Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de modificaciones de las histonas de Saccharomyces cerevisiae

El objetivo general de este protocolo de inmunoprecipación de cromatina es determinar la abundancia y localización de las modificaciones de histonas en regiones definidas a lo largo del genoma de la levadura en ciernes. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la regulación de la cromatina, como cómo las modificaciones de las histonas están relacionadas con el control de la expresión génica y cómo estas modificaciones cambian en respuesta a diferentes condiciones ambientales. Un protocolo extremadamente versátil que se puede utilizar para investigar muchas modificaciones de histonas diferentes y múltiples cepas E a la vez.

Aunque este método puede proporcionar información sobre las modificaciones de las histonas, también se puede aplicar a la investigación de otras proteínas de unión a la cromatina mediante el uso de etiquetas de epítopos o anticuerpos disponibles. Comience este procedimiento cultivando las células de levadura, inoculando 10 mililitros de medio YPD con una sola colonia de cada cepa apropiada, y cultivándola a 30 grados centígrados en una incubadora agitadora a 220 rpm durante la noche. Al día siguiente, después de medir la densidad óptica a 600 nanómetros o OD600 del cultivo, diluir el cultivo a un OD600 de 0,2 en 100 mL de YPD en un matraz nuevo.

Haga crecer las células a 30 grados centígrados en una incubadora agitadora a 220 rpm hasta que alcancen la fase logarítmica media. Cuando los cultivos hayan alcanzado la fase logarítmica media, agregue 2,7 mililitros de formaldehído al 37% directamente al medio en cada matraz para obtener una concentración final de 1% de formaldehído. Transfiera los matraces a una coctelera a temperatura ambiente y agite a 50 rpm durante 15 minutos.

Agregue cinco mililitros de glicina molar 2.5 al medio y continúe agitando a 50 rpm a temperatura ambiente durante cinco minutos para enfriar el formaldehído. Posteriormente, centrifuga las celdas y lávalas como se describe en el protocolo de texto. Retire el sobrenadante después del último centrifugado y proceda a hacer lisados de levadura.

Vuelva a suspender las células en un mililitro de precipitación de aminoácidos de cromatina fría o tampón ChIP Lysis con PMSF 1 milimolar y dilución 1:1000 de un cóctel de inhibidores de la proteasa de levadura. Transfiera la suspensión a un tubo de rosca de 2.0 mililitros que contenga 200 microlitros de perlas de vidrio. Transfiera las celdas a un aparato de batido de cuentas para una agitación a alta velocidad a cuatro grados centígrados.

Batir con perlas durante 30 segundos y congelar durante un minuto. Batir con cuentas un total de seis veces, manteniendo las células en hielo durante al menos un minuto entre cada batido de 30 segundos. Con una punta de carga de gel, transfiera el lisado a un tubo de 1,5 mililitros.

Centrifugar el lisado a 15.500 g a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 250 microlitros de tampón de digestión de nucleasa microcócica pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Añadir 2,5 microlitros de nucleasa microcócica a cada reacción.

Mezcle suavemente invirtiendo de cuatro a seis veces e incube inmediatamente en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Después de 20 minutos, detenga la reacción colocando los tubos en hielo, agregando cinco mililitros de EDTA 0.5 molar para una concentración final de 10 milimolares de EDTA y mezclando suavemente por inversión. Centrifugar a 15.500 g a cuatro grados centígrados durante 15 minutos.

Luego, transfiera cada sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Para obtener los resultados más consistentes, es fundamental asegurarse de que se utilice la misma concentración de proteína en cada precipitación de aminoácidos. Dependiendo del número de precipitación de aminoácidos o reacciones IP, haga una mezcla maestra de cada fracción de cromatina liberada por nucleasa microcócica y tampón de lisis ChIP y asigne un mililitro que contenga 50 microgramos de proteína total a tubos individuales.

Retire 100 microlitros de cada mezcla IP para procesarlos como muestra de entrada. Congele las muestras de entrada a 20 grados centígrados para su uso posterior. También es importante asegurarse de que se utiliza la misma cantidad de perlas unidas al anticuerpo para cada inmunoprecipitación.

Con una punta de pipeta de cartón ancho, añada 20 microlitros de perlas de proteína magnética AG, preunidas con anticuerpos, a cada muestra de IP. Gire las muestras a ocho rpm a cuatro grados centígrados durante tres horas. Cuando termine la IP, coloque los tubos en un soporte magnético y deje que las cuentas se acumulen en el costado del tubo.

Utilice una pipeta para extraer el sobrenadante. Agregue un mililitro de tampón de lisis ChIP a las perlas y gírelas a ocho rpm a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, coloque los tubos en el soporte magnético y retire el sobrenadante.

De esta manera, lavar las cuentas sucesivamente con los siguientes tampones durante el número de veces indicado. Tampón de lisis ChIP, tampón de lavado con alto contenido de sal, tampón de lavado LiCl/detergente y TE. Con el último lavado de TE, use 0.5 mililitros de TE para transferir la mayoría de las cuentas a un tubo nuevo, y luego use otros 0.5 mililitros de TE para lavar el tubo y transferir las cuentas restantes. Agregue 250 microlitros de tampón de elución ChIP recién hecho a cada tubo y haga un vórtice de la solución brevemente.

Gire las muestras a ocho rpm a temperatura ambiente durante 15 minutos. Coloque los tubos en el soporte magnético. Transfiera con cuidado el sobrenadante a un tubo nuevo y evite las perlas.

Agregue otros 250 microlitros de tampón de elución ChIP a las perlas. Gire las muestras a ocho rpm a temperatura ambiente durante 15 minutos. Con cuidado y sin alterar las perlas, transfiera el sobrenadante al tubo que contiene la primera elución.

Descongele las muestras de entrada recolectadas anteriormente y agregue 400 microlitros de tampón de elución ChIP a cada muestra de entrada. Para revertir los enlaces cruzados de ADN de proteínas, agregue a las muestras de entrada e IP, 20 microlitros de cloruro de sodio de cinco molares, cinco microlitros de glucógeno y 12,5 microlitros de proteinasa K. Mezcle bien invirtiendo o moviendo los tubos. Incubar las muestras en un baño de agua a 65 grados centígrados durante la noche.

Para comenzar este procedimiento, haga una mezcla maestra de QPCR para cada conjunto de cebadores combinando los volúmenes apropiados de mezcla de QPCR, el cebador directo y el cebador inverso. Hacer mezclas maestras de ADN para cada muestra de ADN en la que una reacción contenga 0,5 microlitros de ADN y 4,0 microlitros de agua libre de nucleasas: Agregue 5,5 microlitros de la mezcla maestra de cebador adecuada a cada pocillo en una placa QPCR de 384 pocillos. Gire el plato a 200 g a temperatura ambiente durante un minuto.

A continuación, añade 4,5 microlitros de la mezcla maestra de ADN adecuada a cada pocillo. Selle el plato y gírelo a 200 g a temperatura ambiente durante un minuto. Realice QPCR utilizando un sistema QPCR en tiempo real con las siguientes condiciones, 95 grados centígrados durante tres minutos, 40 ciclos de 95 grados centígrados durante 10 segundos y 55 grados centígrados durante 30 segundos y una curva de fusión de 65 grados centígrados a 95 grados centígrados con incrementos de 0,5 grados centígrados durante cinco segundos.

Un componente clave de este protocolo es la optimización de la concentración de nucleasa microcócica utilizada para digerir la cromatina en fragmentos solubles. Este ejemplo resultado de la electroforesis en gel de agarosa del ADN aislado después de la digestión de la pastilla de cromatina con cantidades variables de nucleasa microcócica muestra que 2,5 microlitros de enzima a 20 unidades por microlitro produjeron predominantemente mononucleosomas. Este experimento representativo de ChIP utilizó anticuerpos contra un marcador de metilo de histona H3K4me2 y una histona H3 en células knockout de tipo salvaje y set1.

Las células knockout de Set1 carecen de la metiltransferasa que cataliza la marca. Las barras indican el enriquecimiento relativo de H3K4me2 en la SCI baja indicada. La cepa de tipo salvaje mostró un claro enriquecimiento para H3K4me2 en los cinco extremos principales de dos genes que se sabe que son objetivos directos de set1, PMA1 y ERG11, mientras que no se observó ninguna señal en las células knockout de set1. Como se esperaba, no hubo enriquecimiento de la marca H3K4me2 en TEL07L, también se ha informado que la expresión de SPR3 está regulada por set1, pero estos resultados indican que es probable que la regulación ocurra por un mecanismo diferente al de PMA1 o ERG11.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro días si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe analizar cuidadosamente la especificidad del anticuerpo utilizado con los controles adecuados. Si está disponible, las regiones de control positivas y negativas deben sondear en el QPCR.

Siguiendo este procedimiento, también se pueden realizar otros métodos como la secuenciación GP para determinar el genoma mediante la distribución de las modificaciones de las histonas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo detectar consistentemente los niveles de diferentes modificaciones de histonas en regiones genómicas únicas con experimentos bien controlados.