Fraccionamiento para la resolución de las especies de huntingtina Soluble e Insoluble
27 de febrero de 2018
Se describe un método para fraccionamiento de huntingtina mutada insoluble y soluble especies de ratón cerebro y la célula cultura. El método descrito es útil para la caracterización y cuantificación de flujo de la proteína huntingtina y SIDA en el análisis de homeostasis de proteínas en la patogénesis de la enfermedad y en presencia de perturbaciones
El objetivo general de este procedimiento es describir una herramienta útil para la visualización, caracterización y cuantificación del flujo de proteínas huntingtina para el análisis de la homeostasis de proteínas en los sistemas modelo de la enfermedad de Huntington. Este método puede ayudarnos a comprender cuestiones en los campos de la homeostasis de las proteínas y las enfermedades neurodegenerativas, como la comprensión del impacto de ciertas intervenciones terapéuticas en la patogénesis de la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que permite a los investigadores aislar y resolver especies de proteínas insolubles para su análisis cuantitativo.
Aunque este método puede proporcionar información sobre los cambios bioquímicos durante la patogénesis de la enfermedad de Huntington, también se puede aplicar a otras enfermedades que doblan mal las proteínas, como la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer. Para comenzar este procedimiento, etiquete dos juegos de tubos para cada muestra como solubles e insolubles. Prepare un tampón de lisis inmediatamente antes de la lisis de la muestra en el tubo soluble añadiendo la cantidad adecuada de inhibidores.
A continuación, agregue al tejido un tampón de lisis soluble de trabajo frío con hielo suplementado con inhibidores de la proteasa. Para el tejido cerebral del ratón, rebote lentamente 30 veces en un tapiz de vidrio de un mililitro. Tenga cuidado de no romper la superficie del líquido, ya que se formarán burbujas y pueden producir una homogeneización incompleta.
A continuación, pipetearlo en el tubo marcado con insoluble en hielo. En el caso de las líneas celulares, las células se sembraron cinco veces 10 por la quinta célula en cada placa de seis pocillos y crecieron hasta casi la confluencia. Después, enjuague las celdas una vez con PBS frío 1X y retírelo.
A continuación, aplique un volumen mínimo de tampón de lisis a las células y levántelas con un raspador de células. A continuación, transfiera el homogeneizado o el lisado celular al tubo insoluble marcado y lise en hielo durante una hora. En el caso de los lisados celulares, triture varias veces para romper los grupos de células antes de comenzar la incubación y evitar la formación de burbujas.
Pulse brevemente el vórtice de cada muestra durante un segundo a mitad de la lisis. Después de eso, centrifugar las muestras a cuatro grados centígrados a 15.000 x g durante 20 minutos. A continuación, retire el sobrenadante.
Tenga cuidado de no alterar el pellet o la capa turbia, ya que esto contaminará la fracción. Pipetear el sobrenadante como fracción soluble en el tubo marcado con soluble y mantenerlo en hielo. Es clave realizar un seguimiento de los tampones de lisis solubles e insolubles.
Cambiar los tampones o colocar el tampón insoluble o las muestras en hielo será perjudicial para el resultado del protocolo. Lavar el pellet con 500 microlitros de tampón de lisis y centrifugar a cuatro grados centígrados a 15.000 x g durante cinco minutos. Repite el lavado una vez más.
Posteriormente, retire todo el tampón de lavado restante dejando solo el pellet de tejido. A continuación, vuelva a suspender el pellet con tampón de lisis complementado con 4%SDS. Sonicar cada muestra durante 30 segundos a temperatura ambiente con un sonicador de sonda.
Sonicar pequeños volúmenes durante un largo período de tiempo es un desafío técnico. Tenga cuidado de no perder ninguna muestra emulsionando o rociando mientras completa este paso. Después, hierve las muestras durante 30 minutos.
A continuación, centrifugarlos brevemente a 6.000 x g. Posteriormente, realice un ensayo de proteínas compatible con detergentes o un ensayo de proteínas de Lowry para medir la concentración de proteínas. A continuación, alícuota las muestras en lotes de 50 microlitros para evitar problemas de congelación/descongelación.
En este paso, realice Western blots diluyendo 30 microgramos de muestra en una proporción de uno a uno en tampón de carga. Hervir las muestras durante cinco minutos y centrifugarlas brevemente a 6.000 x g. A continuación, analice las fracciones por página SDS y Western blot.
Tiñe la membrana con tinción de proteína entera para visualizar la eficiencia de la carga de proteína. Aquí están las fracciones solubles e insolubles de los lisados de células HEK 293T resueltas en geles de página de 4-12% Bis-Tris y 3-8% de Tris-Acetato respectivamente. La fracción soluble normalizada al control de carga de GAPDH muestra una fluctuación del monómero soluble mutante del exón 1 de huntingtina en función de la exposición al inhibidor de la proteasa MG132.
La fracción insoluble muestra que las especies de huntingtina mutante de alto peso molecular también son moduladas por el tratamiento con MG132. Y aquí están las muestras de fracciones solubles e insolubles de lisados de células HeLA utilizando Western blot y análisis de retardo de filtro. Los datos muestran que la presencia de una isoforma SUMO sobreexpresada aumenta tanto la huntingtina mutante de alto peso molecular como la huntingtina mutante insoluble fibrilar en la fracción insoluble.
Esta figura muestra la regulación de la acumulación de huntingtina mutante de alto peso molecular después de modular un potencial terapéutico en el fraccionamiento insoluble de células HeLa sobre la expresión del exón 1 de huntingtina 97Q. La diana terapéutica PIAS1 se silenció con un siRNA hacia PIAS1 o se sobreexpresó. Las fracciones insolubles de estriados de ratón tratadas con microARN contra PIAS1 y resueltas en geles de página de acetato de tris al 3-8% muestran modulación de la huntingtina insoluble de alto peso molecular.
No olvide que trabajar con NEM puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como usar una mascarilla mientras se realiza este protocolo. Una vez dominada, esta técnica desde el lisado hasta el final del fraccionamiento se puede realizar en unas tres o cuatro horas, dependiendo del número de muestras. Se debe permitir una hora adicional para la cuantificación de proteínas y la alícuota.
Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la electroforesis en gel de agarosa o el retardo del filtro para detectar oligómeros solubles o fibrillas insolubles respectivamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y resolver proteínas insolubles mal plegadas para el análisis cuantitativo.
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Resumen
Este artículo describe un método para fraccionar especies de huntingtina mutante insolubles y solubles a partir del cerebro de ratón y cultivos celulares. La técnica contribuye a la caracterización y cuantificación del flujo de la proteína huntingtina, lo que favorece el análisis de la homeostasis proteica en la enfermedad de Huntington y otras enfermedades neurodegenerativas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Bioquímica
- Enfermedades neurodegenerativas
Antecedentes
- La proteína huntingtina está implicada en la enfermedad de Huntington.
- Comprender la homeostasis proteica es fundamental para la patogénesis de la enfermedad.
- El mal plegamiento de proteínas es una característica común en diversas enfermedades neurodegenerativas.
- Este método también puede aplicarse para estudiar las enfermedades de Parkinson y Alzheimer.
Objetivo del estudio
- Proporcionar una herramienta para la visualización y cuantificación del flujo de la proteína huntingtina.
- Analizar la homeostasis proteica en sistemas modelo de la enfermedad de Huntington.
- Evaluar el impacto de intervenciones terapéuticas sobre la progresión de la enfermedad.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de especies proteicas solubles e insolubles.
- Preparación del tampón de lisis con inhibidores adecuados.
- Análisis cuantitativo del flujo proteico.
- Aplicación del método a diversos modelos de enfermedades neurodegenerativas.
Resultados principales
- El método permite el aislamiento eficaz de especies de la proteína huntingtina.
- El análisis cuantitativo revela información sobre la homeostasis proteica.
- Los hallazgos contribuyen a comprender los mecanismos de la enfermedad.
- La técnica muestra potencial para aplicaciones más amplias en enfermedades por mal plegamiento de proteínas.
Conclusiones
- Este método es una herramienta valiosa para estudiar la enfermedad de Huntington.
- Mejora la comprensión de la dinámica de las proteínas en la neurodegeneración.
- Las aplicaciones futuras podrían extenderse a otras enfermedades relacionadas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite a los equipos de I+D biofarmacéutica resolver cuantitativamente especies solubles e insolubles de huntingtina mutante, proporcionando una comprensión mecanicista de la homeostasis proteica en modelos de la enfermedad de Huntington. Al aislar agregados de alto peso molecular relevantes para la enfermedad que se correlacionan con indicadores fenotípicos y modulación terapéutica, este enfoque apoya la validación de objetivos y la reducción de riesgos en estrategias de modulación de HTT. Ofrece un flujo de trabajo trasladable aplicable en cultivos celulares, tejidos y otros contextos de enfermedades neurodegenerativas, mejorando la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar el flujo de especies mutantes de HTT para aclarar los mecanismos patogénicos y validar HTT como diana terapéutica.
- Valor operativo: Proporciona lecturas cuantitativas de los compartimentos solubles e insolubles de HTT para evaluar la interacción con la diana y la modulación de la vía.
- Valor predictivo: Facilita la selección de proyectos al vincular los cambios bioquímicos en las especies de HTT con la progresión de la enfermedad y la respuesta terapéutica.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Preparación para ensayos: Genera fracciones solubles e insolubles estandarizadas adecuadas para ensayos posteriores como inmunotransferencia, retención en filtro o detección de oligómeros.
- Resultado cuantitativo: Permite la medición precisa de la concentración de especies de HTT mediante ensayos proteicos compatibles con detergentes, lo que apoya análisis de respuesta a la dosis y estudios temporales.
- Reproducibilidad: Pasos definidos de lisis, centrifugación y lavado garantizan una fraccionamiento consistente entre diferentes tipos de muestras, facilitando la transferencia del ensayo y su uso en diferentes aplicaciones.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Aísla especies de HTT de alto peso molecular que se correlacionan con el comportamiento de los ratones y que son moduladas por intervenciones terapéuticas, permitiendo la vinculación entre fenotipo y mecanismo.
- Continuidad traslacional: Facilita la progresión desde modelos in vitro hasta la validación en tejidos, alineando los hallazgos de descubrimiento con evaluaciones de eficacia preclínica.
- Reducción de riesgos mecanicistas: Aclara si las intervenciones afectan a monómeros solubles, oligómeros o agregados insolubles, reduciendo la ambigüedad en el mecanismo de acción.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la fase temprana del descubrimiento, permitiendo la comprobación de hipótesis sobre estrategias de ataque al HTT antes de la identificación de compuestos líder y de la validación preclínica, mediante lecturas cuantitativas basadas en fraccionamiento de la homeostasis proteica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la investigación mecanicista de las vías de procesamiento, agregación y eliminación de HTT en modelos de enfermedad.
- Tamizaje: Prepara fracciones bioquímicamente definidas para tamizaje confiable de compuestos frente a especies solubles o insolubles de HTT.
- Análisis: Proporciona datos cuantitativos de concentración proteica y de inmunotransferencia para comparar los niveles de especies de HTT entre diferentes condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta la fraccionamiento de HTT basado en células y tejidos con lecturas conductuales y patológicas en modelos preclínicos.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para estudiar el plegamiento incorrecto de proteínas en modelos de enfermedades de Huntington, Parkinson y Alzheimer.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en el objetivo al resolver las contribuciones específicas de las especies de HTT a la patogénesis y a la respuesta terapéutica.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante protocolos estandarizados de lisis, fraccionamiento y cuantificación de proteínas.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al vincular la modulación del objetivo con cambios medibles en los agregados de HTT relevantes para la enfermedad.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos que reduzcan la expresión de HTT o modulen la agregación, basándose en la reducción de especies insolubles.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en bioquímica de proteínas, técnicas de fraccionamiento y análisis mediante inmunotransferencia (western blot).
- Depende del acceso a una centrífuga, un sonicador y reactivos compatibles, incluyendo SDS e inhibidores de proteasas.
- Necesita protocolos estandarizados entre los equipos para prevenir la contaminación cruzada de tampones y garantizar la pureza de los fraccionamientos.
- Debe tener en cuenta la variabilidad en la eficiencia de homogenización de tejidos y en la eficiencia de sonicación al escalar entre diferentes modelos.
- Está limitado por la necesidad de un manejo cuidadoso para evitar la pérdida de muestra durante los pasos de sonicación y resuspensión, especialmente con volúmenes pequeños.
