Name: Fraccionamiento para la resolución de las especies de huntingtina Soluble e Insoluble (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Aprende a fraccionar especies de huntingtina soluble e insoluble en modelos de enfermedad de Huntington. Esta técnica permite aislar y cuantificar proteínas para analizar la homeostasis proteica en neurodegeneración.

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Este trabajo fue financiado por los NIH (to1-NS090390). También nos gustaría agradecer al Dr. Joan Steffanfor asistencia técnica y debate durante el desarrollo de este ensayo.

Declaración de ética animal - experimentos se llevaron a cabo estrictamente de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los institutos nacionales de salud y un protocolo de investigación de animales aprobados por el Comité de uso y cuidado institucional del Animal ( IACUC) de la Universidad de California, Irvine, un AAALAC institución acreditada. Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales.
1. preparación de buffer de lisis
<ol><li>Preparar "Soluble" tampón de lisis (10 mM Tris, pH 7.4, de 1% Triton-X 100, 150 mM NaCl, 10% glicerol) y un filtro estéril con filtro de 0.22 μm.<ol>
<li>Para un buffer de lisis "Solubles" de trabajo, medir N-etilmaleimida (NEM) y disolver completamente en 100 mM phenylmethysulfonyl fluoruro (PMSF) disuelto en 100% EtOH. Nota: Inhibidores de tampón de lisis: (i) 20 mM N-etilmaleimida (NEM); (ii) 0,2 mM PMSF; (iii) 1 mM ortovanadato de sodio (Na3VO4); (iv) 1 leupeptin μg/mL; (v) 1 μg/mL aprotinina; (vi) 20 mM de fluoruro de sodio (NaF). PRECAUCIÓN: Use una mascarilla cuando se trabaja con NEM en el protocolo. Tampón de lisis de trabajo debe hacerse fresca para inhibidores activos.</li>
		<li>Tampón de lisis soluble con inhibidores de la proteasa, inhibidores de añadir en el siguiente orden: fluoruro sódico (NaF), enrasar con tampón de lisis frío, ortovanadato de sodio (Na3VO4), aprotinina y Leupeptin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para el tampón de lisis "Insoluble", suplemento 4% SDS por agregar 500 μl de SDS 20% 2 ml de tampón de lisis "Soluble". Dejar a temperatura ambiente. Nota: SDS precipita hacia fuera conservado a 4 ° C; Mantenga este a temperatura ambiente. Composición final de tampón de lisis: 10 mM Tris (pH 7.4); 1% Tritón X-100; 150 mM de NaCl; glicerol al 10%; 4% SDS (sólo insolubles).</li>
</ol>2. solubles/insolubles fraccionamiento protocolo
Nota: Vea la figura 1 para un diagrama esquemático.
<ol><li>Dos juegos de tubos para cada muestra de la etiqueta: "Soluble" e "Insoluble".</li>
	<li>Añadir X-μl de helada tampón de lisis soluble de trabajo complementado con inhibidores de la proteasa (véase 1.1.1) al tejido. Nota: X = volumen varía dependiendo de la cantidad de tejido; Vea la tabla 1.</li>
	<li>Para el tejido de cerebro de ratón (es decir, cuerpo estriado), dounce lentamente 30 veces en douncer de vidrio 1 mL y pipeta en "Insoluble" etiquetado tubo (mantener en hielo). Nota: Tenga cuidado de no romper la superficie del líquido después de comenzar el douncing, como las burbujas se forma y pueden producir homogeneización incompleta.</li>
	<li>Para las células (es decir, HeLa, HEK293T), enjuague las células una vez con frío, 1 x PBS. Quite PBS y aplicar mínimo volumen de tampón de lisis a las células y levante con el raspador de la célula. Nota: Para sobre líneas celulares, las células fueron plateadas en 5 x 105 células por placa bien 6 y crecidas a cerca de la confluencia. Uno bueno es comparable a volúmenes utilizados para el striatum del ratón.</li>
	<li>Transferencia homogeneizado o célula lisada en la etiqueta, "Insoluble" tubos y lyse en hielo 1 hora (reloj de inicio después de procesada tubo final). Nota: Para los lysates de la célula, triturate varias veces romper grumos de células antes de comenzar la incubación. Evitar formación de burbujas. Brevemente vortex pulso cada muestra para 1 s a la mitad de lisis.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 4 ° C a 15.000 x g por 20 min.</li>
	<li>Recuperar el sobrenadante como la fracción "Soluble".<ol>
<li>Extraiga con pipeta, tenga cuidado de no perturbar la capa pellets/nublado que esto contaminará la fracción. Fracción soluble de la pipeta en "Soluble" etiquetado tubo. Mantener en hielo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavar el pellet con 500 μl de tampón de lisis (x2) y centrifugar a 4 ° C a 15.000 x g durante 5 min después de cada lavado; pasa nada si parte de la capa turbia se pipetea apagado.</li>
	<li>Después del último lavado, eliminar todo el tampón de lavado restante dejando únicamente el pellet de tejido. Nota: Desde este punto, muestras insolubles ahora deben ser mantenidas a temperatura ambiente.</li>
	<li>Pellets de resuspender con X-μl de tampón de lisis con 4% SDS (volumen puede ajustarse dependiendo del tamaño de la pelotilla; ver tabla 1).</li>
	<li>Someter a ultrasonidos cada muestra durante 30 s a temperatura ambiente con un sonicador de sondeo (125 w, 20 kHz, pulso, amplitud 40%, ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Hervir las muestras (rolling hervir) durante 30 minutos; Centrifugar brevemente (15 s) 6.000 x g en cuanto a no perder cualquier muestra.</li>
	<li>Realizar ensayo de proteína DC (detergente compatible) (véase Tabla de materiales) o ensayo de proteínas de Lowry para medir concentración de proteínas (se recomienda empezadas diluciones de 1/5 de la muestra en tampón de lisis respectivo para el cultivo celular y 1/10 para lisados de tejidos). Nota: Las concentraciones de proteína debe ser leído usando un análisis DC o Lowry debido a la alta concentración de detergente.</li>
	<li>Muestras alícuotas en 50 lotes de μL para evitar problemas de congelación y descongelación. Nota: Protocolo puede pausarse aquí antes más análisis bioquímico mediante el almacenamiento de ambas fracciones a-20 ° C.</li>
</ol>3. cuantificación y Western Blot
<ol><li>Realizar western blot como se informó en otra parte1,13 por dilución 30 μg de muestra 1:1 en la carga de búfer (1.6 x tinte, 1 x reducción de la carga). Nota: 30 μg de proteína por la fracción es suficiente, pero se puede ajustar para una resolución óptima. 3 - geles de poli-acrilamida de Tris acetato de 8% deben utilizarse para la fracción insoluble. 4 - se recomiendan geles de Tris bis 12% para la fracción soluble.</li>
	<li>Hervir las muestras (hervir) por 5 min, centrifugar brevemente (15 s) 6.000 x g para obtener muestra.</li>
	<li>Analizar fracciones por SDS-PAGE y western blot, según protocolo del fabricante para muestras reducidas. Nota: Fracción Insoluble resuelve mejor cuando transfieren a la membrana de nitrocelulosa de 0,45 μm. nitrocelulosa de 0,45 o 0,2 μm puede utilizarse para la fracción soluble, dependiendo del tamaño de la proteína de interés. Algunos optimización puede ser necesario para la mejor transferencia de materiales de APM.</li>
	<li>Mancha la membrana con la mancha de la proteína entera (p. ej., MEMcode, ver la Tabla de materiales) para visualizar proteínas eficiencia de carga. Nota: Manchas blancas /negras occidentales pueden ser analizadas por la intensidad de la medias pixel. Fracciones soluble pueden ser normalizados a una proteína de mantenimiento mejor adaptada para el sistema experimental. Fracción insoluble como la abundancia relativa de proteínas fue verificado por coloración reversible proteína o normalización de la histona 3 en blot separada.</li>
</ol>

<ol><li>Ochaba, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIAS1+Regulates+Mutant+Huntingtin+Accumulation+and+Huntington%27s+Disease-Associated+Phenotypes+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo.</a> Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).</li>
<li>La Spada, A. R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeat+expansion+disease%3A+progress+and+puzzles+in+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis.</a> Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).</li>
<li>Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+neuropathology+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Genetics and neuropathology of Huntington's disease.</a> Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).</li>
<li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington%27s+disease+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li>
<li>Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%3A+the+current+state+of+research+with+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues.</a> Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).</li>
<li>Weydt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoregulatory+and+metabolic+defects+in+Huntington%27s+disease+transgenic+mice+implicate+PGC-1alpha+in+Huntington%27s+disease+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration.</a> Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).</li>
<li>Schulte, J., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+function+of+the+Huntingtin+protein+and+its+relevance+to+Huntington%27s+Disease+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Trends+Neurol%22%5BJournal%5D)">The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology.</a> Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).</li>
<li>Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrantly+spliced+HTT%2C+a+new+player+in+Huntington%27s+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis.</a> RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).</li>
<li>Neueder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+exon+1+HTT+protein+is+produced+by+incomplete+splicing+in+Huntington%27s+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients.</a> Sci Rep. 7 (1), 1307(2017).</li>
<li>Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+the+first+17+amino+acids+of+huntingtin+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomol+Concepts%22%5BJournal%5D)">The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease.</a> Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).</li>
<li>Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+acts+in+the+nucleus+to+induce+apoptosis+but+death+does+not+correlate+with+the+formation+of+intranuclear+inclusions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions.</a> Cell. 95 (1), 55-66 (1998).</li>
<li>Kim, S., Kim, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Approaches+for+Inhibition+of+Protein+Aggregation+in+Huntington%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease.</a> Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).</li>
<li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-2+and+PIAS1+modulate+insoluble+mutant+huntingtin+protein+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation.</a> Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).</li>
<li>Shibata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+intracellular+accumulation+of+mutant+Huntingtin+by+Beclin+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1.</a> J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).</li>
<li>Apostol, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-based+assay+for+aggregation+inhibitors+as+therapeutics+of+polyglutamine-repeat+disease+and+validation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).</li>
<li>Wanker, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+filter+assay+for+detection+of+amyloid-like+polyglutamine-containing+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates.</a> Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).</li>
<li>Sontag, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Mutant+Huntingtin+Aggregation+Conformers+and+Modulation+of+SDS-Soluble+Fibrillar+Oligomers+by+Small+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Huntingtons+Dis%22%5BJournal%5D)">Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules.</a> J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).</li>
<li>Grima, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+Huntingtin+Disrupts+the+Nuclear+Pore+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex.</a> Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).</li>
<li>Sontag, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylene+blue+modulates+huntingtin+aggregation+intermediates+and+is+protective+in+Huntington%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models.</a> J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).</li>
<li>Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricyclic+pyrone+compounds+prevent+aggregation+and+reverse+cellular+phenotypes+caused+by+expression+of+mutant+huntingtin+protein+in+striatal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons.</a> BMC Neurosci. 10, 73(2009).</li>
<li>Shahmoradian, S. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23853712">TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation.</a> Elife. 2, e00710(2013).</li>
<li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+inhibition+induces+alpha-synuclein+SUMOylation+and+aggregate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation.</a> J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).</li>
<li>Goldberg, N. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Neural+Progenitor+Transplantation+Rescues+Behavior+and+Reduces+alpha-Synuclein+in+a+Transgenic+Model+of+Dementia+with+Lewy+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies.</a> Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Algunas precauciones son necesarias para que los protocolos anteriores asegurar resultados consistentes y cuantitativos. En primer lugar, mHTT en ambas fracciones espontáneamente forman agregados con el tiempo a múltiples ciclos de descongelación de congelación, especialmente cuando en una alta concentración. Por lo tanto es crítico para congelar alícuotas de las preparaciones de proteínas y descongelar sólo el volumen necesario antes de ejecutar el ensayo como se describe en el protocolo anterior. Además, si fracción in...

La interrupción de las redes de control de calidad de proteínas que aseguran el correcto plegamiento y degradación de proteínas celulares son probable central a patología en la enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Huntington (EH) y otros "proteína mal plegamiento" trastornos de2,3. Una comprensión detallada de los componentes de red proteostasis y sus contribuciones a la patología son cruciales para el desarrollo de intervenciones terapéuticas mejoradas. HD es causado por la anormal extensión de una repetición de CAG en el gen de la EH en un tramo mayor de polyglutamines (poliQ) en la proteína de huntingtina (HTT)4. Una constante característica patológica de la patogenesia de la HD es la resultante mal plegamiento, acumulación y agregación de HTT en regiones del cerebro y en tejidos periféricos, que se ha demostrado que interferir en varios aspectos con la función y la homeostasis celular normal 5 , 6. HTT mientras que ubicuo se expresa, las neuronas espinosas medianas en el estriado son selectivamente vulnerables y más abiertamente afectadas con notable atrofia cortical asociada también a la patogenia de la HD.
La formación de agregados de HTT en el cerebro de pacientes con EH y en modelos animales por lo general ha servido como marcador de progresión de la enfermedad y la ganancia negativa dominante de la función para la mHTT7proxy. Aunque los mecanismos precisos por que la proteína mal plegamiento y agregación pueden contribuir a la toxicidad inducida por la mHTT siguen siendo confusos, la formación de las inclusiones en el cerebro de pacientes con EH y en varios modelos animales es una característica invariable e inevitable. Inclusiones aparecen a conformada en gran parte fragmentos HTT acumuladas que contiene el N-terminal ampliada poliQ, indicando que la proteólisis y de larga duración HTT como alternativa empalme8,9 pueden desempeñar un papel importante en la patogenesia de fragmentos N-terminal HD. HTT puede constituir una forma patológica de HTT que puede agregar rápidamente, nuclear y acelerar o propagar el proceso de agregación10.
Sin embargo, la presencia de estas inclusiones no se correlaciona necesariamente con toxicidad inducida HTT o célula muerte11. HTT se ha propuesto para someterse a un proceso de agregación de un monómero soluble a través de especies oligoméricas solubles y las fibrillas de β-hoja a agregados insolubles y las inclusiones12. Resolver estas diversas especies de proteína mediante análisis bioquímicos estándar ha sido un reto en el campo debido a su estabilidad en tampón de lisis poco detergente y dificultad en visualizar usando análisis bioquímicos estándar. Por lo tanto, consideraciones metodológicas son fundamentales para detectar el grado y patrón de la mHTT acumulada y agregada.
El protocolo presentado aquí ofrece un método para visualizar varios intermedios de HTT, específicamente la formación de una especie de HMW HTT insoluble que parece seguir muy de cerca con HD patogénesis y enfermedad progresión1,13 ,14. Ser capaz de resolver y seguimiento de múltiples especies de mHTT ofrece a los investigadores una herramienta bioquímica para estudiar la patogénesis de la enfermedad y evaluar posibles intervenciones terapéuticas a través de su modulación y su impacto en la patogénesis de la enfermedad.

<table><tbody><tr><td>Filtro estéril</td><td>Millipore</td><td>SCGP505RE</td><td>Tapón de rosca, filtro de vacío estéril</td></tr><tr><td>1 mL Triturador de tejidos, Sonicador de</td><td>357538</td><td></td>Dounce <td>Wheaton</td></tr><tr><td></td><td>Qsonica</td><td>modelo Q125</td><td></td></tr><tr><td>DC Ensayo de proteínas</td><td>Biorad</td><td>5000111</td><td>comparable al ensayo de Lowry</td></tr><tr><td>Tris 1M solución tampón</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60636</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 5M</td><td>solución Teknova</td><td>S0251</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS solución</td><td>Teknova</td><td>S0295</td><td></td></tr><tr><td>N-etilmaleimida</td><td>Sigma</td><td>E1271</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetilsulfonia fluoruro Sigma</td><td></td><td>P7626</td><td>crea una solución madre de 100 mM en un 100% EtOH, tienda a 4&deg; C</td></tr><tr><td>Ortovanadato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td>Crear solución madre de 0,5 m en agua</td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td>Crear solución madre de 10 mg/ml en agua</td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td>Crear solución madre de 10 mg/ml en agua</td></tr><tr><td>Fluoruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>S4504</td><td>Crear solución madre de 500 mM en agua</td></tr><tr><td>Millipore</td> <td>Anti-HTT</td><td>MAB5492</td><td>Uso 1:1000 para Western blot, 1:500 para el ensayo de retardo de filtro</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56875</td><td>Use 1:1000 para Western blot soluble</td></tr></tbody></table>

fraccionamiento para la resolución de las especies de huntingtina soluble e insoluble

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

La acumulación de proteínas mal plegadas es central a la patología en la enfermedad de Huntington (HD) y muchos otros trastornos neurodegenerativos. Específicamente, una característica patológica fundamental de HD es la acumulación aberrante de la proteína del mutante de HTT (mHTT) en complejos de alto peso molecular y los cuerpos de inclusión intracelulares compuesto por fragmentos y otras proteínas. Los métodos convencionales para medir y entender que las contribuciones de las diversas formas de agregados que contienen mHTT incluyen microscopía de fluorescencia, mancha blanca /negra occidental análisis y filtro trampa de ensayos.
Sin embargo, la mayoría de estos métodos es específicos de conformación y por lo tanto no puede resolver el estado completo del flujo de proteína mHTT debido a la naturaleza compleja de solubilidad total y resolución.
Para la identificación de complejos y varias formas modificadas y mHTT agregado, separación y solubilización de los agregados celulares y fragmentos es obligatoria. Aquí se describe un método para aislar y visualizar la mHTT soluble, monómeros, oligómeros, fragmentos y un insoluble alto peso molecular (HMW) acumulado mHTT especies. HMW mHTT pistas con la progresión de la enfermedad corresponde con lecturas de comportamiento del ratón y ha sido beneficioso modulada por determinadas intervenciones terapéuticas1. Este enfoque puede utilizarse con cultivo de células, los tejidos periféricos y cerebro de ratón, pero puede adaptarse a otro modelo de los sistemas o contextos de enfermedad.

Resolución de lysates de la célula soluble e insoluble después de fraccionamiento puede ser detectado usando western análisis y filtro de retraso análisis (figura 2). Por ejemplo, células HEK293T fueron transfectadas con el reactivo de transfección (p. ej., lipofectamine 2000) con exón HTT 1 cDNA codificación que contiene glutamina 97 repite15 seguido por la región rico poli prolina y estas células se les permitiera expresa pa...

Se describe un método para fraccionamiento de huntingtina mutada insoluble y soluble especies de ratón cerebro y la célula cultura. El método descrito es útil para la caracterización y cuantificación de flujo de la proteína huntingtina y SIDA en el análisis de homeostasis de proteínas en la patogénesis de la enfermedad y en presencia de perturbaciones

Fraccionamiento para la resolución de las especies de huntingtina Soluble e Insoluble

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

El objetivo general de este procedimiento es describir una herramienta útil para la visualización, caracterización y cuantificación del flujo de proteínas huntingtina para el análisis de la homeostasis de proteínas en los sistemas modelo de la enfermedad de Huntington. Este método puede ayudarnos a comprender cuestiones en los campos de la homeostasis de las proteínas y las enfermedades neurodegenerativas, como la comprensión del impacto de ciertas intervenciones terapéuticas en la patogénesis de la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que permite a los investigadores aislar y resolver especies de proteínas insolubles para su análisis cuantitativo.Aunque este método puede proporcionar información sobre los cambios bioquímicos durante la patogénesis de la enfermedad de Huntington, también se puede aplicar a otras enfermedades que doblan mal las proteínas, como la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer. Para comenzar este procedimiento, etiquete dos juegos de tubos para cada muestra como solubles e insolubles. Prepare un tampón de lisis inmediatamente antes de la lisis de la muestra en el tubo soluble añadiendo la cantidad adecuada de inhibidores.A contin

fractionation-for-resolution-soluble-insoluble-huntingtin

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Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Aquí se describe un protocolo para la purificación de gran actividad Hsp104, un AAA hexameric + proteína de la levadura, que se acopla la hidrólisis de ATP con el desglose de proteínas. Este esquema se aprovecha de una construcción de His6-etiquetados para la purificación de afinidad...

La purificación de Hsp104, una proteína Disaggregase

Este video demuestra el protocolo para aislar fibrillas de amiloide del extracto de tejido cerebral de ratón utilizando centrifugación en gradiente de densidad y digestión de proteínas no amiloides.

Aislamiento de fibrillas de amiloide a partir de extracto de tejido cerebral

Aquí, presentamos un protocolo de fraccionamiento de membrana cerebral que representa un procedimiento robusto para aislar proteínas pertenecientes a diferentes compartimentos sinápticos.

Fraccionamiento de Membranas Cerebrales: Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Enfoque para evaluar la localización de proteínas subsinápticas

Se describe un protocolo abreviado de fraccionamiento para el enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano postmortem.

Enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano Postmortem

Se presenta un procedimiento para el refolding el dCACHE periplasmic dominio obligatorio del ligand del jejuni del Campylobacter quimioreceptor Tlp3 de cuerpos de inclusión y de la purificación para producir cantidades de miligramos de proteína.

Método para Refolding eficiente y la purificación del quimioreceptor ligando vinculante dominio

Aquí, presentamos un protocolo robusto y optimizado para la producción de cantidades de miligramos de monómeros nativos, libre de etiqueta y las fibrillas de la exon1 de la proteína huntingtina (Httex1) basado en la fusión transitoria de ubiquitina pequeños modificadores relacionados (SUMO).

Generación de monómero Exon1 huntingtina nativo, sin etiquetar y fibrillas utilizando una estrategia de fusión de SUMO

La expresión y purificación de las proteínas que contienen el dominio de la hidrolasa fumarilacetoacetato se describe con ejemplos (expresión en E.coli, FPLC). Las proteínas purificadas se utilizan para la cristalización y la producción de anticuerpos y se emplean para ensayos enzimáticos. Los ensayos fotométricos seleccionados se presentan para mostrar la multifuncionalidad de FAHD1 como oxaloacetato decarboxilasa e hidrolasa de acilpuvato.

Expresión, purificación, cristalización y ensayos enzimáticos de proteínas que contienen el dominio de la hidrolasa fumarilacetoacetato

Presentamos una técnica para estabilizar rápidamente complejos traslacionales (biosíntesis de proteínas) con reticulación de formaldehído en levaduras vivas y células de mamíferos. El enfoque permite diseccionar intermedios transitorios e interacciones dinámicas ARN:proteína. Los complejos reticulados se pueden utilizar en múltiples aplicaciones posteriores, como en métodos de perfiles basados en secuenciación profunda, microscopía y espectrometría de masas.

Fijación rápida in vivo y aislamiento de complejos traslacionales de células eucariotas

Proporcionamos protocolos escalables que cubren el diseño de constructo, la transfección transitoria y la expresión y purificación de variantes de proteína huntingtina humana de longitud completa en células HEK293.

Producción eficiente y escalable de variantes completas de huntingtina humana en células de mamíferos utilizando un sistema de expresión transitoria

Este protocolo describe cómo extraer la proteína 1 que contiene el dominio fumarilacetato hidrolasa (FAHD1) del riñón porcino y el hígado de ratón. Los métodos enumerados pueden adaptarse a otras proteínas de interés y modificarse para otros tejidos.

Extracción y purificación de la proteína FAHD1 del riñón porcino y el hígado de ratón

Este protocolo presenta un método robusto y detallado para obtener sinaptosomas altamente puros, vesículas sinápticas y otras fracciones sinápticas del cerebro del ratón. Este método permite la evaluación de procesos sinápticos, incluyendo el análisis bioquímico de la localización y función de proteínas con resolución compartimental.

Fraccionamiento subcelular para el aislamiento de componentes sinápticos del cerebro murino

Aprende a fraccionar especies de huntingtina soluble e insoluble en modelos de enfermedad de Huntington. Esta técnica permite aislar y cuantificar proteínas para analizar la homeostasis proteica en neurodegeneración.

Fraccionamiento para la resolución de las especies de huntingtina Soluble e Insoluble

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