Name: Muestreo de Sap de líber de Brassica napus para 3D-página de proteínas y complejos de ribonucleoproteína (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Aprende a aislar y analizar complejos de proteínas y ribonucleoproteínas del savia de floema de Brassica napus mediante electroforesis 3D-PAGE. Este método permite la identificación simultánea de componentes proteicos y de ácidos nucleicos.

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Agradecemos a Jennifer Deke y Urszula Zarzenska por su apoyo científico. Este trabajo fue apoyado por una beca de integración de carrera (CIG, 0734 PCIG14-GA-2013-63) la Comisión Europea dentro del 7 º Programa marco, la concesión LFF-GK06 'DELIGRAH' (Landesforschungsförderung Hamburg) y la concesión de la DFG (DFG KE 856_6-1) adjudicado a JK.

1. muestreo y preparación de la savia del floema de B. napus plantas 4,8,20
<ol><li>Para savia del floema de muestreo, el uso bien regado de 8 semanas de edad que mostrar sólo inicio de floración para evitar contaminación de polen de plantas de B. napus .</li>
	<li>Utilice una aguja hipodérmica (Ø 0,8 mm) y el tallo de la inflorescencia punteado varias veces. La repetición en varios otros vástagos de la inflorescencia y en otras plantas para obtener suficiente savia del floema (Figura 2a). Nota: Para el análisis complejo, es aconsejable comenzar con al menos 600 μl de savia del floema. 4 a 5 plantas producirá entre 200 y 700 μl de savia del floema.</li>
	<li>Limpie la primera gota de los sitios lesionados con papel de filtro. Estas gotas contienen material altamente contaminado de tejido lesionado y deban descartarse principalmente.</li>
	<li>Recoger las gotas siguientes mediante pipeteo y almacenar el exudado recogido en un tubo de ensayo previamente enfriada cónico 1.5 mL a-20 ° C utilizando un sistema de refrigeración libre de hielo.</li>
	<li>Seguir recogiendo hasta que ninguna otra formación de gota es observable, pero no más de 1 h. Este procedimiento se puede repetir después de dos días sin pérdida significativa de la savia del floema recogidos. Nota: La savia del floema recogida puede ser utilizada inmediatamente o almacenada a-80 ° C para futuros análisis. Para el almacenamiento de-80 ° C, choque congelar el tubo de reacción en nitrógeno líquido.</li>
	<li>Concentrar la muestra de líber a aproximadamente 1/6th del volumen inicial con concentradores centrífugos de un peso molecular (MWCO) corte de 10.000 Daltons (Da). Centrifugar la muestra concentrada a 4 ° C y 20.000 x g durante al menos 15 minutos eliminar las partículas de polvo. Nota: Concentración de savia del floema no conduce a una importante pérdida de proteínas.</li>
	<li>Para posteriores análisis complejo, continúe con el paso 3.1.</li>
</ol>2. control de pureza de sap floema usando transcriptasa reversa PCR (RT-PCR) 4,8,20
<ol><li>Aislar el ARN total de la savia del floema usando un método estándar de extracción de RNA para material líquido (por ejemplo, extracción de TRIzol o fenol-cloroformo seguido por la precipitación del isopropanol de la fase acuosa y etanol lavado pasos según la Protocolo del fabricante). PRECAUCIÓN: El fenol cloroformo es tóxico. Trabajar bajo una campana de equipos de protección personal apropiado. El ARN extraído puede almacenarse en etanol a-80 ° C hasta por seis meses.</li>
	<li>Eliminar la contaminación del ADN de digestión con ADNasa I (1 u/μg) durante 45 min a 37 ° C e inactivar la enzima mediante la adición de EDTA a una concentración final de 5 mM e incubar la muestra a 75 º C durante 10 minutos.</li>
	<li>Para obtener el RNA puro, purificar y concentrar la muestra mediante un paso de purificación (por ejemplo usando RNA Kits de limpieza, según las instrucciones del fabricante).</li>
	<li>Realizar una transcriptasa reversa PCR (RT-PCR) para la síntesis de cDNA con un equipo de síntesis de cDNA utilizando 150 ng de ARN puro del protocolo descrito por el fabricante. Nota: El cDNA puede almacenarse a-20 ° C hasta su uso posterior.</li>
	<li>Utilice 5 μl de cDNA como plantilla para una reacción de polimerización en cadena estándar según lo especificado por el fabricante, para amplificar transcritos específicos de compartimiento y compruebe por electroforesis en gel de agarosa. Por ejemplo, usando las cartillas para la subunidad pequeña de rubisco, tiorredoxina h y la proteína de la cápsida de polen (Figura 1b, tabla 1) para confirmar la pureza de las muestras de líber.</li>
</ol>3. azul nativa página 4,25,26,31
<ol><li>Utilice ya sea por vertido geles gradiente nativos como se describe en otra parte27 o comercial Bis-Tris gradiente geles.</li>
	<li>Carga 20 a 30 μg de la muestra de proteína concentrada por pozo en el gel en por lo menos triplica.</li>
	<li>Correr el gel a 4 ° C y 150 V con cátodo azul oscuro buffer B y buffer ánodo (tabla 2) hasta que la muestra pasa 1/3rd del gel (ca. 20 a 30 min, figura 3a). Nota: Para borrar norteño, un carril único gel es suficiente, mientras que para el análisis de composición de página 3D y espectrometría de masas que se recomienda combinar la misma banda de diez carriles de gel para concentrar las proteínas menos abundantes.</li>
	<li>Hacer una pausa en el funcionamiento y cambio cátodo azul oscuro buffer B con cátodo azul luz buffer B/10 (tabla 2) y continuar la carrera. Acabado el gel al frente blue comienza a eluir del gel (ca. 120 y 180 min, figura 3a). Nota: El acabado azul gel nativo puede almacenarse a 4 ° C durante por lo menos una semana. Un almacenamiento prolongado puede llevar a difundir bandas y debe evitarse. Tampón azul oscuro B puede ser reutilizado.</li>
</ol>4. opcional: Detección de ARN utilizando azul nativa norte Blot 4
<ol><li>Cortar vendas distintas o usar el carril de todo gel del gel nativo azul y transferencia a una membrana de nylon por semi seco borrar a 3,5 mA/cm2 durante 60 min y marcan la frontera gel superior e inferior con un lápiz en la membrana (figura 4a).</li>
	<li>Después de secado, lavar la membrana con agua tratada con DEPC y secar entre dos papeles de filtro.</li>
	<li>Realiza UV-reticulación de la membrana blotted con 120.000 μj/cm2 (85 s si se usa el Crosslinker en Tabla de materiales).</li>
	<li>Pre-hibridar la membrana con 6 mL de tampón de hibridación (comercial o hecho a sí mismo) de 60 minutos a 68 ° C en un horno de hibridación (figura 4a).</li>
	<li>Agregar un adicional 1 mL de tampón de hibridación que contiene 4 μL de sondas biotiniladas 3' (100 nM).</li>
	<li>Incubar la membrana con la sonda durante la noche, mientras se enfría el horno de 68 ° C a 37 ° C.</li>
	<li>Lavar la membrana con tampón que contiene 2 SDS x SSC y 0.1%, durante 5 minutos a temperatura ambiente para eliminar las puntas de prueba limitados inespecífica. PRECAUCIÓN: SDS puede causar irritaciones. Use guantes y bata de laboratorio al trabajar con SDS y SDS soluciones.</li>
	<li>Realizar la detección de las sondas biotiniladas 3' en la membrana por ejemplo con un conjugado estreptavidina-HRP y el luminol como sustrato de peroxidasa (HRP) de rábano, dando por resultado una reacción quimioluminiscente sensible (figura 4a).</li>
</ol>5. segunda dimensión: Tris-Tricina-urea página 4,28
<ol><li>Impuestos especiales solo bandas del gel nativo azul. Combinar bandas de las muestras en carriles paralelos para lograr una mayor concentración de proteínas complejas (figura 5). Nota: Bandas suprimidos pueden almacenarse en tubos de reacción solo hasta su posterior uso a 4 ° C.</li>
	<li>Vierta un gel Tris-Tricina-urea de 12% (espesor de 1 mm, 6,8 cm x 8,6 cm (ancho x longitud)). Preparar el gel de separación (tabla 2), 10 mL de solución de gel una vierte entre dos placas de vidrio y recubrimiento con isopropanol. Retire el isopropanol al terminar la polimerización y transferir 4 mL de solución B (tabla 2) en gel para el gel de apilamiento en el gel e insertar que un 10 bien peine. PRECAUCIÓN: La acrilamida no polimerizada puede ser neurotóxica y TEMED es dañino si se inhala. Siempre use el equipo de protección personal y trabajar bajo una campana.</li>
	<li>Transferencia de las bandas de gel suprimido en un tubo de reacción de 1,5 mL y añadir 1 mL de 2 x solución tampón de muestras de la SDS para el equilibrado de las piezas de gel (figura 5, tabla 2).<ol>
<li>Incubar las muestras durante 10 minutos a temperatura ambiente, antes de la ebullición en un bloque de calefacción (95 ° C) o en el microondas e incubar las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos más.</li>
		<li>Apilar varias piezas de gel equilibrado que representa el mismo complejo en un solo gel bolsillo.</li>
		<li>Realizar la electroforesis con ánodo y cátodo funcionando búferes a 150 V durante 45 a 60 min y suprimir el carril del gel todo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar el carril cortado por 20 min en tampón ácido (100 mM Tris, ácido acético de 100 mM) y equilibrar en 125 mM Tris-HCl, pH 6.8 por otro 20 min (figura 5).</li>
</ol>6. tercera dimensión: 4,de SDS-PAGE32
<ol><li>Vierta un 15% de SDS separación de gel según Laemmli32 (espesor: 1,5 mm, 6,8 cm x 8,6 cm (ancho x longitud)) (tabla 2) y agregar una capa delgada de un 4% arriba del gel de apilamiento. PRECAUCIÓN: TEMED, acrilamida y SDS son tóxicos y perjudiciales. Trabajar bajo una campana y usar equipos de protección personal.</li>
	<li>La transferencia del carril del gel equilibrado sobre el gel de la SDS y cubrir el gel con agarosa 0.5% (p/p) de 1 x SDS ejecuta buffer suplementado con un rastro de azul de bromofenol (figura 5).</li>
	<li>Hervir el SDS ejecuta buffer con agarosa en el microondas antes de cargar en el gel.</li>
	<li>Para el funcionamiento de un marcador de proteína para estimar los pesos moleculares de los componentes individuales, inserte un trozo de papel de filtro en un extremo del gel hasta que la agarosa solidificada o usar un peine especial que se utiliza normalmente para los geles IPG.</li>
	<li>Correr el gel a 150 V durante 60 minutos y mancha el gel con Coomassie coloidal, plata o cualquier otra tinción adecuada para el posterior análisis de espectrometría de masa.</li>
	<li>Analizar los puntos accesibles de proteína usando espectrometría de masa enfoques como desorción láser asistida por matriz/ionización tiempo de vuelo (MALDI-TOF) o espectrometría de masas LC-MS/MS. Nota: Recomendamos utilizar el Coomassie coloidal tinción como ya descrito33. En nuestras manos, incluso menos abundantes proteínas puede ser suficientemente manchado y permite un análisis de espectrometría de masa con calidad razonable.</li>
</ol>

<ol><li>Kempers, R., van Bel, A. J. E. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF01007704">Symplasmic connections between sieve element and companion cell in the stem phloem ofVicia faba L. have a molecular exclusion limit of at least 10 kDa.</a> Planta. 201 (2), 195-201 (1997).</li>
<li>Stadler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+GFP-fusions+in+Arabidopsis+companion+cells+reveals+non-specific+protein+trafficking+into+sieve+elements+and+identifies+a+novel+post-phloem+domain+in+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Expression of GFP-fusions in Arabidopsis companion cells reveals non-specific protein trafficking into sieve elements and identifies a novel post-phloem domain in roots.</a> Plant J. 41 (2), 319-331 (2005).</li>
<li>Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+and+long-distance+trafficking+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+phloem+and+symplastic+unloading+of+the+protein+into+sink+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues.</a> Plant Cell. 11 (3), 309-322 (1999).</li>
<li>Ostendorp, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+Brassica+napus+phloem+protein+and+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of Brassica napus phloem protein and ribonucleoprotein complexes.</a> New Phytol. 214 (3), 1188-1197 (2017).</li>
<li>Paultre, D. S. G., Gustin, M. -P., Molnar, A., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lost+in+Transit%3A+Long-Distance+Trafficking+and+Phloem+Unloading+of+Protein+Signals+in+Arabidopsis+Homografts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Lost in Transit: Long-Distance Trafficking and Phloem Unloading of Protein Signals in Arabidopsis Homografts.</a> Plant Cell. 28 (9), 2016-2025 (2016).</li>
<li>Sali, A., Glaeser, R., Earnest, T., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+words+to+literature+in+structural+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From words to literature in structural proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 216-225 (2003).</li>
<li>Lin, M. -K., Lee, Y. -J., Lough, T. J., Phinney, B. S., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Pumpkin+Phloem+Proteome+Provides+Insights+into+Angiosperm+Sieve+Tube+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Pumpkin Phloem Proteome Provides Insights into Angiosperm Sieve Tube Function.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8 (2), 343-356 (2008).</li>
<li>Giavalisco, P., Kapitza, K., Kolasa, A., Buhtz, A., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+proteome+of+Brassica+napus+phloem+sap%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Towards the proteome of Brassica napus phloem sap.</a> Proteomics. 6 (3), 896-909 (2006).</li>
<li>Lucas, W. J., Yoo, B. C., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+as+a+long-distance+information+macromolecule+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell.+Bio%22%5BJournal%5D)">RNA as a long-distance information macromolecule in plants.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Bio. 2 (11), 849-857 (2001).</li>
<li>Dinant, S., Kehr, J. Sampling and Analysis of Phloem Sap. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDinant%2C+S+%22Plant+Mineral+Nutrients%22">Plant Mineral Nutrients</a>. 953, 185-194 (2013).</li>
<li>Kennedy, J. S., Mittler, T. E. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v171/n4351/abs/171528a0.html">A Method of obtaining Phloem Sap via the Mouth-parts of Aphids.</a> Nature. 171 (4351), 528(1953).</li>
<li>King, R. W., Zeevaart, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+Phloem+exudation+from+cut+petioles+by+chelating+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enhancement of Phloem exudation from cut petioles by chelating agents.</a> Plant Physiol. 53 (1), 96-103 (1974).</li>
<li>Alosi, M. C., Melroy, D. L., Park, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+gelation+of+Phloem+exudate+from+cucurbita+fruit+by+dilution%2C+glutathione%2C+and+glutathione+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The regulation of gelation of Phloem exudate from cucurbita fruit by dilution, glutathione, and glutathione reductase.</a> Plant Physiol. 86 (4), 1089-1094 (1988).</li>
<li>Dinant, S., Bonnemain, J. -L., Girousse, C., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+sap+intricacy+and+interplay+with+aphid+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+rendus+biologies%22%5BJournal%5D)">Phloem sap intricacy and interplay with aphid feeding.</a> Comptes rendus biologies. 333 (6-7), 504-515 (2010).</li>
<li>Tetyuk, O., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+and+analysis+of+Arabidopsis+phloem+exudates+using+the+EDTA-facilitated+Method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Collection and analysis of Arabidopsis phloem exudates using the EDTA-facilitated Method.</a> J Vis Exp. (80), e51111(2013).</li>
<li>Kovalskaya, N., Owens, R., Baker, C. J., Deahl, K., Hammond, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+modified+EDTA-mediated+exudation+technique+and+guttation+fluid+analysis+for+Potato+spindle+tuber+viroid+RNA+detection+in+tomato+plants+%28Solanum+lycopersicum%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Application of a modified EDTA-mediated exudation technique and guttation fluid analysis for Potato spindle tuber viroid RNA detection in tomato plants (Solanum lycopersicum).</a> J. Virol. Methods. 198, 75-81 (2014).</li>
<li>Rodriguez-Medina, C., Atkins, C. A., Mann, A. J., Jordan, M. E., Smith, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+composition+of+phloem+exudate+from+white+lupin+%28Lupinus+albus+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Macromolecular composition of phloem exudate from white lupin (Lupinus albus L).</a> BMC Plant Biol. 11 (1), 36(2011).</li>
<li>Taylor, J. S., Thompson, B., Pate, J. S., Atkins, C. A., Pharis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokinins+in+the+Phloem+Sap+of+White+Lupin+%28Lupinus+albus+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytokinins in the Phloem Sap of White Lupin (Lupinus albus L.).</a> Plant Physiol. 94 (4), 1714-1720 (1990).</li>
<li>Yoo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Systemic+Small+RNA+Signaling+System+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A Systemic Small RNA Signaling System in Plants.</a> Plant Cell. 16 (8), 1979-2000 (2004).</li>
<li>Buhtz, A., Springer, F., Chappell, L., Baulcombe, D. C., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+small+RNAs+from+the+phloem+of+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of small RNAs from the phloem of Brassica napus.</a> Plant J. 53 (5), 739-749 (2008).</li>
<li>Chalhoub, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+genetics.+Early+allopolyploid+evolution+in+the+post-Neolithic+Brassica+napus+oilseed+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Plant genetics. Early allopolyploid evolution in the post-Neolithic Brassica napus oilseed genome.</a> Science. 345 (6199), 950-953 (2014).</li>
<li>Sasaki, T., Chino, M., Hayashi, H., Fujiwara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+several+mRNA+species+in+rice+phloem+sap%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Phys%22%5BJournal%5D)">Detection of several mRNA species in rice phloem sap.</a> Plant Cell Phys. 39 (8), 895-897 (1998).</li>
<li>Doering-Saad, C., Newbury, H. J., Bale, J. S., Pritchard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+aphid+stylectomy+and+RT-PCR+for+the+detection+of+transporter+mRNAs+in+sieve+elements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Use of aphid stylectomy and RT-PCR for the detection of transporter mRNAs in sieve elements.</a> J Exp. Bot. 53 (369), 631-637 (2002).</li>
<li>Ruiz-Medrano, R., Xoconostle-Cázares, B., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+long-distance+transport+of+CmNACP+mRNA%3A+implications+for+supracellular+regulation+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Phloem long-distance transport of CmNACP mRNA: implications for supracellular regulation in plants.</a> Dev. 126 (20), 4405-4419 (1999).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> J Vis Exp. (48), e2164(2011).</li>
<li>Rais, I., Karas, M., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+electrophoresis+for+the+isolation+of+integral+membrane+proteins+and+mass+spectrometric+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional electrophoresis for the isolation of integral membrane proteins and mass spectrometric identification.</a> Proteomics. 4 (9), 2567-2571 (2004).</li>
<li>Schägger, H. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nprot/journal/v1/n1/full/nprot.2006.4.html">Tricine-SDS-PAGE.</a> Nature protocols. 1 (1), 16-22 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. -P., Schägger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Eubel, H., Braun, H. -P., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue-native+PAGE+in+plants%3A+a+tool+in+analysis+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Blue-native PAGE in plants: a tool in analysis of protein-protein interactions.</a> Plant Methods. 1 (1), 11(2005).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li>
<li>Turnbull, C. G. N., Lopez-Cobollo, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heavy+traffic+in+the+fast+lane%3A+long-distance+signalling+by+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Heavy traffic in the fast lane: long-distance signalling by macromolecules.</a> New Phytol. 198 (1), 33-51 (2013).</li>
<li>Hall, S. M., Baker, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+composition+of+Ricinus+phloem+exudate%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">The chemical composition of Ricinus phloem exudate.</a> Planta. 106 (2), 131-140 (1972).</li>
<li>Barnes, A., Bale, J., Constantinidou, C., Ashton, P., Jones, A., Pritchard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+protein+identity+from+sieve+element+sap+in+Ricinus+communis+L.+by+quadrupole+time+of+flight+%28Q-TOF%29+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Determining protein identity from sieve element sap in Ricinus communis L. by quadrupole time of flight (Q-TOF) mass spectrometry.</a> J. Exp. Bot. 55 (402), 1473-1481 (2004).</li>
<li>Walz, C., Giavalisco, P., Schad, M., Juenger, M., Klose, J., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+curcurbit+phloem+exudate+reveals+a+network+of+defence+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">Proteomics of curcurbit phloem exudate reveals a network of defence proteins.</a> Phytochemistry. 65 (12), 1795-1804 (2004).</li>
<li>Walz, C., Juenger, M., Schad, M., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+presence+and+activity+of+a+complete+antioxidant+defence+system+in+mature+sieve+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Evidence for the presence and activity of a complete antioxidant defence system in mature sieve tubes.</a> Plant J. 31 (2), 189-197 (2002).</li>
<li>Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phloem+sap+proteins%3A+their+identities+and+potential+roles+in+the+interaction+between+plants+and+phloem-feeding+insects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Phloem sap proteins: their identities and potential roles in the interaction between plants and phloem-feeding insects.</a> J Exp. Bot. 57 (4), 767-774 (2006).</li>
<li>Ham, B. -K., Brandom, J. L., Xoconostle-Cázares, B., Ringgold, V., Lough, T. J., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polypyrimidine+tract+binding+protein%2C+pumpkin+RBP50%2C+forms+the+basis+of+a+phloem-mobile+ribonucleoprotein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A polypyrimidine tract binding protein, pumpkin RBP50, forms the basis of a phloem-mobile ribonucleoprotein complex.</a> Plant Cell. 21 (1), 197-215 (2009).</li>
<li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J. Immunol. Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li>
<li>Zhang, S., Sun, L., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phloem-delivered+RNA+pool+contains+small+noncoding+RNAs+and+interferes+with+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The phloem-delivered RNA pool contains small noncoding RNAs and interferes with translation.</a> Plant Physiol. 150 (1), 378-387 (2009).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El floema es un compartimento de gran interés, ya que constituye la ruta de transporte más importantes de fotoasimilados y es también esencial para señalización de larga distancia entre plantas diferentes partes9,20,34, 35. Además de moléculas pequeñas, macromoléculas como las proteínas y RNAs se han implicado con líber mantenimiento y señalización de4,7,8. El análisis de composición de líber está restringido por la limitada accesibilidad a muestras de floema en la mayoría de especies vegetales. La técnica del estilete insectos es ampliamente aplicable, pero experimentalmente exigente y los resultados en cantidades muy pequeñas de líber muestras11. Una técnica fácil, utilizada para el muestreo de líber es facilitado por EDTA exudación12. EDTA quelatos de iones divalentes como el calcio y así evita el cierre de las placas de tamiz por P-proteínas y Callosa. Es fácil de usar, pero es propenso a la contaminación por células dañadas y se diluyen las muestras. Agotamiento de iones divalentes con EDTA también podría llevar a una ruptura de los complejos existentes. Sin embargo, permite la toma de muestras de una gran variedad de especies incluyendo la planta modelo thaliana a.15. Exudación espontánea de savia del floema ocurre solamente en un pequeño número de especies de plantas. Es un método invasivo que consiste en lesiones importantes de tejidos de planta10. Recientemente establecimos B. napus como una especie de modelo para el estudio de transporte a larga distancia4,8,20. Aquí, savia del floema puede ser muestreado de pequeñas incisiones, que reduce la herida efectos y fuentes de contaminación.
Utilizando técnicas de muestreo diferentes, el proteoma de las muestras de líber de diferentes especies de plantas se ha investigado en los últimos años7,8,17,36,37, 38,39. Para estos estudios del proteoma, proteínas fueron extraídas y precipitadas bajo desnaturalizar condiciones y por lo tanto no permiten conclusiones sobre: proteína y proteína: interacciones de ácidos nucleicos presentan en condiciones nativas. Análisis de superposición y co-inmunoprecipitación (CoIP) indicaron que podría existir un importante complejo de ribonucleoproteína en la savia del floema de calabaza40, pero no se demostró que cualquier complejos macromoleculares existen bajo condiciones nativas dentro de la sistema de líber.
Azul página nativa, introducida por Schägger et al. 26, en combinación con pasos de electroforesis en gel de alta resolución posterior permiten la separación de los componentes de los complejos grandes. Usando análisis de la página de 3D de nativa B. napus exudado de líber, recientemente podríamos demostrar que varias proteínas: proteína de alto peso molecular y los complejos de RNP existen en muestras de líber y son enzimáticamente activa4. Métodos alternativos para aislar los complejos así como RNPs como cromatografía por exclusión de tamaño podrían existir, pero no en términos de resolución en comparación a la página de la BN. Además, una razonable calidad de separación complejo, matrices de columna de exclusión de tamaño debe ser adaptado según los pesos moleculares en general complejos siendo investigados. Análisis complejos de diferente tamaño por lo tanto exigirá diferentes tipos de columnas que es costo intensivo y no permite como enfoque de alta potencia como una página de BN.
Pasos críticos para analizar complejos de B. napus incluyen el total de la savia del floema utilizado como material de partida. Al menos 600 μl de la muestra del floema son necesarios y pueden obtenerse en cinco plantas bien irrigadas. Para 3D-PAGE y BN el borrar norteño es necesario poner el gel BN inicial con una cantidad suficiente de muestras de líber. Para ello, muestras de líber se concentran hasta 20 a 30 μg de proteína se pueden cargar en cada bien y por lo menos triplicado de la misma muestra se ejecuta en paralelo. Concentración demasiado baja o demasiado alta reduce la detección de complejos (figura 3). Líber muestras deben recogerse en tubos de reacción sobre hielo y deben almacenarse congelado para que su uso posterior evitar la rotación y la degradación de las proteínas. Inhibidores de la proteasa se han encontrado en los proteomas de líber analizados, pero también un proteasoma activo fue descrito en el floema de B. napus4. Además, volumen y composición de las muestras de líber dependen del momento de muestreo y condiciones ambientales10. Por lo tanto se debe tener cuidado para recoger al mismo tiempo del día en condiciones similares. Tratamientos de estrés (por ejemplo sequía) pueden reducir la cantidad de floema que se puede recoger. Para identificar las proteínas solo por espectrometría de masas, es obligatorio para limitar la contaminación posible de la queratina por usando guantes todo el tiempo. La queratina conduce a señales adicionales durante masa especificaciones análisis y dificulta la identificación de proteínas. Ejecutando la página BN a un voltaje mayor o a temperatura ambiente puede conducir a la calefacción del gel que pueda resultar en desmontaje de frágiles complejos.
El protocolo presentado aquí es conveniente para el análisis de complejos de proteína: proteína. También mostramos que pueden utilizarse para detectar ARN específica contenida en los complejos en paralelo. Para lograr esto, hemos introducido recientemente un protocolo para BN norte borrar4. RNAs son propensos a la degradación por contaminación de Rnasa. Para limitar esa degradación tratada con DEPC, debe utilizarse agua.
Principales limitaciones del método presentado incluyen la estimación del peso molecular de complejos de proteínas separadas por BN-PAGE, ya que el comportamiento de migración depende en el tamaño, forma e incluso modificaciones del posttranslational de los complejos31, 41. Estimación de tamaño de los complejos de RNP es aún más complicado debido a la influencia de los ácidos nucleicos en el comportamiento de la migración. Se puede también no ser prevenido que complejos del mismo tamaño migran conjuntamente en una sola banda. Esto puede conducir a la predicción errónea de composiciones complejas. Por lo tanto verificar las interacciones observadas con técnicas complementarias, por ejemplo, por análisis funcional4, puede ser necesario. También proteínas sólo débil o transitorio asociadas a un complejo macromolecular podrían ser perdidas en el búfer BN utilizado. Para evitar esto, las muestras pueden ser reticulado, lo que puede conducir también a artefactos o puede evitar la identificación de proteínas, o las condiciones de buffer pueden ser optimizadas.
En contraste con clásico 2D-PAGE, la combinación de urea y SDS-PAGE permite la separación según la hidrofobicidad y del peso molecular en vez de punto isoeléctrico (pI) y peso molecular 28y no limitar la separación de proteínas de un gama específica de pI. Similar al clásico 2D-PAGE, separadas proteínas son visibles como puntos individuales, pero en una diagonal línea 4,28 (figura 5, figura 6). Más proteínas hidrofóbicas aparecen en lugares por encima de esta diagonal, mientras más proteínas hidrofílicas se encuentran por debajo de la línea28. Las concentraciones de poliacrilamida utilizadas en este protocolo también separarán proteínas entre 25 y 80 kDa. Para permitir una separación de las proteínas más pequeñas o más grandes la poliacrilamida se puede variar la concentración o geles de gradiente se pueden utilizar en la tercera dimensión. Los componentes del complejo IV (figura 3) separados por 3D-PAGE (figura 6) fueron cortados, tripsina digiere y analizados por espectrometría de masas. Esto dio lugar a la identificación de varias ligasas de tRNA. Los componentes de los otros complejos han sido publicados recientemente 4. Nuestra página de 3D permitió la separación de ligasas diferentes, es decir, aspartato, Asparagina, treonina, ligasas lisina y glicina, con pesos moleculares similares (tabla 3). Utilizando una sonda de metionina ARNt específico, fueron capaces de detectar tRNA potencialmente consolidados dentro de complejo IV pero si tRNA completos o fragmentos de tRNA en el complejo no pueden ser discriminados con las sondas. Para comprobar si los ácidos nucleicos son realmente consolidados dentro del complejo y no Co migrar, proteasa digirió savia del floema podrían servir de muestras controles migratorios adecuados.
Se ha especulado antes que traducción de la proteína puede ocurrir dentro de tubos de tamiz del floema, ya que la casi mayoría de los componentes del ribosoma entero así como los factores de elongación se han encontrado en muestras de líber4,7. Nuestro hallazgo de tRNA y ligasas tRNA parece apoyar esta idea. Sin embargo, fragmentos de ARNt presentes en muestras de líber de calabaza han demostrado ser potentes inhibidores de la traducción en42 y los ribosomas funcionales parecen ser ausente4, lo que sugiere que la traducción no puede ocurrir.
Tomados en conjunto, el protocolo que presentamos permite la separación de proteínas: proteína nativa y hasta complejos de RNP de líber de muestras y la separación e identificación de sus componentes individuales de alta resolución. La aplicación de este método permite el descubrimiento de nuevas proteínas y complejos de RNP en muestras de floema y por lo tanto puede dilucidar nuevas funciones en este compartimiento de plantas altamente especializadas.

Los conductos de larga distancia del floema son esenciales para la asignación de nutrientes orgánicos en las plantas superiores, pero también están involucrados en la regulación de diferentes procesos importantes para el crecimiento y desarrollo, defensa del patógeno y la adaptación a las adversas condiciones ambientales. Además de pequeños generadores como los iones, fitohormonas o metabolitos propios, macromoléculas como las proteínas y RNAs recientemente han surgido como potenciales señales.
Los estudios han demostrado que la carga del floema de las proteínas es tamaño dependiente y controlado por el límite de exclusión de tamaño (SEL) de las unidades poro plasmodesmal conectar células acompañantes (CC) y elementos (SE) que se encuentran típicamente en el rango de 10 a del tamiz > 67 kDa1 , 2 , 3. sin embargo, a pesar de estas proteínas más grandes de la limitaciones de tamaño y de la proteína se han encontrado complejos dentro del sistema de líber desafiando la idea de exclusión de tamaño4, y aún no específica pérdida de proteínas del CC que SE ha sido sugerida5 .
Complejos de multiproteínas como grandes ribonucleoproteína juegan un papel fundamental en la biosíntesis y mantenimiento de la integridad estructural de la célula6. Hay pruebas de que complejos de proteínas y ribonucleoproteína de líber-móvil existen4,7, pero hasta la fecha se conoce poco sobre su función. En elementos de floema tamiz: proteína y RNP complejos se han implicado con transporte interurbano o señalización de8,9. Para desentrañar las funciones de los complejos translocados, estudiando su composición bajo variables ambiental o condiciones de estrés es necesarias. Para lograr esto, nativos complejos tienen que ser aislados y sus componentes deberán estar separadas con suficiente resolución.
Para aislar los complejos de alto peso molecular desde el floema, es necesario obtener muestras de sap en suficiente calidad y cantidad. La técnica que puede utilizarse para el muestreo de floema depende de las especies vegetales de interés. Tres métodos principales para obtener la savia del floema existen 10: insectos stylectomy11, exudación de EDTA facilita12y exudación espontánea13.
Muestras de líber de thaliana de Arabidopsis (dea. thaliana), la planta modelo importantes en laboratorios de todo el mundo, sólo pueden obtenerse un facilitado de EDTA exudación o pulgón stylectomy14,15. Ambos métodos conducen a la savia del floema altamente diluido o cantidades de muestra muy bajo. Exudación de EDTA facilita también es propensa a la contaminación y no pudo representar el floema real composición16. Exudación espontánea líber se limita a plantar especies como cucurbitáceas, lupino o yuca, donde cortar partes de la planta lleva a una emisión espontánea de savia del floema que puede ser fácilmente recogidos13,17,18, 19. Recientemente establecimos colza (Brassica napus) como un sistema de modelo adecuado para el análisis del floema, ya que es un pariente cercano de a. thaliana y varios microlitros de savia del floema pueden obtenerse en pequeñas incisiones que se ha demostrado que ser de alta pureza4,8,20. Además, la secuencia del genoma B. napus fue lanzada en 201421.
Excepto pulgón stylectomy, todos los métodos de colección de líber descritos incluyen daño del tejido en el sitio de muestreo, y la composición de la savia del floema puede cambiar en respuesta a la lesión. Por lo tanto, es esencial para comprobar la calidad de las muestras de líber, independientemente del método de muestreo aplicado. Existen diferentes métodos para el control de calidad de sap líber recogidos, por ejemplo, por determinación de la actividad22,23Rnasa, RT-PCR con cebadores contra Rubisco8,24o el análisis del azúcar composición8.
Pueden aplicarse diferentes métodos para aislar y separar los complejos, incluyendo la cromatografía por exclusión de tamaño, ultracentrifugación de densidad de sacarosa o filtración de la muestra a través de membranas con distinto peso molecular cortado offs. Sin embargo, estos enfoques no permiten alta resolución. La técnica denominada página nativa azul (BN-PAGE), primero descrita por Schägger et al. 25, es superior en términos de resolución. Fue utilizado con éxito para determinar los pesos moleculares de complejos de proteína nativa grande de varios organelos o Lisados celulares y su abundancia relativa26,27.
Para aclarar más lejos la composición compleja de complejos de la proteína, es necesario separar los componentes individuales bajo desnaturalizar condiciones, hacia el desmontaje de los componentes del complejo. Esto puede lograrse mediante una segunda dimensión de SDS-PAGE 28,29 o, para lograr una resolución más alta, por una segunda dimensión de la concentración isoeléctrica (IEF) seguida por un third dimension de SDS-PAGE30 y posterior identificación de las proteínas mediante espectrometría de masas.
En este protocolo, se describen el muestreo de savia pura líber de las plantas B. napus y el análisis de los complejos de la proteína de estas muestras de floema usando un acercamiento electroforético 3D combina BN-PAGE con Tris-Tricina-urea-PAGE y SDS-PAGE. Los componentes complejos de proteínas separadas se identifican posteriormente mediante espectrometría de masas. Además, presentamos el borrar norteño nativa azul como método permitiendo la detección de ARN grande de complejos RNP4, extender la aplicabilidad del enfoque.

<table><tbody><tr><td>Tubos de reacción de 1,5 mL</td><td>Peine Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>de 10 pocillos para SDS PAGE, espesor 1 mm</td><td>BioRad</td><td>1653359</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>AppliChem</td><td>131090</td><td></td></tr><tr><td>30 % solución de acrilamida-bisacrilamida (29:1)</td><td>BioRad</td><td>1610156</td><td></td></tr><tr><td>30 % Solución de acrilamida-bisacrilamida (37,5:1) BioRad</td><td></td><td></td><td></td>1610158</tr><tr><td>96 % Etanol</td><td>Carl Roth</td><td>P075</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Carl Roth</td><td>6755</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de aluminio-(14-18)-hidrato</td><td>AppliChem</td><td>141101</td><td></td></tr><tr><td>Peroxodisulfato de amonio (APS)</td><td>Carl Roth</td><td>9592.3</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>AppliChem</td><td>A3992</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>AppliChem</td><td>A2940</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>AppliChem</td><td>A2331</td><td></td></tr><tr><td>Concentradores centrífugos p. ej. Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa)</td><td>Sartorius</td><td>VS0102</td><td></td></tr><tr><td>Kit de módulo de detección de ácido nucleico quimioluminiscente</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89880</td><td></td></tr><tr><td>Papeles de cromatografía p. ej. 3 mm CHR</td><td>Whatman</td><td>3030-153</td><td></td></tr><tr><td>CoolBox M30 System</td><td>Biocision</td><td>BCS-133</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie brilliant Blue G-250</td><td>AppliChem</td><td>A3480</td><td></td></tr><tr><td>Pirocarbonato de dietilo (DEPC)</td><td>AppliChem</td><td>A0881</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A1101</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Etanol abs.</td><td>AppliChem</td><td>A3693</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td>Sistema de imagen en gel <td>AppliChem</td><td>A1103</td><td></td></tr><tr><td>p. ej. Chemidoc Touch</td><td>BioRad</td><td>1708370</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>AppliChem</td><td>141339</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>AppliChem</td><td>131340</td><td></td></tr><tr><td>Bloque calefactor TS1</td><td>Biometra</td><td>846-051-500</td><td></td></tr><tr><td>Horno de hibridación p. ej. Incubadora de hibridación GFL 7601</td><td>GFL</td><td>7601</td><td></td></tr><tr><td>Aguja hipodérmica (0,8 mm)</td><td>B Peine</td><td></td> de gel Braun 4658309 <td></td></tr><tr><td>IPG, espesor 1 mm</td><td>BioRad</td><td></td> 1653367 <td></td></tr><tr><td>Marcaje de ARN p. ej.Biotina 3'end Kit de etiquetado de ADN</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89818</td><td></td></tr><tr><td>Gel degradado nativo p. ej. Novex NativePAGE 4&ndash; 16% Gel de proteína Bis-Tris</td><td>Invitrogen</td><td>BN1002BOX</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nailon p. ej. Hybond-N+</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>Ácido ortofosfórico</td><td>Carl Roth</td><td>6366.1</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler escalera de proteínas preteñida</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de alimentación para electroforesis en gel EPS</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>18-1130-01</td><td>disponible en GE Healthcare</td></tr><tr><td>RNA Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Semi dry blot e.g. Fastblot 43B semiseco Blot</td><td>Biometra</td><td>846-015-100</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>AppliChem</td><td>A1149</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio (SDS)</td><td>AppliChem</td><td>142363</td><td></td></tr><tr><td>Síntesis de ADNc p. ej. RevertAid Kit de síntesis de ADNc de primera hebra</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1621</td><td></td></tr><tr><td>Tetrametiletilendiamina (TEMED)</td><td>AppliChem</td><td>A1148</td><td></td></tr><tr><td>Tricina</td><td>AppliChem</td><td>A3954</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisódico dihidratado</td><td>AppliChem</td><td>A3901</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reactivo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>ULTRAhyb Tampón de hibridación ultrasensible</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM8670</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>AppliChem</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>Reticulante UV p. ej. Stratalinker 2400</td><td>Agilent</td><td>NC0477671</td><td>de Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Aparato de electroforesis vertical p. ej.The XCell SureLock Mini-Cell o Mini-Protean III System</td><td>Thermo Fisher Scientific o BioRad</td><td>EI0001 o 1658004</td><td></td></tr><tr><td>Wipers e.g. KIMWIPES Delicate Limpiaparabrisas</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr></tbody></table>

muestreo de sap de líber de brassica napus para 3d-página de proteínas y complejos de ribonucleoproteína

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Muestreo el floema de las plantas superiores es a menudo laborioso y significativamente dependiente de las especies de plantas. Sin embargo, estudios de proteoma bajo desnaturalizar condiciones pueden lograrse en diferentes especies de plantas. Nativa: proteína y proteína: complejos de ácidos nucleicos de muestras de líber aún apenas se han analizado, aunque podría desempeñar un papel importante en el mantenimiento de este compartimiento especializado o en la señalización de larga distancia. Grandes ensamblajes moleculares pueden ser aislados mediante una electroforesis nativa azul (BN-PAGE). Sus componentes de proteínas se pueden separar por un dodecil sulfato de sodio posterior página (SDS-PAGE). Sin embargo, las proteínas con pesos moleculares similares Co migran, lo que puede dificultar la identificación de proteínas por espectrometría de masas. Combinación de BN-PAGE a dos diferentes desnaturalización gel de electroforesis, es decir, Tris-Tricina-urea y SDS-PAGE, permite la separación adicional de proteínas según su hidrofilicidad/hidrofobicidad y así aumenta la resolución y el éxito de identificación de proteínas. Incluso permite distinguir proteínas que sólo difieren en sus modificaciones postraduccionales. Además, el borrar norteño nativa azul se puede aplicar para identificar los componentes de RNA en complejos macromoleculares. Demostramos que nuestro protocolo es adecuado para desentrañar la proteína y RNA componentes de proteína: proteína nativa y complejos de ribonucleoproteína (RNP) que ocurre en las muestras de líber. Combinar un azul nativo con dos pasos diferentes de página desnaturalización puede ayudar a separar los diferentes tipos de complejos de proteínas grandes y también permite una tasa de aumento de la identificación de sus componentes por espectrometría de masas. Además, el protocolo es lo suficientemente robusto como para detectar simultáneamente potencialmente enlazados ácidos nucleicos dentro de complejos de proteína sola.

Aquí presentamos un protocolo para analizar la composición de proteína de proteína: proteína nativa grande y proteínas: complejos de ácido nucleico de colza (B. napus) exudado líber utilizando un enfoque 3D poliacrilamida gel electroforesis (PAGE) combinando azul nativo (BN) con dos páginas desnaturalización seguida de identificación espectrométrica de masa.

Muestreo de Sap de líber de Brassica napus para 3D-página de proteínas y complejos de ribonucleoproteína

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...

El objetivo general de este procedimiento 3D-PAGE es separar los complejos de proteínas y ribonucleoproteínas de la savia de Brassica napus ploem, junto con la identificación de los respectivos componentes de ácidos nucleicos y proteínas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en bioquímica y fisiología vegetal. Por ejemplo, puede analizar la composición de los complejos del floema bajo estrés.La principal ventaja de la técnica es que se puede recolectar savia pura del floema y analizar simultáneamente los ácidos nucleicos, así como los componentes de las proteínas. Aunque este método puede proporcionar información sobre las interacciones de proteínas, proteínas y ácidos nucleicos proteicos dentro del sistema de floema de la colza, también se puede aplicar al análisis de floemas de otras plantas como cucurbitáceas, altramuces y yuca. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando intentamos identificar socios de interacción entre proteínas y ARN para una proteína específica del floema.Primero, perfore el tallo inflorescente de una planta B. napus de ocho semanas varias veces con una aguja hipodérmica de 0,8 milímetros. Perfore varios otros tallos inflorescentes en la misma planta y otras plantas para obtener suficiente savia de floema. Limpie la primera gota de cada sitio lesionado con papel de filtro.Después de retirar las primeras gotas, utilice una pipeta para recoger las gotas restantes. Y transfiéralos a un tubo de reacción cónico preenfriado de 1,5 mililitros. A continuación, almacene el exudado recogido a menos 20 grados centígrados utilizando un sistema de refrigeración sin hielo.Continúe recogiendo gotas hasta que no se observe más formación de gotas, pero no más de una hora. A continuación, agregue la muestra de floema a un concentrador centrífugo con un peso molecular cortado de 10.000 daltons, y concéntrelo hasta aproximadamente 1/6 del volumen inicial. A continuación, centrifugar la muestra concentrada a cuatro grados centígrados y 20.000 g durante al menos 15 minutos para eliminar las partículas de polvo.Para realizar PAGE nativo azul, ensamble la cámara de gel. Y agregue el tampón de cátodo azul oscuro B a la mitad y lave los pozos con el tampón de cátodo. Cargue de 20 a 30 microgramos de la muestra de proteína concentrada por pocillo en un gel radiante comercial Bis-Tris en al menos triplicado.Llene la cámara con tampón de cátodo y ánodo, y haga funcionar el gel a cuatro grados centígrados y 150 voltios hasta que la muestra pase 1/3 del gel, lo que tarda de 20 a 30 minutos. Detenga la ejecución de un tampón de cátodo azul oscuro B por un tampón de cátodo azul claro B 1/10. Reinicie la carrera y continúe hasta que el frente azul comience a eluir fuera del gel, lo que tarda de 120 a 180 minutos.Recorta un carril de gel completo del gel azul nativo, luego transfiérelo a una membrana de nailon mediante secado semiseco y marca los bordes superior e inferior del gel en la membrana con un lápiz. Después de secar, lave la membrana con agua tratada con DEPC y colóquela entre dos trozos de papel de filtro para que se seque. A continuación, realice la reticulación UV de la membrana seca con una energía aplicada de 120.000 microjulios por centímetro cuadrado.Ahora, prehibrida la membrana reticulada UV con seis mililitros de tampón de hibridación durante 60 minutos a 68 grados Celsius en un horno de hibridación. Agregue un mililitro adicional de tampón de hibridación que contenga cuatro microlitros de sondas biotiniladas de 3 cebadores a la membrana. Luego, incube la membrana con la sonda durante la noche mientras enfría el horno de hibridación de 68 a 37 grados centígrados.Al día siguiente, lave la membrana con un tampón que contenga 2x SSC y 0,1 % de SDS durante cinco minutos a temperatura ambiente para eliminar las sondas unidas de forma inespecífica. Realice la detección de las sondas biotiniladas de 3 cebadores en la membrana con un conjugado de estreptavidina HRP y luminol como sustrato de peroxidasa de rábano picante, lo que resulta en una reacción quimioluminiscente sensible. Extirpe las bandas individuales del gel nativo azul.Combine bandas de muestras ejecutadas en carriles paralelos en un tubo de reacción cónico de 1,5 mililitros para lograr una mayor concentración de proteínas complejas. Para preparar un gel de urea Tris-Tricine al 12%, vierta 10 mililitros de solución de gel A entre dos placas de vidrio y superponga con isopropanol. Después de la polimerización, retire el isopropanol, agregue de dos a tres mililitros de solución de gel B al gel e inserte un peine de 10 pocillos.Para equilibrar las piezas de gel extirpadas, agregue un mililitro de tampón de muestra SDS 2x en el tubo de reacción. Después de incubar la muestra durante 10 minutos a temperatura ambiente, calentar en un bloque calefactor a 95 grados centígrados durante aproximadamente un minuto. A continuación, incubar la muestra a temperatura ambiente durante 15 minutos.A continuación, apila varias piezas de gel equilibradas que representen el mismo complejo en una sola bolsa de gel. Después de ensamblar la cámara de gel, realice la electroforesis utilizando tampones de funcionamiento de ánodo y cátodo a 150 voltios durante 45 a 60 minutos. Cuando termine, extirpe todo el carril de gel.Incubar el carril de gel cortado durante 20 minutos en tampón ácido. Luego, equilibre en Tris-HCL 125 milimolares a pH 6.8 durante otros 20 minutos. Vierta una solución de gel separador al 15%SDS de acuerdo con el carril.Una vez que el gel se solidifique, retire el isopropanol, agregue tres mililitros de una solución de gel apilable al 4% e inserte el peine especial para geles IPG. Después de la solidificación, transfiera el carril de gel equilibrado al gel SDS y cubra el gel con 0,5% de agarosa en 1x tampón de funcionamiento SDS complementado con un rastro de azul de bromofenol. Después de ensamblar la cámara de gel, haga funcionar el gel a 150 voltios durante 60 minutos.Cuando termine, tiña el gel con una solución coloidal de Kumasi para su posterior análisis por espectrometría de masas. Por último, analice las manchas de proteínas visibles mediante espectrometría de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz. Aquí se muestra un resultado representativo obtenido de una muestra de floema puro.Las muestras de floema no contaminadas muestran una banda visible para la edad de la tiorredoxina, mientras que no se observa ninguna señal para RuBisCO y la proteína de la cubierta de polen. Al menos cuatro bandas principales del complejo proteico se hacen visibles después de BN PAGE de la savia del floema de B. napus. Concentraciones demasiado bajas o demasiado altas de savia de floema no permiten una separación clara de los complejos.Se observa una separación de alta resolución en 3D PAGE debido a los diferentes comportamientos de migración de proteínas en los geles de urea y SDS-PAGE. Por lo general, las proteínas que pertenecen a un solo complejo serán visibles como una línea diagonal a través del gel. Las proteínas por encima de esta línea tienen una mayor hidrofobicidad, mientras que las proteínas por debajo de la línea son más hidrofílicas.La transferencia BN Northern muestra que un ARNt específico solo está presente en un complejo específico. El análisis de espectrometría de masas mostró que este complejo contiene principalmente ligasas de ARNt que confirman la actividad de unión de ARNt encontrada por la transferencia BN norte. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres días si se realiza correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar guantes y una bata de laboratorio para minimizar la contaminación por caroteno que dificultará el análisis de espectrometría de masas. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como zimogramas y ensayos enzimáticos con savia de floema recolectada, para responder preguntas adicionales, como estudios complejos de actividad e inhibición. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la ciencia de las plantas exploraran complejos de subunidades múltiples en muestras de floema de diferentes especies de plantas.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar la savia del floema de las plantas de Brassica napus, y cómo aislar y analizar proteínas y complejos de ácidos nucleicos de proteínas. No olvide que trabajar con SDS, acrilamida y TMET puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como trabajar debajo del capó con guantes y una bata de laboratorio mientras se realiza este procedimiento.

phloem-sap-sampling-from-brassica-napus-for-3d-page-protein

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

La base molecular de las respuestas específicas de espacio-fitocromo está siendo investigado el uso de plantas transgénicas que presentan los tejidos y órganos específicos deficiencias fitocromo. El aislamiento de células específicas exhibir agotamiento inducido cromóforo fitocromo por fluorescencia de células activadas clasificación seguido por análisis de microarrays se está utilizando para identificar genes implicados en el espacio-las respuestas específicas de fitocromo.

La investigación de los tejidos y órganos específicos de las respuestas fitocromo usando FACS asistida por células de tipo Perfiles de expresión específica en Arabidopsis thaliana</em

Hemos desarrollado una técnica para probar interacciones proteína-proteína en las plantas. Una proteína amarilla fluorescente (YFP) se divide en dos fragmentos que no se superponen. Cada fragmento se clona en el marco de un gen de interés a través del sistema de puerta de enlace, lo que permite la expresión de proteínas de fusión. La reconstitución de la señal de YFP sólo ocurre cuando las proteínas interactúan investigación.

Detección de interacciones de proteínas en la planta mediante un Gateway Compatible Complementación fluorescencia bimoleculares (BiFC) del sistema

Se describe aquí un protocolo para la purificación y caracterización de complejos de proteínas vegetales. Demostramos que por immunoprecipitating una sola proteína dentro de un complejo, para que podamos identificar sus modificaciones posteriores a la traducción y sus socios que interactúan.

Identificación de modificaciones post-traduccionales de la proteína vegetal Complejos

El enfoque descrito comparativa, cuantitativa proteómica tiene por objeto la obtención de conocimientos sobre la composición de los complejos multiproteicos bajo diferentes condiciones y se demuestra comparando genéticamente diferentes cepas. Para el análisis cuantitativo volúmenes iguales de diferentes fracciones de un gradiente de densidad de sacarosa se mezclan y se analizaron por espectrometría de masas.

Un nuevo enfoque para el análisis comparativo de Multiproteinas complejos basados ​​en<sup&gt; 15</sup&gt; N metabólico Etiquetado y cuantitativa de Espectrometría de Masas

El conocimiento de la composición de la savia del floema, así como el mecanismo de su transporte de carga y de larga distancia es esencial para la comprensión de la señalización de larga distancia en el desarrollo de la planta y el estrés / respuesta patógeno y de transporte de asimilados. Este manuscrito describe la colección de exudados del floema utilizando el método de EDTA-facilitado.

Recopilación y análisis de<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floema exudados mediante el método de EDTA-facilitado

Degradación de la proteína dirigida representa un mecanismo de regulación importante para la función celular. Se produce a través de una vía ubiquitina-proteasoma conservada, que se conecta polyubiquitin cadenas a la proteína diana que luego sirven "etiquetas" como moleculares para el proteasoma 26S. Aquí se describe un ensayo libre de células simple y confiable para la degradación proteasomal de proteínas.

Ensayo Proteasomal degradación en un sistema libre de células en las plantas

Este protocolo detalla la extracción optimizada del fluido de lavado de apoplasto de las hojas de las plantas, utilizando plantas de frijol francés (Phaseolus vulgaris) como ejemplo modelo.

La técnica de infiltración-centrifugación para extracción de apoplástico fluido procedente de hojas de la planta Uso Phaseolus vulgaris Como ejemplo

Aquí, presentamos un protocolo de captura interactome aplicado a Arabidopsis thaliana protoplastos hoja mesófilo. Este método depende crıticamente de la reticulación UV in vivo y permite el aislamiento e identificación de proteınas de unión a mRNA de plantas desde un entorno fisiológico.

ARNm Interactome Captura de Planta Protoplastos

Las interacciones proteína-proteína y proteína-metabolito son cruciales para todas las funciones celulares. Adjunto, describimos un protocolo que permite el análisis paralelo de estas interacciones con una proteína de elección. Nuestro protocolo fue optimizado para cultivos de células vegetales y combina la purificación de la afinidad con la proteína basada en espectrometría de masa y detección de metabolitos.

2 en 1: purificación de la afinidad para el análisis paralelo de proteínas y complejos de proteína-metabolito de un solo paso

Aquí se presenta un enfoque fosfoproteómico, a saber, detener e ir extracción a base de punta fosfoproteómica, que proporciona alto rendimiento y cobertura profunda de arabidopsis fosfoproteoma. Este enfoque delinea la visión general de la señalización de estrés osmótico en Arabidopsis.

Estrategia fosfoproteómica para perfilar la señalización de estrés osmótico en Arabidopsis

El presente protocolo describe un método optimizado para la observación histológica de agallas inducidas por Plasmodiophora brassicae. Las secciones de vibratomo de los hipocótilos se eliminan antes de las imágenes de fluorescencia para estudiar la participación de factores de transcripción y fitohormonas durante la progresión de la enfermedad. Este protocolo supera las limitaciones de incrustación de resina, permitiendo la visualización en planta de proteínas fluorescentes.

Combinación de microscopía de limpieza y fluorescencia para visualizar cambios en la expresión génica y respuestas fisiológicas a Plasmodiophora brassicae

Aprende a aislar y analizar complejos de proteínas y ribonucleoproteínas del savia de floema de Brassica napus mediante electroforesis 3D-PAGE. Este método permite la identificación simultánea de componentes proteicos y de ácidos nucleicos.

Muestreo de Sap de líber de Brassica napus para 3D-página de proteínas y complejos de ribonucleoproteína

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