Filamentos intermedios y microtúbulos con microscopía de reconstrucción óptica estocástica directo 2-dimensional de imágenes

El objetivo general de esta metodología es crear las condiciones experimentales óptimas desde la preparación de la muestra hasta la adquisición y reconstrucción de imágenes con el fin de realizar imágenes D-STORM bicolor en 2D de microtúbulos y filamentos intermedios en células fijas. Este método puede ayudar a caracterizar las interacciones físicas entre redes de citoesqueletos densas y complejas, como filamentos intermedios y microtúbulos. La principal ventaja de esta técnica es que permite la observación de estructuras celulares, que no se resuelven con la microscopía de fluorescencia convencional.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que el control de la preparación de la muestra y la adquisición de datos de enlace de bata es crucial para limitar la generación de artefactos. Después de cultivar células U373 de acuerdo con el protocolo de texto, fije las células usando primero PBS para lavarlas una vez. Luego, retire el PBS y agregue un mililitro por pocillo de solución de fijación de extracción precalentada.

Incuba las células a temperatura ambiente durante 60 segundos. A continuación, retire la solución y añada un mililitro por pocillo de PFA al 4% recién preparado y precalentado diluido en tampón de citoesqueleto. Vuelva a colocar la placa de 12 pocillos en la incubadora a 37 grados centígrados durante 10 minutos.

Luego retire el PFA y agregue tres mililitros de PBS por pocillo. Use PBS para lavar las celdas dos veces. A continuación, retire el PBS y añada 10 milimolares de borohidruro de sodio recién preparado diluido en PBS para apagar la autofluorescencia del glutaraldehído.

Incubar las células a temperatura ambiente durante siete minutos y transferir el borohidruro de sodio reciclado a un contenedor específico. Use PBS para lavar los pozos tres veces durante cinco minutos cada uno. A continuación, elimine el PSB y añada un 5%BSA en PBS como solución de bloqueo.

Después de inmunotinción de muestras y preparación de soluciones en tampones de acuerdo con el protocolo de texto, monte el cubreobjetos que contiene las células marcadas en un portamuestras magnético. Y agregue el tampón de imágenes para llenar completamente la cámara. Aplique la tapa y asegúrese de que no haya burbujas de aire entre el tampón de imagen y la tapa.

Usando etanol absoluto, limpie el fondo de la muestra y verifique que no haya fugas. Luego, si es necesario, use grasa para sellar correctamente la bodega de muestra. Para realizar la toma de imágenes, encienda el microscopio y el software de adquisición.

Configure los parámetros de adquisición de acuerdo con el protocolo de texto, utilizando el objetivo NA 1.46 de 100 aumentos, la lente Optivar de 1.6 aumentos y el modo TIRF UHP. Crea una pista 647 para obtener imágenes de los filamentos de vimentina etiquetados con Alexa Fluor 647. Seleccione las líneas láser de 405 y 642 nanómetros y el filtro de emisión LP 655.

A continuación, cree una pista 555 para obtener imágenes de los microtúbulos marcados con Alexa Fluor 555. Seleccione las líneas láser de 561, 488 y 405 nanómetros para obtener imágenes de los fluoróforos y el filtro de emisión BP 570 a 650. A continuación, agregue aceite al objetivo y coloque la muestra en la lente.

A continuación, seleccione la pestaña localizar y abra el obturador de la lámpara de fluorescencia. Encuentre el enfoque y utilice el ocular para buscar las células que desea obtener en la imagen. A continuación, utilice el joystick para colocar las celdas en el centro del campo.

Haga clic en la pestaña de adquisición para volver al modo de adquisición. A continuación, seleccione la pista 647 y ajuste la potencia del láser 642 al 0,2% y la potencia del láser 405 a su valor mínimo. Ajusta el tiempo de exposición a 50 milisegundos y la ganancia a 50.

A continuación, elija el modo de adquisición continua para observar la celda en la pantalla. Asegúrese de que haya al menos una cuenta fluorescente en el campo de visión. Utilice un modo de escalado automático para la pantalla y ajuste el enfoque.

A continuación, tome una imagen de epifluorescencia de campo amplio de la red de vimentina haciendo clic en ajustar y guarde la imagen. Para verificar la iluminación TIRF, haga clic en TIRF, presione continuo, ajuste los parámetros de adquisición para tener un campo de iluminación homogéneo. A continuación, pulse snap y guarde la imagen.

Revisa la pista 555. Desmarque la pista 647 y seleccione la pista 555. Tome una imagen de epifluorescencia de la red de microtúbulos y guárdela.

A continuación, tome una imagen TIRF y guárdela. Ahora, revisa la pista 647. Desmarque la pista 555 y seleccione la pista 647.

Ajusta la ganancia a cero y el tiempo de exposición a 10 milisegundos. A continuación, pulse continuo. Ajuste la potencia del láser de 642 nanómetros al 100% para bombear la mayoría de los tintes de Alexa 647 al estado oscuro.

Una vez que los fluoróforos comiencen a parpadear, aumente la exposición a 15 milisegundos y la ganancia a 300. Utilice el modo de indicador de rango para verificar que las señales de una sola molécula no saturen la cámara como indica el color rojo. En ese caso, disminuya la ganancia hasta que desaparezca la saturación.

Las cuentas permanecerán saturadas al comienzo de la adquisición. Presione detener para interrumpir la observación de la celda. Expanda la herramienta de procesamiento en línea y haga clic en PALM de procesamiento en línea para visualizar la imagen de STORM durante la adquisición.

Use nueve para el tamaño máximo de la máscara y seis para la intensidad máxima del ruido. Ahora, presione iniciar adquisición. Durante la adquisición, vuelva a enfocar la celda si es necesario.

Ajuste el tiempo de exposición y, finalmente, encienda la línea láser de 405 nanómetros a partir del 0,001% para mantener una densidad media de fluoróforos con una distancia mínima de un micrómetro entre moléculas individuales. Asegúrese de que el pico de precisión de localización en el histograma debajo de la imagen reconstruida esté centrado alrededor o por debajo de 10 nanómetros. Pulse detener para finalizar la película cuando se hayan alcanzado más de un millón de localizaciones.

Guarde los datos brutos de la adquisición de STORM con el formato CZI. Luego, en la herramienta de canales, marque la pista 555, desmarque la pista 647 y seleccione la pista 555. A continuación, presione el botón continuo.

Ajusta el tiempo de exposición a 30 milisegundos y la ganancia a cero. A continuación, ajuste los láseres 488 y 561 al 100% para bombear los tintes Alexa 555 al estado oscuro. Utilice el modo de iluminación HILO.

Una vez que se agoten los fluoróforos, presione detener. Ajuste la ganancia a 250 y disminuya el láser 488 a 50%Utilice el indicador de rango para comprobar que las moléculas individuales no saturen la cámara. Si ese es el caso, disminuya la ganancia.

Ahora, presione iniciar adquisición. Durante la adquisición, aumente la ganancia gradualmente hasta alcanzar el límite de saturación. Aumente paso a paso la potencia del láser de 405 nanómetros para activar las moléculas y alcanzar una densidad media en el campo de visión.

Disminuya la potencia del láser de 488 nanómetros al 30%cuando el láser 405 sea de aproximadamente el 15%Luego disminuya gradualmente el 488 mientras aumenta la potencia del láser 405 para mantener el parpadeo de las moléculas lo más rápido posible y con una densidad media. La línea láser 488 junto con el láser de excitación 561 a máxima intensidad aumenta las tasas de encendido y apagado de los fluoróforos, mientras que la línea láser 405 solo aumenta la tasa de encendido. Detenga la adquisición cuando se hayan alcanzado 500.000 localizaciones o más o cuando no haya más moléculas parpadeando.

A continuación, guarde los datos brutos de la adquisición de STORM con el formato CZI. Para llevar a cabo la reconstrucción de la imagen con la herramienta PAL-Drift, elija el tipo de corrección basado en modelo con segmentos automáticos con un tamaño máximo de ocho. Presione aplicar varias veces seguidas hasta que se corrija la deriva.

Esta corrección basada en modelos aplica un algoritmo basado en el análisis de correlación cruzada, que corrige la deriva. Con las herramientas de filtro PAL, mejore la apariencia de la imagen de STORM seleccionando solo las moléculas mejor localizadas. Por ejemplo, limite la precisión de localización a 30 nanómetros y la PSF a 120 a 180 nanómetros.

Con la herramienta PAL-Render, utilice una resolución de píxeles de cinco o 10 nanómetros y parámetros de acuerdo con el protocolo de texto. Seleccione renderizar rango dinámico automático HR con un valor del 95% y renderizar SWF de rango dinámico automático con un valor del 90%. A continuación, seleccione renderizar la mejor calidad.

En el menú PALM de la pestaña de procesamiento, seleccione Convertir PALM. Presione seleccionar y, a continuación, aplicar. Por último, guarde la imagen creada con el formato LSM y no CZI.

Esta figura muestra un ejemplo típico de una imagen D-STORM de filamentos de vimentina inmunomarcados con Alexa 647. El aumento de la resolución se puede observar claramente en comparación con la imagen adquirida con un microscopio estándar de campo amplio. Los perfiles de intensidad de fluorescencia presentados en este gráfico muestran que las imágenes de microscopía de súper resolución permiten la resolución de haces de vimentina.

La resolución D-STORM es suficiente para contar el número de filamentos presentes en los paquetes. Aquí se muestra un ejemplo típico de las imágenes D-STORM de dos colores de redes de vimentina y microtúbulos inmunomarcadas con Alexa 647 y Alexa 555, respectivamente. Las buenas imágenes de vimentina deben tener al menos 5.000 localizaciones por micrómetro cuadrado y 2.500 por micrómetro cuadrado para los microtúbulos.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres días si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante adaptar los métodos de fijación y parametrización a la proteína que se va a obtener la imagen. Por ejemplo, la fijación solo con glutaraldehído da malos resultados para los filamentos intermedios, pero es mejor para la fijación de microtúbulos.

Es importante recordar que debe utilizar muestras y soluciones recién preparadas, especialmente MEA, cuyo pH debe ajustarse cuidadosamente. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular exploraran la morfología de las estructuras celulares nanoscópicas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar la preparación de muestras, la adquisición de imágenes y la reconstrucción de imágenes D-STORM 2D de dos colores de filamentos intermedios y microtúbulos.

No olvide que trabajar con algunas soluciones, especialmente PFA, NABH4 puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes, trabajar bajo el capó químico y el uso de contenedores específicos al realizar este procedimiento.