Name: Cultivo de células epiteliales del pigmento retiniano en un modelo Ex Vivo de la membrana de Bruch humano envejecido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprenda a cultivar células epiteliales del pigmento retiniano sobre membrana de Bruch humana envejecida en un modelo ex vivo. Este método permite estudiar el comportamiento celular en degeneración macular relacionada con la edad.

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Esta investigación es apoyada por la investigación para prevenir la ceguera, Nueva York, www.rpbusa.org y el mayor centro de Nueva York para retina degenerativa enfermedad Fundación lucha contra la ceguera, www.blindness.org. Los autores desean agradecer a Luanna Bartholomew, pH.d., por su revisión crítica de este manuscrito.

El siguiente protocolo se realiza en adhesión a los principios de la declaración de Helsinki y las pautas de Yale Universidad Comité de ética de investigación humana.
1. abastecimiento de donante humano de ojos
<ol><li>Obtener globos de donante humano del nacional la enfermedad investigación intercambio (NDRI, Philadelphia, PA). Según el proyecto, preparar no menos de tres pares de ojos de donantes para cada grupo experimental.</li>
	<li>Enuclear ojos donantes dentro de las 10 h y dentro de 48 h postmortem. Luego el transporte los ojos al laboratorio modificado Eagle medio (DMEM) medio estéril de Dulbecco de cultivo en el hielo. Previamente reportados estudios han demostrado que ojos donantes cosechan y transportaron en esta manera de preservar las características biológicas y las actividades de la membrana de25,26,29 de Bruch.</li>
</ol>2. cosecha de la membrana de Bruch humano de explantes
<ol><li>Lugar cada ojo en una gasa de 1.5 x 1.5 pulgadas empapado con medios DMEM de dióxido de carbono-independiente en una placa de cultivo de 100 mm y uso tijeras de hoja fina para hacer una incisión a través de la esclera 3 mm posterior al limbus y circunferencial que se extiende en cualquier dirección.</li>
	<li>Hacer una incisión circunferencial de espesor total (penetrar a vítreo) 1 mm posterior a la ora serrata. Retire y deseche el segmento anterior (córnea, lente y diafragma), el vítreo y la retina.</li>
	<li>Utilice tijeras quirúrgicas finas para hacer cuatro incisiones radiales entre la esclerótica y la coroides y luego pelar la esclerótica de la periferia del nervio óptico, mientras que teniendo cuidado para evitar rasgar la membrana de la coroides/Bruch complejo.</li>
	<li>A continuación, haga una incisión circunferencial a través del espacio Supracoroideo a lo largo de la ora serrata y pelar complejo de coroides membrana de Bruch de la RPE posterior de la esclera.</li>
	<li>Eliminar las células RPE nativas bañándose el explante con hidróxido de amonio de 0.02 M en tamponada con fosfato solución salina de Dulbecco (DPBS) en un poliestireno de 60 x 15 mm placa de Petri por 20 min a temperatura ambiente, seguido de lavado tres veces en DPBS (figura 1).</li>
	<li>Flotador de explante complejo de membrana de Bruch en medios libres de dióxido de carbono sobre una membrana de 65 μm de espesor politetrafluoetileno artificia, hidrofóbico con 0,2 μm los poros, con la capa de lámina basal de cada explante hacia la membrana.</li>
	<li>Colocar una membrana de politetrafluoroetileno con explante de la membrana de Bruch en un soporte de vidrio sinterizado en un sistema de soporte de filtro de vacío de vidrio microanálisis.</li>
	<li>Aplane los bordes rizados desde la coroides con fórceps fino recubierto con Teflon, teniendo cuidado de no para tocar el lado de basal laminina la membrana de Bruch.</li>
	<li>Calentar 15 mL de agarosa (4% en DPBS) y luego enfriarlo a 37 ° C. Entonces verter 15 mL de gel liquidized en complejo de coroides membrana de Bruch de la coroides a lado mientras se aplica una succión suave para garantizar que el explante se mantendrá plana. Mantener el tejido en 4 ° C durante 2-3 min solidificar la agarosa y luego pelar a la membrana de politetrafluoretileno.</li>
	<li>Coloque el explante de la membrana de Bruch (1.5 pulgadas de diámetro, en gel de agarosa solidificada) en una placa de cultivo de células de poliestireno 60 x 15 mm (con la membrana de Bruch hacia arriba) que ha sido alineada con agarosa líquida caliente en la parte inferior de la placa para fijar la membrana de Bruch explante en el fondo del pozo con la capa basal laminina de explante hacia arriba.</li>
	<li>La agarosa se solidifique dentro de 2-3 minutos a temperatura ambiente para estabilizar explantes de la membrana de Bruch en la placa de cultivo. Cubierta de la membrana de Bruch de explantes en la cultura plato con DPBS y guardar la placa a 4 ° C para su uso futuro. Figura 2A muestra que la membrana de Bruch aislado de explantes en una placa de cultivo de 60 x 15 mm.</li>
	<li>Si el sistema de cultivo deseado está en una placa de 96 pocillos, coloque el explante de la membrana de Bruch (1.5 pulgadas de diámetro, con gel de agarosa solidificada) en una hoja de teflón plana con el lado de laminina arriba.</li>
	<li>Utilizando un trépano, corte cinco o seis, 6 mm-circular botones de membrana de Bruch complejo explantación y coloque cada uno en agarosa al 4% a 37 ° C en un poliestireno no trata de una placa de 96 pocillos. La agarosa se solidifique dentro de 2-3 minutos a temperatura ambiente para fijar explantes de la membrana de Bruch (botones) en la parte inferior de cada pocillo. Nota: La figura 2B muestra botones de membrana de Bruch allograft en una placa de 96 pocillos. Por lo general, 9-11 botones o explantes se pueden cosechar desde cada ojo.</li>
</ol>3. cultivo de células de pigmento retiniano epitelial (RPE) en la membrana de Bruch humano explantes
<ol><li>Tras la recepción de los ojos del donante, limpiar el tejido extraocular con DPBS. Haga una incisión circunferencial 5 mm por debajo de la esclerótica iris toque punto (pars plana) en el espacio subretinal. Descartar el segmento anterior, el humor vítreo y la retina.</li>
	<li>Lave el ocular, que contiene la membrana de Bruch y la hoja de RPE, con DPBS frío. Disociar las células RPE con 5 mL de tripsina 0.25% durante no más de 10 minutos para cada muestra de ojo. Calmar la reacción de la tripsina con 25 mL de medio completo DMEM con 15% suero bovino fetal (FBS) calentado a 37 ° C en un tubo de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar las células a 200 x g durante 10 minutos a 24 ° C y resuspender el precipitado en 5 mL de medio completo DMEM (con 15% FBS).</li>
	<li>Contar las células y 15.000 células RPE viables sobre la lámina basal de membrana explantes de cada varios años Bruch (botones) en una placa de 96 pocillos en 200 μL de medios libre de suero mínimos esenciales (MEM) que contengan antibióticos de la semilla (100 UI/mL de penicilina G, 100 mg / estreptomicina de mL gentamicina 5 mg/mL y 2.5 mg/mL de anfotericina B). Asumiendo un diámetro celular de 20 μm, chapado en esta densidad permitirá a las células RPE cubrir aproximadamente el 15% de la superficie de galjanoplastia.</li>
	<li>Placa las células hasta el botón, por el que la densidad celular se puede entonces aumentar paso a paso para arriba a confluencia 100% dependiendo del efecto de cada parámetro en el comportamiento de la célula.</li>
	<li>Permitir a las células a explante durante 24 h en una atmósfera humidificada de 95% air/5% CO2 a 37 ° C. Suavemente cambiar medio DMEM completo caliente.</li>
</ol>

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<li>Ho, T. C., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reattachment+of+cultured+human+retinal+pigment+epithelium+to+extracellular+matrix+and+human+Bruch%27s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophth.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Reattachment of cultured human retinal pigment epithelium to extracellular matrix and human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 38 (6), 1110-1118 (1997).</li>
<li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reattachment+to+a+substrate+prevents+apoptosis+of+human+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Graefes+Arch.+Clin.+Exp.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Reattachment to a substrate prevents apoptosis of human retinal pigment epithelium.</a> Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. 235 (1), 41-47 (1997).</li>
<li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF+beta+secretion+modulates+the+density-dependent+growth+of+pig+retinal+pigment+epithelium+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">TGF beta secretion modulates the density-dependent growth of pig retinal pigment epithelium in vitro.</a> Ophthalmic Res. 31 (3), 192-202 (1999).</li>
<li>Gullapalli, V. K., Sugino, I. K., Van Patten, Y., Shah, S., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+RPE+survival+on+aged+submacular+human+Bruch%27s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Impaired RPE survival on aged submacular human Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 80 (2), 235-248 (2005).</li>
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<li>Tezel, T. H., Del Priore, L. V., Kaplan, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reengineering+of+aged+Bruch%27s+membrane+to+enhance+retinal+pigment+epithelium+repopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophth.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Reengineering of aged Bruch's membrane to enhance retinal pigment epithelium repopulation.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 45 (9), 3337-3348 (2004).</li>
<li>Castellarin, A. A., Sugino, I. K., Vargas, J. A., Parolini, B., Lui, G. M., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+transplantation+of+fetal+human+retinal+pigment+epithelial+cells+onto+human+cadaver+Bruch%27s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro transplantation of fetal human retinal pigment epithelial cells onto human cadaver Bruch's membrane.</a> Exp. Eye Res. 66 (1), 49-67 (1998).</li>
<li>Nguyen, H. V., Li, Y., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+iPSC-derived+RPE+for+modeling+of+retinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Med%22%5BJournal%5D)">Patient-specific iPSC-derived RPE for modeling of retinal diseases.</a> J. Clin. Med. 4 (4), 567-578 (2015).</li>
<li>Fletcher, E. L., Jobling, A. I., Greferath, U., Mills, S. A., Waugh, M., Ho, T., De Longh, R. U., Phipps, J. A., Vessey, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+age-related+macular+degeneration+using+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Optometry+Vision+Sci%22%5BJournal%5D)">Studying age-related macular degeneration using animal models.</a> Optometry Vision Sci. 91 (8), 878-886 (2014).</li>
<li>Del Priore, L. V., Tezel, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reattachment+rate+of+human+retinal+pigment+epithelium+to+layers+of+human+Bruch%27s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Reattachment rate of human retinal pigment epithelium to layers of human Bruch's membrane.</a> Arch. Ophthalmol. 116 (3), 335-341 (1998).</li>
<li>Tezel, T. H., Kaplan, H. J., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+human+retinal+pigment+epithelial+cells+seeded+onto+layers+of+human+Bruch%27s+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophth.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Fate of human retinal pigment epithelial cells seeded onto layers of human Bruch's membrane.</a> Invest. Ophth. Vis. Sci. 40 (2), 467-476 (1999).</li>
<li>Cai, H., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruch+membrane+aging+alters+the+gene+expression+profile+of+human+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Bruch membrane aging alters the gene expression profile of human retinal pigment epithelium.</a> Curr. Eye Res. 31 (2), 181-189 (2006).</li>
<li>Moreira, E. F., Cai, H., Tezel, T. H., Fields, M. A., Del Priore, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reengineering+human+Bruch%27s+membrane+increases+rod+outer+segment+phagocytosis+by+human+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Transl.+Vis.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Reengineering human Bruch's membrane increases rod outer segment phagocytosis by human retinal pigment epithelium.</a> Transl. Vis. Sci. Technol. 4 (5), 10(2015).</li>
<li>Sun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruch%27s+membrane+aging+decreases+phagocytosis+of+outer+segments+by+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Bruch's membrane aging decreases phagocytosis of outer segments by retinal pigment epithelium.</a> Mol. Vis. 13, 2310-2319 (2007).</li>
</ol>

Ninguno de los autores tienen ninguna divulgación comercial a declarar.

Membrana de Bruch humano envejecido (matriz extracelular) contribuye a la progresión de la enfermedad de AMD y por lo tanto es necesario entender cómo esta matriz alterada contribuye a la disfunción de las células RPE. Debido a la falta de suficientes modelos animales para estudiar los cambios relacionados con la edad en AMD, ex vivo sistemas modelo que imitan los efectos de la enfermedad pueden servir como una herramienta valiosa para entender la patofisiología. La metodología descrita en este manuscrito puede utilizarse para aislar sistemáticamente humano explantes de la membrana de Bruch y cultura RPE células, incluyendo líneas de células RPE primarias, inmortalizadas o derivados de células madre.
Como se mencionó anteriormente, explantes de la membrana de Bruch humana provienen de la NDRI. Se establece un protocolo con NDRI que especifica los criterios para que los ojos del donante aceptable. Por ejemplo, los donantes no deben tener ninguna enfermedades de la retina conocidas, globos de ojos se recuperan dentro de las 10 h después de la muerte y globos llegan en el laboratorio dentro de las 48 h después de la muerte (vía entrega de paquete durante la noche en el hielo). Especificar el rango de edad apropiado y el número de ojos es necesario para el análisis estadístico del estudio, por ejemplo., cinco pares de globos de donantes entre las edades de 20 a 49 años y cinco pares de globo de donantes entre las edades de 50-89 años.
La disponibilidad de los globos del ojo varía, generalmente con un promedio de diez pares de globos disponibles cada mes. El paquete de ojos llega con información básica, anónima donante: edad, raza, tiempo de la muerte, causa de la muerte y breves antecedentes médicos (listado de enfermedades o comorbilidades).
Lo más importante, cosecha de explantes de la membrana de Bruch humana requiere la remoción del segmento anterior del ojo y del vítreo, lo que permite el aislamiento del complejo de coroides membrana de Bruch de la RPE. Una vez aislada la membrana de Bruch, células RPE pueden ser sembradas en los explantes acelulares en concentraciones variables y cultivadas para experimentos posteriores. La preparación y el manejo del procedimiento como se describe en este documento es crítica, prestando atención a la orientación de la membrana de Bruch aislado para asegurarse de que la superficie laminal es hacia arriba mientras no toquen la superficie mecánicamente para evitar daños en el estructura superficial de la matriz extracelular.
También cabe señalar que al utilizar sistemas de explante de la membrana de Bruch, hay algunas variables que podrían afectar los resultados de experimentos posteriores como fondo genómico de donantes individuales, edad de la membrana de Bruch o tiempo post mortem de la Bruch membrana y la localización de la membrana de Bruch, es decir., central o periférica parte de explantes de la membrana de Bruch. Como con cualquier otro estudio de tejidos humanos, uno debe reclutar el número de muestra del ojo donante apropiado para tener la potencia estadística necesaria y coincide con edad de ojo donante si es apropiado. El establecimiento de criterios para la aceptación de ojos a partir de bancos de ojos es un parámetro crítico. Sólo se aceptan ojos que son anucleadas post mortem menos de 10 h y preparación de la membrana de Bruch se puede cosechar dentro de las 24-48 h después de la muerte. El sitio del nervio óptico puede ser utilizado como un marcador para la orientación y utilizar los mismos lugares de experimental y control de grupos de estudio. Al tomar estas medidas, uno puede minimizar la variabilidad experimental.
En Resumen, comprensión de la RPE-Bruch complejo membrana coroides y cómo es afectado por la edad y la enfermedad es fundamental para entender su contribución a la fisiopatología de la DMAE. Modelo de los sistemas que emplean técnicas ex vivo es una herramienta valiosa para investigar estos efectos utilizando tejido humano. Adjunto, describimos a una metodología que emplea explantes de donante humano como modelo de membrana de Bruch de relevantes ex vivo . Esta técnica permite utilizar membrana de Bruch humano enfermo o envejecido como herramienta de investigación para investigar cómo los cambios estructurales dentro de la matriz puede afectar superponer RPE comportamiento celular como accesorio, la proliferación y la gene expresión25 , 27. desarrollo exitoso de ex vivo modelo sistemas similares será mejorar nuestra comprensión de la DMAE y facilitar el desarrollo de nuevas opciones terapéuticas.

Relacionadas con la edad cambios estructurales en la membrana de Bruch humana, que es causada por muchos factores, incluyendo nitrosativo y oxidativo, ejerce múltiples efectos deletéreos sobre la función del pigmento retiniano epitelial (RPE) de las células y contribuye a la patología de la degeneración macular senil (DMS)1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Cuando se considera la terapia de reemplazo celular para avanzadas DMAE atrófica o atrofia geográfica, tratamiento requerirán el trasplante de células en una cama de la atrofia de células RPE. Cambios relacionados con la edad dentro de la membrana de Bruch humano pueden afectar negativamente el éxito de trasplantado injertos de células RPE, dado el daño a la matriz extracelular6,9,10,11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22. humanos investigando biología de membrana de Bruch y cómo los cambios estructurales en la matriz de contribuyan a la progresión de AMD es vital para entender la patología de la enfermedad. Así, hay una necesidad crítica de los investigadores en el campo del ojo relacionada con la edad para desarrollar protocolos que describen la cosecha ex vivo de la membrana de Bruch humano enfermo o envejecido.
Históricamente, ha sido difícil a modelo edad-trastornos relacionados con la atrofia geográfica como membrana de un anciano humano Bruch en animales23. Esta dificultad surge de múltiples factores incluyendo la longevidad de los seres humanos en comparación con roedores y otras especies utilizadas para el modelado de la enfermedad, así como la falta de una mácula en la mayoría vertebrados24. La ventaja del método descrito aquí es que las células se pueden probar directamente en la membrana de Bruch extraída de post mortem ojos de las personas mayores o enfermas. El objetivo general de este artículo es proporcionar una metodología detallada para un modelo ex vivo de la membrana de Bruch humano enfermo o envejecido, incluyendo el aislamiento de humano Bruch membrana explantes de donantes humanos y el sembrador de RPE células para experimentos posteriores. Este modelo puede servir como un modelo relevante para investigar la contribución de daño de matriz extracelular en RPE células función y patología20,25,26,27,28.

<table><tbody><tr><td>Globos de donantes humanos</td><td>Intercambio Nacional de Investigación de Enfermedades, NDRI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Medios independientes de dióxido de carbono</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18045-088</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de poliestireno de 60 mm</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td>solución</tr><tr><td>salina tamponada con fosfato de 351007 Dulbecco, PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic 65 &micro; membrana de politetrafluoroetileno de espesor m con 0,2 y micro; m poros</td><td>Merck Millipore</td><td>JGWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand sistema de soporte de filtro de vacío de microanálisis de vidrio&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-753-102</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576-5G</td><td></td></tr><tr><td>35 &times; plato de cultivo de 10 mm</td><td>VWR International</td><td>25373-041</td><td></td></tr><tr><td>Trephine</td><td>Accutome</td><td>AM0570 60</td><td></td>Placa</tr> de <tr><td>96 pocillos</td><td>Corning Inc.</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Medios esenciales mínimos (MEM)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11095-080&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032-1MU</td><td></td></tr><tr><td>Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1914</td><td></td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1397-89-3</td><td></td></tr><tr><td>Solución de hidróxido de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1336-21-6 &nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

cultivo de células epiteliales del pigmento retiniano en un modelo ex vivo de la membrana de bruch humano envejecido

Culturing of Retinal Pigment Epithelial Cells on an Ex Vivo Model of Aged Human Bruch's Membrane

Aparte de vitaminas y antioxidantes recomendados por el estudio de la enfermedad de ojo asociada, no hay ningún tratamiento eficaz para la "seca" o atrófica relacionada con la edad degeneración macular (AMD) que representa el 90% de los casos. Las terapias son necesarias para reducir o retardar el desarrollo de atrofia geográfica (GA), y entender la patología de la membrana de Bruch es parte de este proceso. Alteraciones en la membrana de Bruch humano preceden la progresión de la DMAE, contribuyendo al daño del pigmento retiniano epitelial (RPE) las células. Debido a la falta de suficientes modelos animales para el estudio de AMD, modelos ex vivo de la membrana de Bruch humana de servir como una herramienta útil para estudiar el comportamiento de las células RPE de inmortalizó y líneas de células primarias, así como líneas RPE derivan de tallo pluripotentes inducidas células (iPSCs). Aquí, presentamos un método detallado que permite determinar los efectos del comportamiento de células RPE sembradas en explantes de membrana de Bruch humanos cosechados de donantes humanos, incluyendo fijación, apoptosis y proliferación, capacidad fagocitan externo de fotorreceptor segmentos, establecimiento de la polaridad y expresión génica. Este ensayo proporciona un modelo ex vivo de la membrana de Bruch de evaluar las características funcionales de las células RPE cuando sembradas en matriz extracelular edad/comprometido.

Cuando este protocolo se realiza correctamente, uno puede determinar los efectos de la membrana de Bruch humano enfermo o envejecido en función de las células RPE por el establecimiento de la polaridad y la barrera retiniana exterior sangre, polarizado la secreción de factores de crecimiento y citoquinas, y la fagocitosis de los segmentos externo de fotorreceptor rod.
Hemos generado datos que muestran un fenotipo de la enfermedad en membrana de Bruch humano envejecido. Por ejemplo, cultivo de células RPE en edad membrana explantes disminuye RPE células el reacoplamiento de humana Bruch (figura 3). Las células RPE cultivadas sobre membrana de Bruch humano edad disminuye la capacidad de estas células fagocitan segmentos de barras externo (ROS), una función crítica de la RPE (figura 4). Por otra parte, las células apoptotic pueden identificar y comparadas en estos explantes de botón mediante una terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick etiquetado final (TUNEL) Mancha como se describe en el anterior trabajo26. Los efectos de un anciano o enfermo humano de membrana de Bruch en el perfil de expresión de gene de celular RPE pueden ser determinados mediante la tecnología de microarrays. Hemos demostrado que genes de células RPE se alteración cuando se cultivan en la membrana de Bruch humana de individuos de edad avanzada en comparación con explantes de jóvenes individuos (figura 5)27. Para el análisis estadístico, se utilizan explantes de donantes humanos de al menos 3-5 por grupo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2.jpg"> Figura 1. Representación esquemática del aislamiento de la membrana de Bruch humano de ojos donantes. Las membranas humanas de Bruch se cosechan mediante la eliminación de la esclera, segmento anterior, retina, vítreo, y células epiteliales (RPE) del pigmento retiniano nativo. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig2.jpg"> Figura 2. Aislado de la membrana de Bruch humano (BM) en un plato de cultura. (A) esquema de los explantes de la membrana de Bruch humana (cada 1,5 pulgadas de diámetro, con gel de agarosa solidificada) colocado en un 60 × 15 mm poliestireno celular placa de cultivo (BM boca arriba) con agarosa líquida caliente en el fondo del plato. (B) explante de membrana de un humano Bruch que ha sido allograft en unos botones circulares de 6 mm (explantes), cada ow que entonces colocaron en agarosa al 4% a 37 ° C en un poliestireno no trata de una placa de 96 pocillos. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig3.jpg"> Figura 3. Tarifa de reconexión en la membrana de Bruch humano joven y mayores (BM) de la célula del pigmento retiniano epitelial (RPE). Las células RPE primarias fueron sembradas en la membrana de Bruch de explantes de jóvenes humanos (&lt; 50 años de edad, n = 3) o más (&gt; 70 años de edad, n = 5) ojos de donantes durante tres semanas. Tipo de accesorio de celular fue medida por análisis de viabilidad de la célula MTT. Membranas de Bruch humano mayores redujeron la tasa de accesorio de celular RPE en un 24% (jóvenes BM 100 +-8.54 S.E. vs mayores 76.65 BM +-1,44 S.E.). p &lt; 0.05, S.E. = error estándar.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig4.jpg"> Figura 4. La fagocitosis de epiteliales de pigmento retiniano (RPE) de la célula se ve afectada por la edad de la membrana de Bruch humano (BM). Las células RPE primarias cultivadas mayores humanos explantes de la membrana de Bruch tenían una capacidad reducida a fagocitan segmentos de barras externo (ROS) (873 jóvenes de BM +-9.3 S.E., n = 5 vs mayores BM 608 +-25.4 S.E., n = 5). p &lt; 0.01, S.E. = error estándar.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57084/57084fig5.jpg"> Figura 5. Número de retiniano del pigmento epitelial (RPE) celular los genes expresados en cada muestra que se cultiva en los jóvenes o explantes de la membrana de Bruch humano mayores. Había más dispersión en el número de genes expresados en las células RPE primarias sembradas a mayor frente a la membrana de Bruch humano más joven (6201 ± 388 vs 6439 ± 80, respectivamente); cinco explantes fueron probados para cada grupo de edad. Presentado con el permiso completo de todos los autores de Cai, H et al. 27. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57084/57084fig5large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

El objetivo de este protocolo es demostrar que el cultivo del pigmento retiniano epitelial (RPE) células en membrana de Bruch humano enfermo o envejecido. Este método es adecuado para el estudio de comportamiento de células RPE en matriz extracelular comprometida.

Cultivo de células epiteliales del pigmento retiniano en un modelo Ex Vivo de la membrana de Bruch humano envejecido

Aside from vitamins and antioxidants recommended by the Age-Related Eye Disease Study, there is no effective therapy for &#34;dry,&#34;&#160;or atrophic ...

El objetivo general de este procedimiento experimental es crear una matriz extracelular ex vivo conocida como sistema de cultivo de membrana de Bruch, para observar el efecto de la membrana de Bruch sobre las células epiteliales pigmentarias de la retina superpuestas. Este método podría ayudar a responder preguntas clave en la subbiología del EPR en el campo de la etiología de la DMAE, como si los cambios en las membranas de Bruch envejecidas contribuyen al mal funcionamiento de las células del EPR superpuestas. La principal ventaja de esta técnica es que permite a los investigadores aislar la membrana de Bruch nativa de un ojo de donante humano de diferentes edades y utilizarla para el estudio proteómico en cultivos celulares de EPR.Aislar la membrana de Bruch y crear un sistema de cultivo vivo real con un daño mínimo a la membrana de Bruch nativa es un desafío, pero le mostraré cómo en este video. Para empezar, coloque una gasa de 1,5 pulgadas cuadradas empapada en DMEM independiente del CO2 en un plato de 100 milímetros. A continuación, cargue el globo ocular en la gasa.A continuación, utilice una cuchilla quirúrgica para hacer una incisión a través de la esclerótica tres milímetros después del limbo. Luego, use unas tijeras de hoja fina para hacer una incisión de espesor completo y extienda circunferencialmente la incisión en cualquier dirección alrededor del ojo. Luego, retire y deseche el segmento anterior, incluida la córnea, el cristalino y el iris.Además, deseche el vítreo y la retina. A continuación, retire con cuidado el complejo coroideo de la membrana de Bruch del EPR de la esclerótica desde la periferia hasta el nervio óptico utilizando una espátula recubierta de teflón. Esto debe hacerse con mucho cuidado para no desgarrar el complejo de membranas.Ahora, use unas tijeras quirúrgicas finas para hacer cuatro incisiones radiales en la esclerótica y despegar la esclerótica. A continuación, se corta el explante de coroides de la membrana de Bruch del nervio óptico y se transfiere este explante a una placa de 60 milímetros que contiene hidróxido de amonio 0,02 molar en DPBS. Para eliminar las células nativas del EPR, incube este explante durante 20 minutos a temperatura ambiente.Después de la incubación, lave el explante tres veces con DPBS asegurando el sitio del nervio óptico en la membrana de Bruch con pinzas recubiertas de teflón mientras fluye la solución alrededor del tejido. A continuación, haga flotar el explante, con el lado de la laminina hacia arriba, en un medio libre de dióxido de carbono. Realice cuatro incisiones en la membrana de Bruch y luego transfiera una membrana de PTFE hidrófoba sin laminar de 65 micras de espesor con poros de 0,2 micras sobre el explante.Colóquelo con la lámina basal contra la membrana de PTFE. Retire el exceso de líquido en el plato, luego transfiera el conjunto a un sistema de soporte de filtro al vacío de microanálisis de vidrio donde debe asentarse sobre un soporte de vidrio fritado. A continuación, evitando cuidadosamente el contacto con la lámina basal, aplanar los bordes curvados del lado coroideo con pinzas recubiertas de teflón.Ahora, licúa 15 mililitros de 4% de agarosa en DPBS y enfría a 37 grados centígrados. Luego, vierta lentamente la agarosa sobre el lado coroideo del explante mientras aplica una succión suave para mantenerlo plano. Una vez que el gel comience a solidificarse, transfiéralo con la membrana a un plato de 60 milímetros con hielo.Deje que el gel se solidifique durante dos o tres minutos y luego retire la membrana de PTFE. A continuación, sumerja el explante en DPBS y guárdelo a cuatro grados centígrados hasta que lo necesite. Al cultivar el explante en un plato de 60 milímetros forrado con 4% de agarosa líquida, coloque la membrana del Bruch hacia arriba.Al cultivar con una placa de 96 pocillos revestida de poliestireno, coloque el explante de membrana de Bruch recubierto de gel sobre una lámina plana de teflón con el lado de la laminina hacia arriba. Luego, con una trépana, corte de seis a ocho botones de seis milímetros del explante y transfiera los botones de tejido a pocillos cargados con agarosa líquida. Para comenzar, coloque el globo ocular sobre una gasa empapada en DPBS como antes.A continuación, haga una incisión circunferencial cinco milímetros por debajo del punto de contacto iris-esclerótica, la pars plana, en el espacio subretiniano. Descarta el segmento interior, el humor vítreo y la retina. A continuación, con una pipeta de transferencia, lave la copa del ojo con dos o tres mililitros de DPBS frío.En total, lave el ocular tres veces. Luego, para disociar las células del EPR, trate la copa del ojo con tripsina durante un máximo de 10 minutos. Luego, transfiera las células RPE tripsinizadas a un tubo de 50 mililitros y, para apagar la reacción, agregue 25 mililitros de medio con FBS a 37 grados Celsius.Ahora, centrifuga el tejido y la solución a 200 g durante 10 minutos a 24 grados centígrados. A continuación, vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de medio completo DMEM con 15% de FBS. Ahora, cuente las células y coloque 15.000 células EPR viables en 200 microlitros de medios esenciales mínimos sin suero que contengan antibióticos en cada botón de la membrana de Bruch en la placa de 96 pocillos.Cultive las células durante al menos 24 horas para su adhesión. Más tarde, cambie suavemente el medio para calentar el DMEM completo y continúe cultivando las células. Con este protocolo, las membranas de Bruch humanas envejecidas y enfermas pueden estudiarse cultivando células EPR en ellas.Por lo general, los explantes envejecidos disminuyen la reinserción de las células del EPR. Las células EPR cultivadas en membrana de Bruch humana envejecida también son menos capaces de fagocitar los segmentos externos de los bastones, una función crítica del EPR. Utilizando microarrays, se encontró que la expresión génica de las células RPE es diferente cuando las células se cultivan en la membrana de Bruch de individuos mayores en comparación con las células cultivadas en la membrana de individuos más jóvenes.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar la membrana de Bruch de los ojos de un donante humano y hacer explantes en los que se puedan cultivar células EPR. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente tres horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que no debe tocar el lado laminínico del explante de membrana de Bruch con herramientas de disección para evitar dañar la superficie.Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la fagocitosis del EPR y los estudios de expresión génica de las células del EPR, para responder a preguntas adicionales, como si una membrana de Bruch de un donante de edad variable o de donantes con degeneración macular relacionada con la edad afectará a las funciones de las células del EPR superpuestas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la degeneración macular relacionada con la edad exploraran el mecanismo en la etiología de la DMAE en un sistema modelo ex vivo de membrana de Bruch.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Ofrecemos un método reproducible para el cultivo de las monocapas confluentes de células fetales humanas del epitelio pigmentario de la retina (hfRPE) las células que presentan la morfología, la fisiología, la polaridad, y la proteína y los patrones de expresión génica del tejido nativo adulto. Este trabajo se ha extendido a un modelo animal de enfermedades de los ojos de varios.

Modelos experimentales para el estudio de la fisiología epiteliales del pigmento retiniano y fisiopatología

La identificación de proteínas específicamente asociadas con la membrana de Bruch en ojos humanos es un paso importante en la comprensión de los mecanismos bioquímicos detrás de las enfermedades oculares, como la degeneración macular relacionada con la edad. Este protocolo describe cómo enriquecer esta lámina de matriz extracelular para el análisis bioquímico posterior.

Enriquecimiento de la membrana de Bruch de Ojos donante humano

Las células epiteliales del pigmento retiniano podrían servir como una terapia de reemplazo celular para la forma avanzada de la degeneración macular seca relacionada con la edad. Este protocolo describe la generación de un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica y el transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivados de células madre embrionarias humanas en este modelo de la enfermedad.

Transplante subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano derivado de células madre embrionarias humanas en un modelo de grandes ojos de atrofia geográfica

El protocolo describe explantes organotípicos de ratón neuroretina,cultivados junto con su epitelio pigmentario retiniano (EPR), en medio definido R16, libre de suero y antibióticos. Este método es relativamente simple de realizar, menos costoso y lento en comparación con los experimentos in vivo, y se puede adaptar a numerosas aplicaciones experimentales.

A largo plazo, Cultivo Sin Suero De Explantes Organotípicos De La Retina De Ratón Con Epitelio Pigmento Retiniano Intacto

Este estudio tiene como objetivo desarrollar un nuevo modelo de cultivo de retina organotípico humano (HORC) que evite comprometer la integridad de la retina durante el manejo del explante. Esto se logra cultivando la retina con el vítreo resbanante y el epitelio-coroides pigmentario retiniano subyacente (RPE-coroides) y esclerótica.

Caracterización de una nueva técnica de cultivo de retina organotípica humana

Aquí, se presenta un protocolo para aislar y transfectar el iris primario y las células epiteliales pigmentarias de la retina de varios mamíferos (ratones, ratas, conejos, cerdos y bovinos). El método es ideal para estudiar los enfoques de terapia génica ocular en varias instalaciones para análisis ex vivo y estudios in vivo transferibles a humanos.

Aislamiento, cultivo e ingeniería genética de células epiteliales de pigmento primario de mamíferos para terapia génica no viral

Este protocolo, que fue reportado originalmente por Fernandez-Godino et al. en 20161,describe un método para aislar eficientemente y cultivo de células RPE del ratón, que forman una monocapa RPE funcional y polarizada dentro de una semana en las placas Transwell. El procedimiento dura aproximadamente 3 horas.

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Aislamiento de células primarias del epitelio pigmentado de la retina del ratón

Aquí, se presenta un método fácil de seguir para cultivar células epiteliales pigmentarias primarias de la retina porcina in vitro .

Cultivo primario de células epiteliales pigmentarias de la retina porcina

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) actúa como una barrera crucial entre la coroides y la retina, promoviendo la salud y la función de los tipos de células de la retina, como los fotorreceptores. En este trabajo se describe un protocolo sencillo y eficaz para el aislamiento y cultivo de EPR murino adulto.

Un método simplificado para el aislamiento y cultivo de células epiteliales pigmentarias de la retina de ratones adultos

Aprenda a cultivar células epiteliales del pigmento retiniano sobre membrana de Bruch humana envejecida en un modelo ex vivo. Este método permite estudiar el comportamiento celular en degeneración macular relacionada con la edad.

Cultivo de células epiteliales del pigmento retiniano en un modelo Ex Vivo de la membrana de Bruch humano envejecido

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