Cultivo de células epiteliales del pigmento retiniano en un modelo Ex Vivo de la membrana de Bruch humano envejecido

El objetivo general de este procedimiento experimental es crear una matriz extracelular ex vivo conocida como sistema de cultivo de membrana de Bruch, para observar el efecto de la membrana de Bruch sobre las células epiteliales pigmentarias de la retina superpuestas. Este método podría ayudar a responder preguntas clave en la subbiología del EPR en el campo de la etiología de la DMAE, como si los cambios en las membranas de Bruch envejecidas contribuyen al mal funcionamiento de las células del EPR superpuestas. La principal ventaja de esta técnica es que permite a los investigadores aislar la membrana de Bruch nativa de un ojo de donante humano de diferentes edades y utilizarla para el estudio proteómico en cultivos celulares de EPR.

Aislar la membrana de Bruch y crear un sistema de cultivo vivo real con un daño mínimo a la membrana de Bruch nativa es un desafío, pero le mostraré cómo en este video. Para empezar, coloque una gasa de 1,5 pulgadas cuadradas empapada en DMEM independiente del CO2 en un plato de 100 milímetros. A continuación, cargue el globo ocular en la gasa.

A continuación, utilice una cuchilla quirúrgica para hacer una incisión a través de la esclerótica tres milímetros después del limbo. Luego, use unas tijeras de hoja fina para hacer una incisión de espesor completo y extienda circunferencialmente la incisión en cualquier dirección alrededor del ojo. Luego, retire y deseche el segmento anterior, incluida la córnea, el cristalino y el iris.

Además, deseche el vítreo y la retina. A continuación, retire con cuidado el complejo coroideo de la membrana de Bruch del EPR de la esclerótica desde la periferia hasta el nervio óptico utilizando una espátula recubierta de teflón. Esto debe hacerse con mucho cuidado para no desgarrar el complejo de membranas.

Ahora, use unas tijeras quirúrgicas finas para hacer cuatro incisiones radiales en la esclerótica y despegar la esclerótica. A continuación, se corta el explante de coroides de la membrana de Bruch del nervio óptico y se transfiere este explante a una placa de 60 milímetros que contiene hidróxido de amonio 0,02 molar en DPBS. Para eliminar las células nativas del EPR, incube este explante durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Después de la incubación, lave el explante tres veces con DPBS asegurando el sitio del nervio óptico en la membrana de Bruch con pinzas recubiertas de teflón mientras fluye la solución alrededor del tejido. A continuación, haga flotar el explante, con el lado de la laminina hacia arriba, en un medio libre de dióxido de carbono. Realice cuatro incisiones en la membrana de Bruch y luego transfiera una membrana de PTFE hidrófoba sin laminar de 65 micras de espesor con poros de 0,2 micras sobre el explante.

Colóquelo con la lámina basal contra la membrana de PTFE. Retire el exceso de líquido en el plato, luego transfiera el conjunto a un sistema de soporte de filtro al vacío de microanálisis de vidrio donde debe asentarse sobre un soporte de vidrio fritado. A continuación, evitando cuidadosamente el contacto con la lámina basal, aplanar los bordes curvados del lado coroideo con pinzas recubiertas de teflón.

Ahora, licúa 15 mililitros de 4% de agarosa en DPBS y enfría a 37 grados centígrados. Luego, vierta lentamente la agarosa sobre el lado coroideo del explante mientras aplica una succión suave para mantenerlo plano. Una vez que el gel comience a solidificarse, transfiéralo con la membrana a un plato de 60 milímetros con hielo.

Deje que el gel se solidifique durante dos o tres minutos y luego retire la membrana de PTFE. A continuación, sumerja el explante en DPBS y guárdelo a cuatro grados centígrados hasta que lo necesite. Al cultivar el explante en un plato de 60 milímetros forrado con 4% de agarosa líquida, coloque la membrana del Bruch hacia arriba.

Al cultivar con una placa de 96 pocillos revestida de poliestireno, coloque el explante de membrana de Bruch recubierto de gel sobre una lámina plana de teflón con el lado de la laminina hacia arriba. Luego, con una trépana, corte de seis a ocho botones de seis milímetros del explante y transfiera los botones de tejido a pocillos cargados con agarosa líquida. Para comenzar, coloque el globo ocular sobre una gasa empapada en DPBS como antes.

A continuación, haga una incisión circunferencial cinco milímetros por debajo del punto de contacto iris-esclerótica, la pars plana, en el espacio subretiniano. Descarta el segmento interior, el humor vítreo y la retina. A continuación, con una pipeta de transferencia, lave la copa del ojo con dos o tres mililitros de DPBS frío.

En total, lave el ocular tres veces. Luego, para disociar las células del EPR, trate la copa del ojo con tripsina durante un máximo de 10 minutos. Luego, transfiera las células RPE tripsinizadas a un tubo de 50 mililitros y, para apagar la reacción, agregue 25 mililitros de medio con FBS a 37 grados Celsius.

Ahora, centrifuga el tejido y la solución a 200 g durante 10 minutos a 24 grados centígrados. A continuación, vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de medio completo DMEM con 15% de FBS. Ahora, cuente las células y coloque 15.000 células EPR viables en 200 microlitros de medios esenciales mínimos sin suero que contengan antibióticos en cada botón de la membrana de Bruch en la placa de 96 pocillos.

Cultive las células durante al menos 24 horas para su adhesión. Más tarde, cambie suavemente el medio para calentar el DMEM completo y continúe cultivando las células. Con este protocolo, las membranas de Bruch humanas envejecidas y enfermas pueden estudiarse cultivando células EPR en ellas.

Por lo general, los explantes envejecidos disminuyen la reinserción de las células del EPR. Las células EPR cultivadas en membrana de Bruch humana envejecida también son menos capaces de fagocitar los segmentos externos de los bastones, una función crítica del EPR. Utilizando microarrays, se encontró que la expresión génica de las células RPE es diferente cuando las células se cultivan en la membrana de Bruch de individuos mayores en comparación con las células cultivadas en la membrana de individuos más jóvenes.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar la membrana de Bruch de los ojos de un donante humano y hacer explantes en los que se puedan cultivar células EPR. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente tres horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que no debe tocar el lado laminínico del explante de membrana de Bruch con herramientas de disección para evitar dañar la superficie.

Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la fagocitosis del EPR y los estudios de expresión génica de las células del EPR, para responder a preguntas adicionales, como si una membrana de Bruch de un donante de edad variable o de donantes con degeneración macular relacionada con la edad afectará a las funciones de las células del EPR superpuestas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la degeneración macular relacionada con la edad exploraran el mecanismo en la etiología de la DMAE en un sistema modelo ex vivo de membrana de Bruch.