Name: Filamentos intermedios y microtúbulos con microscopía de reconstrucción óptica estocástica directo 2-dimensional de imágenes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Aprende a realizar imagenología dSTORM bidimensional de microtúbulos y filamentos intermedios en células U373 fijas. Esta técnica de superresolución permite visualizar interacciones citoesqueléticas no resueltas por microscopía convencional.

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Agradecemos a Mickael Lelek, Orestis Faklaris Nicolas Bourg para la discusión fructífera, Andrey Aristov y Elena Rensen para ayuda con la técnica de súper-resolución y Shailaja Seetharaman para la cuidadosa lectura del manuscrito. Agradecemos Citech UtechS Bioimagen fotónica (Imagopole) del Instituto Pasteur (París, Francia), así como la red de infraestructuras de Bioimagen Francia apoyada por la agencia francesa de investigación nacional (ANR-10-INSB-04; Inversiones para el futuro) y la Région Ile (programa Domaine d'Intérêt mayor-Malinf) para el uso del microscopio Elyra. Este trabajo fue financiado por el el Ligue Contre le cáncer y la agencia francesa de investigación nacional (ANR-16-CE13-0019).

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<li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Imaging+Conditions+for+Demanding+Multi-Color+Super+Resolution+Localization+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), e0158884(2016).</li>
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<li>Mikhaylova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+bundled+microtubules+using+anti-tubulin+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Resolving bundled microtubules using anti-tubulin nanobodies.</a> Nat Commun. 6, 7933(2015).</li>
<li>Nieuwenhuizen, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+image+resolution+in+optical+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Measuring image resolution in optical nanoscopy.</a> Nat Methods. 10 (6), 557-562 (2013).</li>
<li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nprot.2017.024">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li>
</ol>

Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Pasos críticos en el protocolo
Aquí presentamos un protocolo que reduce al mínimo los artefactos en las imágenes dSTORM de los microtúbulos e IFs en células gliales. Cada paso de la preparación de la muestra y proyección de imagen pueden crear artefactos: fijación, bloqueo, inmunomarcación, a la deriva durante la adquisición, no óptima intermitente condiciones23. Enumeramos a continuación los pasos más críticos.
El cubreobjet...

Filamentos intermedios citoplasmáticos (IFs) son 10 nm de diámetro homo - o heteropolymers de un subconjunto específico de tipo de célula de las proteínas de los IF. IFs participan en una amplia gama de funciones celulares tales como respuestas de motilidad, proliferación y estrés celular. Su papel fundamental se destaca por el hecho de que más de 90 enfermedades humanas son causadas directamente por las mutaciones en las proteínas de la IF; por ejemplo, cambios en la composición de IF acompaña a crecimiento del tumor y propagación1,2,3. Existe una creciente evidencia de que los tres sistemas de citoesqueleto trabajan en colaboración para el control de las funciones celulares tales como polarización celular, división y migración2,3. Puesto que hay un acoplamiento apretado entre la arquitectura espacial y funciones, es crucial obtener ideas sobre la organización estructural de la IF con los otros filamentos y comprender mejor la diafonía citoesqueleto. Este artículo proporciona un protocolo para llevar a cabo la resolución súper técnica doble color dSTORM (directo estocástico reconstrucción microscopía óptica)4 y cómo se utiliza para investigar la interacción entre si y microtúbulos en fijo, cultivadas células en 2 dimensiones (2D).
Varias técnicas de superresolución se han desarrollado durante el pasado decenio y descubrimientos allí estaban en el origen del Premio Nobel de química en 20145. Entre todas estas técnicas se encuentra los molécula única localización métodos como PALM6 (microscopía de localización Photo-Activated) que utiliza proteínas fluorescentes fotoconmutables, tormenta7 con pares de fluoróforos o dSTORM4 con fluoróforos convencional. Todos estos métodos se basan en el mismo principio que consiste en (i) el interruptor de la mayoría de los reporteros fluorescentes en un estado de "off" "la estado de (no fluorescente), (ii) la activación estocástica de un subconjunto de ellos en un fluorescente para localizar su posición espacial con precisión de nanómetros y (iii) la repetición de este proceso para activar tantos subconjuntos de fluoróforos como sea posible. Una imagen final es reconstruida usando todas las localizaciones de las moléculas activadas, proporcionando una resolución lateral de ~ 20-40 nm. Varios sistemas ópticos comercializados que tormenta de Palma ya están disponibles para los biólogos para experimentos de la rutina. Aquí, un sistema de este tipo fue utilizado para el estudio de la Asociación estructural de los microtúbulos e IFs. Entre todos los sola molécula basada en la localización de métodos, la técnica de doble color dSTORM fue seleccionada, porque es idóneo para observar las regiones laminares muy finas (< 1 μm) de células adherentes y pueden proporcionar una mejoría significativa de la resolución de la imagen con inversión mínima de tiempo y dinero. De hecho, dSTORM es una técnica muy conveniente y versátil que es compatible con el estándar colorantes orgánicos habitualmente utilizados para la tinción celular e inmunofluorescencia.
Mientras que un color dSTORM imágenes son relativamente fáciles de obtener con el fluoróforo Alexa6478, color doble dSTORM requiere para optimizar las condiciones experimentales para que dos tintes pueden parpadear correctamente en el buffer elegido, especialmente cuando hay limitada energía del laser. Excelentes artículos ya están disponibles en los métodos para crear imágenes de múltiples colores con dSTORM9,10,11,12,13, y estos documentos explican detalladamente las posibles fuentes de artefactos y la resolución de la imagen degradada y cómo superarlos. En este artículo, las condiciones experimentales óptimas en términos de fijación de las células, immunostaining, preparación de muestras, adquisición de imágenes y reconstrucción de la imagen se describen para adquirir imágenes de densas redes de IF citoplásmicas y microtúbulos en células gliales con doble color dSTORM. Brevemente, el método de extracción/fijación descrito en Chazeau et al12 fue adaptado a las células gliales y utilizado con un paso de la fijación, concentración de anticuerpos optimizado, un búfer de tormenta con 10 mM MEA descrito en9 de Dempsey et al. que fue encontrado para ser óptimo para el montaje experimental y el tipo de muestra.
Células gliales expresan principalmente tres tipos de proteínas de los IF: vimentina, nestina y GFAP (proteína ácida fibrilar glial). Estas tres proteínas mostraron Co polimerizarse en astrocitos14. Previamente demostramos mediante microscopía de iluminación súper resolución estructurada (SR SIM) que estas tres proteínas IF pueden encontrarse en el mismo filamento único de IF y que muestran similar dinámica y distribución en las células gliales 15. Debido a las similitudes entre las tres proteínas de IF, vimentin tinción fue utilizado como reportero para la red IF. Con dSTORM, hemos logrado resolver cómo haces de forma IF a lo largo de los microtúbulos, que no era posible con la difracción limitada de técnicas de microscopía15. Estas observaciones pueden ayudar a entender cómo vimentin IFs pueden microtúbulos de plantilla y regular la trayectoria de crecimiento, promoviendo el mantenimiento de un eje de polaridad durante la migración de la célula16. Imágenes de súper-resolución proporcionaron información clave en la interacción mutua de los dos subsistemas de citoesqueleto y trajeron la visión de la relación entre Asociación espacial y función local que podría ser el tipo de célula específica17. En general, dSTORM dos colores puede utilizarse para el estudio de la diafonía entre elementos citoesqueléticos u otros tipos de organelos, que immunostaining buenas condiciones se alcanzan en términos de densidad y especificidad. Esta técnica será útil para caracterizar mejor a los cambios del citoesqueleto observados astrogliosis y glioblastoma, el tumor más frecuente y más maligno del sistema nervioso central, donde la expresión de proteínas de IF es alterado 18 ,19,20,21.

<table><tbody><tr><td>Medios esenciales mínimos (MEM)</td><td>Gibco</td><td>41090-028</td><td>cultivo celular</td></tr><tr><td>aminoácido no esencial</td><td>Gibco</td><td>1140-050</td><td>cultivo celular 1/100e</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>cultivo celular 1/100e</td></tr><tr><td>F&oelig; tal Suero bovino</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>cultivo celular 1/10E</td></tr><tr><td>0,05 % tripsina-EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>cultivo celular</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Fischer Scientific</td><td>11540486</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos de cultivo celular 18 mm n&deg; 1,5H</td><td>Marienfield/Dominic dutsher</td><td>900556</td><td>cubreobjetos</td></tr><tr><td>solución de paraformaldehído (PFA)</td><td>Sigma</td><td>F8775</td> fijación <td>celular</td></tr><tr><td>glutaraldehído Sigma</td><td></td><td>G5882</td><td>fijación celular</td></tr><tr><td>triton X100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>tensioactivo no iónico. Se utiliza para la fijación</td></tr><tr><td>celular borohidruro de sodio (NaBH4)</td><td>Sigma</td><td>452904-25ML</td><td>fijación</td></tr> celular <tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>pasivación de muestras 3% en PBS</td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal anti-vimentina (V9) producido en ratones</td><td>Anticuerpos primarios</td><td>Sigma</td><td>V6630</td></tr><tr><td>Rata anti alfa tubulina</td><td>Biorad</td><td>MCA77G</td><td>Anticuerpos</td></tr> <tr><td>primariosAnticuerpo secundario anti-rata IgG (H+L) de cabra, Alexa Fluor 555</td><td></td><td>Anticuerpos secundarios</td>de <td>10635923 científico de Fisher</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-ratón Donkey IgG (H+L), Alexa Fluor 647</td><td>Anticuerpos secundarios de 10226162 científico de Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microesferas TetraSpeck, 0,1 y micro; m, azul fluorescente/verde/naranja/rojo oscuro</td><td>Perlas fluorescentes</td><td>Fisher scientific</td><td>T7279</td></tr><tr><td>Cámara magnética Chamlide</td><td>Instrumento de célula viva</td><td>CM-B18-1</td><td>portamuestras magnético, volumen máximo 1,2 mL</td></tr><tr><td>Cisteamina (MEA)</td><td>Sigma</td><td>30070</td><td>para el tampón parpadeante</td></tr> glucosa <tr><td>oxidasa de Aspergillus niger</td><td>Sigma</td><td>G0543</td><td>para el tampón</td></tr> <tr>parpadeante<td>glucosa</td><td>sigma</td><td></td><td>para el tampón parpadeante</td></tr><tr><td>catalasa del hígado bovino</td><td>Sigma</td><td>C9322</td><td>para el tampón parpadeante</td></tr><tr><td>Tris (trizma)</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>para el tampón intermitente</td></tr><tr><td>Wash-N-Dry portaobjetos</td><td>Sigma</td><td>Z688568</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>limpiador ultrasónico</td> de película de parafina<td>Limpiador de plasma Fisher scientific</td><td>15-335-6</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Harrick plasma</td><td>PDC-32G-2</td><td></td></tr></tbody></table>

filamentos intermedios y microtúbulos con microscopía de reconstrucción óptica estocástica directo 2-dimensional de imágenes

Imaging Intermediate Filaments and Microtubules with 2-dimensional Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy

El citoesqueleto, compuesto de microfilamentos de actina, microtúbulos y filamentos intermedios (IF), desempeña un papel clave en el control de la forma celular, la polaridad y la motilidad. La organización de las redes de actina y microtúbulos ha sido extensamente estudiada pero de IFs no es todavía completamente caracterizado. IFs tiene un diámetro promedio de 10 nm y forma una red que se extiende por todo el citoplasma de la célula. Se asocian físicamente con actina y microtúbulos a través de motores moleculares y linkers del citoesqueleto. Esta asociación estrecha está en el corazón de los mecanismos de regulación que garanticen la regulación coordinada de las tres redes citoesqueléticas necesarios para la mayoría de las funciones de la célula. Por lo tanto, es fundamental visualizar IFs solas y también conjuntamente con cada una de las otras redes citoesqueléticas. Sin embargo, las redes de IF son extremadamente densas en más tipos de células, especialmente en células gliales, que hace que su resolución sea muy difícil de conseguir con microscopía de fluorescencia estándar (lateral resolución de ~ 250 nm). Microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM) es una técnica que permite un aumento en la resolución lateral de un orden de magnitud. Aquí, mostramos que resolución dSTORM lateral es suficiente para resolver la organización densa de las redes de IF y, en particular, de los paquetes de IF que rodea a los microtúbulos. Asociación tan apretado es probable que participan en la regulación coordinada de estas dos redes y mayo, explicar cómo plantilla de IFs vimentin y estabilizar la organización microtubular como podría influir en tráfico vesicular dependiente de microtúbulos. Más en general, nos muestran cómo la observación de dos componentes citoesqueléticos con técnica de doble color dSTORM trae nuevas perspectivas en su mutua interacción.

Un microscopio equipado con 50 mW 405 nm y 100 mW 488, 561 y 642 nm láseres de estado sólido, un EMCCD cámara de 512 x 512, un alfa Apo Plan 100 X / 1,46 objetivo banda pasar 570-650 y pase largo 655 filtros de emisión se utilizó para los representante resultados presentados a continuación.
Figura 1A da un ejemplo de molécula densidad y señal a ruido que se debe utilizar durante la adquisición de la...

El objetivo general de esta metodología es darle las condiciones experimentales óptimas de preparación de la muestra para la adquisición de imágenes y reconstrucción para realizar imágenes 2D color doble dSTORM de microtúbulos y filamentos intermedios de células fijas

Filamentos intermedios y microtúbulos con microscopía de reconstrucción óptica estocástica directo 2-dimensional de imágenes

The cytoskeleton, composed of actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments (IF), plays a key role in the control of cell shape, ...

El objetivo general de esta metodología es crear las condiciones experimentales óptimas desde la preparación de la muestra hasta la adquisición y reconstrucción de imágenes con el fin de realizar imágenes D-STORM bicolor en 2D de microtúbulos y filamentos intermedios en células fijas. Este método puede ayudar a caracterizar las interacciones físicas entre redes de citoesqueletos densas y complejas, como filamentos intermedios y microtúbulos. La principal ventaja de esta técnica es que permite la observación de estructuras celulares, que no se resuelven con la microscopía de fluorescencia convencional.La demostración visual de este método es fundamental, ya que el control de la preparación de la muestra y la adquisición de datos de enlace de bata es crucial para limitar la generación de artefactos. Después de cultivar células U373 de acuerdo con el protocolo de texto, fije las células usando primero PBS para lavarlas una vez. Luego, retire el PBS y agregue un mililitro por pocillo de solución de fijación de extracción precalentada.Incuba las células a temperatura ambiente durante 60 segundos. A continuación, retire la solución y añada un mililitro por pocillo de PFA al 4% recién pre

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Investigación

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Biology

Biología

Se describe un método de microscopía correlativa que combina alta velocidad de microscopía de luz fluorescente de células vivas 3D y la crio-tomografía electrónica de alta resolución. Se demuestra la capacidad del método correlativo por imágenes dinámicas, pequeñas partículas de VIH-1 que interactúan con las células HeLa de acogida.

Microscopía correlativa para el análisis estructural en 3D de Interacciones Dinámicas

La información espacio-temporal sobre las proteínas dinámicas dentro de las células vivas es crucial para entender la biología. Un tipo de microscopía de superresolución llamada microscopía rápida de iluminación estructurada en 3D (f3D-SIM) revela información única sobre el anillo Z citocinético en las bacterias: tanto su apariencia en forma de perla como la rápida dinámica de FtsZ dentro del anillo.

Super-resolución de imagen del anillo Z cytokinetic en bacterias vivas Utilizando 3D-estructurado Fast Iluminación Microscopía (F3D-SIM)

Para investigar las velocidades de flujo y la direccionalidad de la actina filamentosa en la sinapsis inmunológica de las células T, se combinan imágenes de superresolución de células vivas con fluorescencia de reflexión interna total y se cuantifican con espectroscopía de correlación de imágenes espacio-temporales.

Cortical de actina de flujo en células T cuantificados por espacio-temporal de correlación Imagen Espectroscopia de Estructurado Iluminación Microscopía de datos

Se presenta un protocolo para la aplicación de interferométrico fotoactivados localización Microscopy (iPalm), un método súper resolución microscopía 3-dimensional de una sola molécula de localización, a la formación de imágenes del citoesqueleto de actina en células de mamífero adherentes. Este enfoque permite la visualización basada en la luz de las características estructurales a nanoescala que de otro modo permanecerían sin resolver por microscopía óptica de difracción limitada...

Tridimensional súper resolución Microscopía de filamentos de actina F por interferométrica photoactivated localización de Microscopía (iPalm)

Este protocolo es una guía para implementar microscopía de reflexión de interferencia en un microscopio de fluorescencia estándar para imágenes de alta velocidad, sin etiquetas y de alto contraste de microtúbulos mediante ensayos de superficies in vitro.

Implementación de microscopía de reflexión de interferencias para imágenes de microtúbulos sin etiquetas y de alta velocidad

La microscopía óptica de superresolución basada en chips es un enfoque novedoso para la microscopía de fluorescencia y ofrece ventajas en la rentabilidad y el rendimiento. Aquí, los protocolos para la preparación de chips y la toma de imágenes se muestran para la microscopía TIRF y la microscopía de superresolución basada en localización.

Fluorescencia de reflexión interna total de alto rendimiento y microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa utilizando un chip fotónico

La microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM) se utiliza para eludir el límite de difracción típico de la microscopía de luz y para ver los exosomas a escala nanométrica. Se puede emplear tanto en dos como en tres dimensiones para caracterizar exosomas.

Microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa de vesículas extracelulares en tres dimensiones

Aquí, se presenta un ensayo de reconstitución in vitro basado en microscopía TIRF para cuantificar y comparar simultáneamente la dinámica de dos poblaciones de microtúbulos. Se describe un método para ver simultáneamente la actividad colectiva de múltiples proteínas asociadas a microtúbulos en haces de microtúbulos reticulados y microtúbulos individuales.

Visualización simultánea de la dinámica de microtúbulos reticulados y únicos in vitro mediante microscopía TIRF

Presentamos un protocolo para implementar la microscopía de interferencia-reflexión y la microscopía de reflexión-fluorescencia interna-total para la obtención simultánea de imágenes de microtúbulos dinámicos y proteínas asociadas a microtúbulos marcadas fluorescentemente.

Reflexión de interferencia simultánea y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para imágenes de microtúbulos dinámicos y proteínas asociadas

La microscopía dinámica diferencial (DDM) combina características de dispersión dinámica de luz y microscopía. Aquí, se presenta el proceso de uso de DDM para caracterizar redes de citoesqueletos reconstituidos mediante la cuantificación de la dinámica subdiffusiva y enjaulada de partículas en redes de vimentina y el movimiento balístico de compuestos activos de actina-microtúbulos impulsados por miosina.

Cuantificación de la dinámica del citoesqueleto mediante microscopía dinámica diferencial

Este protocolo describe en detalle cómo construir un microscopio de fluorescencia de hoja de luz de un solo objetivo y su uso para visualizar redes de citoesqueletos.

Diseño y construcción de un microscopio de fluorescencia de lámina de luz personalizable de un solo objetivo para la visualización de redes de citoesqueletos

Aprende a realizar imagenología dSTORM bidimensional de microtúbulos y filamentos intermedios en células U373 fijas. Esta técnica de superresolución permite visualizar interacciones citoesqueléticas no resueltas por microscopía convencional.

Filamentos intermedios y microtúbulos con microscopía de reconstrucción óptica estocástica directo 2-dimensional de imágenes

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