.5 molar para una concentración final de 10 milimolares de EDTA y mezclando suavemente por inversión. Centrifugar a 15.500 g a cuatro grados centígrados durante 15 minutos.Luego, transfiera cada sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Para obtener los resultados más consistentes, es fundamental asegurarse de que se utilice la misma concentración de proteína en cada precipitación de aminoácidos. Dependiendo del número de precipitación de aminoácidos o reacciones IP, haga una mezcla maestra de cada fracción de cromatina liberada por nucleasa microcócica y tampón de lisis ChIP y asigne un mililitro que contenga 50 microgramos de proteína total a tubos individuales.Retire 100 microlitros de cada mezcla IP para procesarlos como muestra de entrada. Congele las muestras de entrada a 20 grados centígrados para su uso posterior. También es importante asegurarse de que se utiliza la misma cantidad de perlas unidas al anticuerpo para cada inmunoprecipitación.Con una punta de pipeta de cartón ancho, añada 20 microlitros de perlas de proteína magnética AG, preunidas con anticuerpos, a cada muestra de IP. Gire las muestras a ocho rpm a cuatro grados centígrados durante tres horas. Cuando termine la IP, coloque los tubos en un soporte magnético y deje que las cuentas se acumulen en el costado del tubo.Utilice una pipeta para extraer el sobrenadante. Agregue un mililitro de tampón de lisis ChIP a las perlas y gírelas a ocho rpm a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, coloque los tubos en el soporte magnético y retire el sobrenadante.De esta manera, lavar las cuentas sucesivamente con los siguientes tampones durante el número de veces indicado. Tampón de lisis ChIP, tampón de lavado con alto contenido de sal, tampón de lavado LiCl/detergente y TE. Con el último lavado de TE, use 0.5 mililitros de TE para transferir la mayoría de las cuentas a un tubo nuevo, y luego use otros 0.5 mililitros de TE para lavar el tubo y transferir las cuentas restantes. Agregue 250 microlitros de tampón de elución ChIP recién hecho a cada tubo y haga un vórtice de la solución brevemente.Gire las muestras a ocho rpm a temperatura ambiente durante 15 minutos. Coloque los tubos en el soporte magnético. Transfiera con cuidado el sobrenadante a un tubo nuevo y evite las perlas.Agregue otros 250 microlitros de tampón de elución ChIP a las perlas. Gire las muestras a ocho rpm a temperatura ambiente durante 15 minutos. Con cuidado y sin alterar las perlas, transfiera el sobrenadante al tubo que contiene la primera elución.Descongele las muestras de entrada recolectadas anteriormente y agregue 400 microlitros de tampón de elución ChIP a cada muestra de entrada. Para revertir los enlaces cruzados de ADN de proteínas, agregue a las muestras de entrada e IP, 20 microlitros de cloruro de sodio de cinco molares, cinco microlitros de glucógeno y 12,5 microlitros de proteinasa K. Mezcle bien invirtiendo o moviendo los tubos. Incubar las muestras en un baño de agua a 65 grados centígrados durante la noche.Para comenzar este procedimiento, haga una mezcla maestra de QPCR para cada conjunto de cebadores combinando los volúmenes apropiados de mezcla de QPCR, el cebador directo y el cebador inverso. Hacer mezclas maestras de ADN para cada muestra de ADN en la que una reacción contenga 0,5 microlitros de ADN y 4,0 microlitros de agua libre de nucleasas: Agregue 5,5 microlitros de la mezcla maestra de cebador adecuada a cada pocillo en una placa QPCR de 384 pocillos. Gire el plato a 200 g a temperatura ambiente durante un minuto.A continuación, añade 4,5 microlitros de la mezcla maestra de ADN adecuada a cada pocillo. Selle el plato y gírelo a 200 g a temperatura ambiente durante un minuto. Realice QPCR utilizando un sistema QPCR en tiempo real con las siguientes condiciones, 95 grados centígrados durante tres minutos, 40 ciclos de 95 grados centígrados durante 10 segundos y 55 grados centígrados durante 30 segundos y una curva de fusión de 65 grados centígrados a 95 grados centígrados con incrementos de 0,5 grados centígrados durante cinco segundos.Un componente clave de este protocolo es la optimización de la concentración de nucleasa microcócica utilizada para digerir la cromatina en fragmentos solubles. Este ejemplo resultado de la electroforesis en gel de agarosa del ADN aislado después de la digestión de la pastilla de cromatina con cantidades variables de nucleasa microcócica muestra que 2,5 microlitros de enzima a 20 unidades por microlitro produjeron predominantemente mononucleosomas. Este experimento representativo de ChIP utilizó anticuerpos contra un marcador de metilo de histona H3K4me2 y una histona H3 en células knockout de tipo salvaje y set1.Las células knockout de Set1 carecen de la metiltransferasa que cataliza la marca. Las barras indican el enriquecimiento relativo de H3K4me2 en la SCI baja indicada. La cepa de tipo salvaje mostró un claro enriquecimiento para H3K4me2 en los cinco extremos principales de dos genes que se sabe que son objetivos directos de set1, PMA1 y ERG11, mientras que no se observó ninguna señal en las células knockout de set1. Como se esperaba, no hubo enriquecimiento de la marca H3K4me2 en TEL07L, también se ha informado que la expresión de SPR3 está regulada por set1, pero estos resultados indican que es probable que la regulación ocurra por un mecanismo diferente al de PMA1 o ERG11.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro días si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe analizar cuidadosamente la especificidad del anticuerpo utilizado con los controles adecuados. Si está disponible, las regiones de control positivas y negativas deben sondear en el QPCR.Siguiendo este procedimiento, también se pueden realizar otros métodos como la secuenciación GP para determinar el genoma mediante la distribución de las modificaciones de las histonas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo detectar consistentemente los niveles de diferentes modificaciones de histonas en regiones genómicas únicas con experimentos bien controlados.

chromatin-immunoprecipitation-chip-histone-modifications-from

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

La diferenciación de ESC coincide con los cambios de tipo de células específicas en la estructura y composición de la cromatina. La detección de los cambios proporciona información valiosa sobre los mecanismos que definen stemcellness y la diferenciación celular. Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) representa un método valioso para diseccionar los mecanismos moleculares que subyacen a la diferenciación de células madre.

Inmunoprecipitación de la cromatina de células estaminales embrionarias humanas

Este protocolo describe cómo inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) se utiliza para estudiar las alteraciones dinámicas de la plantilla de la cromatina que regulan la transcripción inducida por una vía de transducción de señal.

Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para el ensayo dinámico de modificación de las histonas en la expresión génica activado en las células humanas

Al combinar nativa y reticular inmunoprecipitación de cromatina con una elevada resolución Espectrometría de Masas, enfoque ChroP permite diseccionar la arquitectura proteómico compuesta de modificaciones de las histonas, variantes y proteínas no histonic sinergizantes en cromatina dominios funcionalmente distintos.

El Enfoque ChroP Combina chip y la espectrometría de masas para diseccionar Locus específicos proteómicos Paisajes de la cromatina

Describimos la división endógena de la cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChEC-seq), un método ortogonal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para cartografiar los sitios de unión a proteínas del genoma con proteínas de fusión de nucleasa micrococcal (MNasa).

Genoma de todo el mapa de las interacciones Proteína-ADN con ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Aquí, describimos una inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y el protocolo de preparación de biblioteca de ChIP-seq para generar perfiles de epigenómica global de muestras embrionarias de pollo baja abundancia.

Cromatina (ChIP) de la inmunoprecipitación protocolo para muestras embrionarias baja abundancia

Presentamos un método eficaz y reproducible para aislar las células progenitoras neurales de tejido cerebral embrionario y postnatal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de la histona 3 lisina 79 dimetilación (H3K79me2) - una marca de histona situada dentro de la cultura el dominio globular de la histona 3.

Aislamiento y cultivo de progenitores neuronales seguido por inmunoprecipitación de cromatina de histona 3 lisina 79 dimetilación marca

Reglamento de medio ambiente de la cromatina es un proceso esencial para expresión génica adecuada. Aquí, describimos un método para controlar la expresión génica a través de la contratación de modificadores de la cromatina maquinaria de manera gene-específica y reversible.

Reprimiendo la transcripción genética redirigiendo la maquinaria celular con modificadores químicos de epigenéticas

Este método está diseñado para seguir la formación de dominios de cromatina mediadas por PRC2 en líneas celulares, y el método se puede adaptar a muchos otros sistemas.

Un método para estudiar la formación de novo de dominios de cromatina

Este protocolo se centra en la preparación de cromatina a partir de tejidos congelados a presión y es adecuado para la inmunoprecipitación de cromatina reticulada (X-ChIP) seguida de un análisis cuantitativo de PCR (X-ChIP-qPCR) o enfoques de secuenciación de próxima generación (X-ChIP-seq).

Extracción de cromatina del tejido hepático quimérico congelado para el análisis de inmunoprecipitación de la cromatina

Aquí, presentamos un protocolo para analizar la distribución de las modificaciones de histonas en todo el genoma, que puede identificar nuevos genes diana en la patogénesis de M. oryzae y otros hongos filamentosos.

Análisis de todo el genoma de la distribución de modificaciones de histonas utilizando el método de secuenciación de inmunoprecipitación de cromatina en Magnaporthe oryzae

Este protocolo presenta un método de aislamiento de cromatina específico de locus basado en la recombinación específica del sitio para purificar un locus de gen de una sola copia de interés en su contexto de cromatina nativa a partir de la levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae.

Purificación de cromatina del locus del gen de copia única en Saccharomyces cerevisiae

Aprende a realizar inmunoprecipitación de cromatina para analizar modificaciones de histonas en Saccharomyces cerevisiae. Este protocolo versátil permite estudiar la regulación de la expresión génica en levadura.

Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de modificaciones de las histonas de Saccharomyces cerevisiae

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