Name: Aislamiento de las células dendríticas del tracto reproductivo femenino humano estudios fenotípica y funcional (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Aprende a aislar células dendríticas del tracto reproductivo femenino humano para estudios fenotípicos y funcionales. Este método preserva marcadores de superficie y permite su aplicación en otras células inmunes.

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Becas de estudio apoyado por los NIH AI102838 y AI117739 (CRW). Agradecemos a Richard Rossoll para asistencia técnica. Análisis cytometric del flujo se llevó a cabo en DartLab, el recurso compartido Dartmouthsupported por (P30CA023108-37) y (P30GM103415-15).

Se realizaron estudios en seres humanos según los principios expresados en la declaración de Helsinki. Los estudios fueron aprobados por la Junta de revisión institucional de Dartmouth College y el Comité para la protección de sujetos humanos (CPHS). Consentimiento informado escrito fue obtenido antes de la cirugía de HIV-negative mujeres sometidas a histerectomía en el Dartmouth-Hitchcock Medical Center (Líbano, NH). Patólogos entrenados seleccionan muestras de tejido de la EM, CX y ECX, libre de lesiones patológicas y distante de los sitios de la patología. Se obtuvieron muestras de sangre de donantes sanos voluntarios reclutados en Dartmouth Hitchcock Medical Center. Los donantes de sangre eran anónimos. Tejidos EM, CX y ECX recientemente aislados de la sala de operaciones fueron trasladados a patología para aislamiento y clasificación previa transferir a nuestro laboratorio en tubos de polipropileno estériles, separados.
1. enzimática digestión de los tejidos
Nota: Utilizar material estéril y trabajar en un gabinete de seguridad biológica.
<ol><li>Preparación equilibrio sal solución (HBSS de un Hank modificado) 1 x HBSS con rojo de fenol, 100 U/mL penicilina-estreptomicina, 0,35 g/L de NaHCO3y 20 mM HEPES.</li>
	<li>Preparar el cóctel enzimático (modificado desoxirribonucleasa de 0.01% [wt/vol] HBSS, 450 U/mL colagenasa IV, I y D-glucosa de 2 mg/mL). Pasar la solución a través de un filtro estéril de 0,22 μm. Lo ideal es preparar la enzima de digestión en el día de uso, pero puede ser congelado a-20 ° C para el almacenamiento. Evitar congelaciones y descongelaciones ciclos repetidas.</li>
	<li>Enjuague el tejido con modificado HBSS y colóquelos en una placa de Petri 100 x 15 mm2 . Ajustar el tamaño del plato de Petri basada en la cantidad de tejido disponible y el volumen de enzima cóctel utilizado (ver paso siguiente 1.4.2). Nota: Los tejidos varían en tamaño dependiendo de la muestra quirúrgica de la patología, que van desde 1-10 g.</li>
	<li>Tratamiento con bisturí desechable y pinzas:<ol>
<li>Añadir unos 3 mL de enzima de digestión cóctel al tejido para evitar que se sequen durante el corte.</li>
		<li>Utilice pinzas para estabilizar el tejido y pique con un bisturí para aumentar la superficie de los tejidos expuestos a la enzima de digestión cóctel. Cortar el tejido en trozos pequeños (< 2 mm en un lado). Añadir el cóctel de enzima de digestión suficiente para cubrir todas las piezas del tejido (5 mL/g de tejido). Coloque la tapa en la caja Petri.</li>
		<li>Incubar a 37 ° C con 5% CO2 en un rotador a aproximadamente 80 rpm durante 45 min., asegúrese de que la velocidad del rotor completamente mezcla el cóctel de la enzima de digestión sin derramarse o producir burbujas.</li>
		<li>Visualizar la preparación de tejido con un microscopio de luz invertido con el 4 X y 10 X objetivos. Nota: Después de la digestión, pequeños fragmentos de tejido y una suspensión mixta incluyendo las glándulas epiteliales visibles deben estar presentes (ver figura 1A).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. separación de las células
<ol><li>En un ambiente estéril, coloque una malla de 250 μm tenso con soporte en un plato de Petri de 150 x 15 mm2 . Asegúrese que la malla es aproximadamente 0,5 cm por encima de la superficie de la placa de Petri.</li>
	<li>Mojar la malla con 2 mL de HBSS modificado y transferir el tejido digerido a la malla.</li>
	<li>Con la superficie plana de un émbolo de la jeringa de 10 mL, suavemente pero con firmeza, moler el tejido digerido picadito a través de la malla. PRECAUCIÓN: Molienda demasiado agresivamente dañará el acoplamiento y aumentar la mortalidad celular. Este paso será separar las células epiteliales y células del estroma (incluyendo las células inmunes) el tejido conectivo y el moco.</li>
	<li>Una vez que los fragmentos de tejido han sido completamente dispersados, elevar la malla y el soporte de 2-3 cm por encima del plato de Petri y enjuague con 3 mL de modificado HBSS recuperar células adicionales.</li>
	<li>Recoger la suspensión de células. Coloque la malla de 20 μm con soporte en una placa de Petri y húmedas con 2 mL de HBSS modificado. Verter la suspensión de células a través de la malla que sostiene la malla 2-3 cm por encima del plato de Petri y enjuague con 6 mL de HBSS modificado. Nota: Este paso separa las hojas epiteliales, que se conservan en la parte superior, de las células que pasan a través de la malla. El flujo a través es una suspensión mixta, que incluye las células inmunes y los fibroblastos estromales.</li>
	<li>Recoger el mezclado de la célula suspensión y centrifugar a 500 x g durante 10 minutos, aspirar el líquido y resuspender el precipitado en 4 mL de HBSS modificado para la centrifugación de gradiente de densidad.</li>
	<li>Capa de la suspensión de células mixtas sobre 3 mL de solución de polysucrose y centrifugar a temperatura ambiente a 500 x g por 30 min con ningún freno. Recoger la banda blanca de la parte superior de la solución de polysucrose y lavar con PBS. Nota: Esta fracción es la suspensión enriquecido mezclado de la célula, que es rico en células inmunitarias y contiene algunos fibroblastos estromales.</li>
</ol>3. retiro de Cell muerto
Nota: Si un gran porcentaje de las células muertas (> 20%) está presente en la suspensión celular mixto enriquecido después de la centrifugación de gradiente de densidad, se recomienda la eliminación de células muertas con bolas magnéticas. Las células muertas deben eliminarse ya que puede interferir con el proceso de selección de grano magnético positivo.
<ol><li>Contar las células usando un hemocitómetro en un microscopio óptico con objetivo 10 X. Desactivación de todas las células en la suspensión celular mixto enriquecido (500 x g, 10 min, 4 ° C). Totalmente aspirar y descartar el sobrenadante. Añada 100 μl de perlas de eliminación de células muertas por 1 x 107 células totales (vivas y muertas), según las instrucciones del fabricante. Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.</li>
	<li>Coloque un filtro de 30 μm en la columna magnética, aplique la suspensión de células y las células grano marcado a caer por la columna magnética.</li>
	<li>Enjuagar la columna con tampón de eliminación de células muertas como recomendada (3 mL). Recoger el paso que contiene las células vivas. El rango de recuperación de la célula después de la eliminación de células muertas se presenta en la figura 1B. Nota: Estas células se pueden utilizar para realizar citometría de flujo para estudios fenotípicas (sección 5) o continuar con el aislamiento de DC (sección 4).</li>
</ol>4. C.C. purificación por selección positiva grano magnético
<ol><li>Después del retiro de células muertas (paso 3.2), las células de la vuelta abajo, quite el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 80 μl de tampón de selección magnética por 1 x 107 células (PBS, 0,5% inactivado con calor AB suero humano (HS), 2 mM EDTA).</li>
	<li>Selección positiva de las poblaciones de DC, añadir granos magnéticos CD1a o CD14 según las instrucciones del fabricante (20 μl granos magnéticos por 1 x 107 células). Incubar 15 min a 4° C.
</li>
	<li>Lavar las células con el búfer de selección magnética, desactivación y elimine completamente el tampón. Resuspender las células en un mínimo de 500 μl de tampón de selección magnética.</li>
	<li>Atar la columna al imán y añadir un filtro μm 30 en la parte superior de la columna para retener cualquier grupos de célula restante. Enjuague el filtro y la columna con tampón de selección magnética como se recomienda.</li>
	<li>Aplicar la suspensión de células a la columna. Enjuagar 3 veces con tampón de selección magnética.</li>
	<li>Transfiera la columna a un tubo de 15 mL, agregar 5 mL de búfer de selección magnética y aplicar el émbolo para liberar las celdas seleccionadas de la columna.</li>
	<li>Para aumentar la pureza, repita pasos 4.4-4.6 con las células recuperadas mediante una nueva columna. El rango de recuperación de la célula después de selección de grano magnético se presenta en la figura 1.</li>
</ol>5. evaluación de la pureza de la célula: microscopia y citometría de flujo
<ol><li>Anticuerpo para citometría de flujo:<ol>
<li>Resuspenda cuidadosamente hasta 1 x 106 células en 100 μl de PBS con un 20% inactivado con calor HS para bloquear los receptores de Fc e incubar por 10 min en hielo.</li>
		<li>Añadir la etiqueta fluorescente anticuerpos y reactivos para la identificación de células muertas (por ejemplo, ver sección 6.5). Set fluorescencia menos uno controla (FMO) a establecer las puertas y usar cuentas de compensación para preparar manchas solo controles de compensación. En la tabla 1se dan ejemplos de anticuerpos utilizados. Incubar por 20 min a 4 ° C, protegido de la luz.</li>
		<li>Lavar las células con 2 mL de búfer de selección magnética. Nota: La presencia de EDTA es importante para evitar la formación de aglutinación para análisis cytometric del flujo de la célula. Desactivación y descarte el sobrenadante.</li>
		<li>Fijar las células mediante la adición de 100 μl de solución de paraformaldehído al 2% por el tubo.</li>
		<li>Analizar las muestras en un citómetro de flujo10,11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uso de Giemsa tinción para analizar la morfología y girar la columna (por ejemplo, cytospin):<ol>
<li>Resuspender las células en 200 μL de tampón de selección magnética.</li>
		<li>La carga en una columna de vuelta y vuelta durante 5 minutos. Deje que la diapositiva se seque completamente.</li>
		<li>Fijar la corredera por inmersión en metanol 100% durante 2 minutos enjuagar el portaobjetos con agua desionizada y déjela al aire seco.</li>
		<li>Realizar una tinción de Giemsa de Wrights estándar. Cubrir las células con eosina incubar por 10 min, enjuagar con agua desionizada y dejar secar. Cubrir las células con tinción de Geimsa Wrights, incubar durante 1 min, enjuagar con agua desionizada y secar al aire.</li>
		<li>Examine las preparaciones con un microscopio invertido (figura 2A, objetivo 40 X).</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. trasplante allogeneic estimulación ensayo para evaluar la función de células DC
<ol><li>Descongelar las células mononucleares de sangre periférica congelados (PBMCs)<ol>
<li>Caliente de los medios de cultivo celular con 10% HS a 37 ° C.</li>
		<li>Descongele las PBMCs colocando el criotubo en un baño de agua de 37 ° C, hasta que quede una pequeña cantidad de medios de comunicación de la célula congelada en el criotubo. En un ambiente estéril, transferir el contenido del criotubo a 10 mL con célula de medios de cultivo con 10% HS en un tubo de 15mL.</li>
		<li>Centrifugue a ~ 500 x g durante 7 minutos Retire los medios de comunicación, dispersar el pellet, Resuspender el PBMCs en 10 mL de medio de cultivo celular con 10% HS y centrifugar las células.</li>
		<li>Repita el paso de lavado por tercera vez. Contar las células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selección de la célula de T de Naïve:<ol>
<li>Use un kit de selección selección negativa anticuerpo magnético celular para aislar ingenuo t-células según protocolo del fabricante.</li>
		<li>Después de aislamiento, comprobar la pureza utilizando anticuerpos CD45RA y CCR7. Nota: La pureza típica es > 99% ingenuo t-células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Naïve T-célula proliferación manchas de tinte:<ol>
<li>Preparar 600 μl de solución de x 2 de tinte de proliferación celular, protegiendo el tinte de la exposición a la luz.</li>
		<li>Lavar el ingenuo t-células 2 x con PBS. Resuspender las células en 500 μl PBS.</li>
		<li>Mientras suavemente Vortex las células en el gabinete, bioseguridad agregar 500 μl de colorante de proliferación para el ingenuo t-células.</li>
		<li>Incube las células 10 min a 37° C.
</li>
		<li>Detener la célula etiquetado añadiendo 5 mL de medio de cultivo celular con 10% HS a las células. Incubar en hielo durante 5 minutos protegido de la luz.</li>
		<li>Centrifugar las células a ~ 500 x g por 7 min, aspirar los medios de comunicación y resuspender las células en 4 ° C celda medios de cultivo con 10% HS. Repita dos veces más para un total de 3 lavados. Tomar una alícuota de células a contar antes de la última centrifugación. Nota: Típicamente, ingenuo final números de células T que van entre 5% y 15% de la cuenta inicial de células PBMC.</li>
		<li>Resuspender las células con los medios de cultivo celular con 10% HS a la concentración de células deseada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Co-cultivo de ingenuo DC alogénico células T:<ol>
<li>Placa de la aislada DCs y células de T ingenuas en una placa de 96 pocillos, fondo redondo, en una 1:15 relación de DCs para las células T. Asegúrese de que el número óptimo para DCs oscila entre 3.000 y 5.000 células/pocillo.</li>
		<li>Centrifugar la placa a ~ 500 x g durante 3 minutos asegurar que las células se encuentran en el centro del pozo. Contacto de célula a célula es importante para la señalización adecuada ocurrir.</li>
		<li>Incubar a 37 ° C durante 6 días. Supervisar el grupo de células, que aparecen en los pozos como ocurre proliferación, con el microscopio (Figura 3A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Flow cytometry tinción para evaluar la proliferación:<ol>
<li>Después de 6 días, las células pueden ser examinadas por citometría de flujo. Mancha el cocultivo para citometría de flujo.</li>
		<li>Preparar una solución de 2 x de tinte amarillo viabilidad (emisión máxima 572 nm) en PBS. Nota: Es importante el uso de PBS sin suero, como suero de proteínas interfieren con el tinte).</li>
		<li>Centrifugar la placa con las células en ~ 500 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Saque 100 μl del sobrenadante. Nota: en este punto recoger y almacenar el sobrenadante para el análisis independiente de factores solubles.</li>
		<li>Lavan las células dos veces con PBS: Añadir 150 μL/pocillo de PBS, centrifugar a ~ 500 x g durante 5 min, retirar 150 μL del sobrenadante con una pipeta. Asegúrese de que hay 50 μl de sobrenadante restante en cada pozo.</li>
		<li>Añadir 50 μl de 2 x viabilidad colorante a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min, protegido de la luz.</li>
		<li>Durante la incubación, preparar una mezcla maestra de marcadores del anticuerpo deseado. Por ejemplo: APC/Cy7 de CD3, CD4 PE, CD8 FITC, etc.
</li>
		<li>Añadir la mezcla de anticuerpos a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 10 min, protegido de la luz.</li>
		<li>Lavar las células 2 x con PBS + 2% HS: Añadir 150 μL/pocillo de PBS + 2% HS. Centrifugue a ~ 500 x g durante 5 minutos sacar 150 μL del sobrenadante con una pipeta.</li>
		<li>Fijar las células mediante la adición de 100 μL/pocillo de para-formaldehído al 2%. Si es necesario: transferencia de las células y los medios de comunicación a los tubos de polipropileno flujo cytometry. Tubos pueden mantenerse a 4 ° C y protegidos de la luz, hasta el análisis cytometric del flujo.</li>
		<li>Leer los tubos en un citómetro de flujo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar

Mucosa DCs son una población celular raro fuertemente influenciada por el ambiente del tejido, que cambia su fenotipo y la función una vez que entran en los tejidos3. Mientras que deriva la sangre DCs son un modelo muy útil, no representan completamente la diversidad de poblaciones de DC en los tejidos. Por lo tanto, para entender las características únicas de mucosa DCs, aislamiento de células primarias de los tejidos es necesario. Aislamiento de DCs de diferentes sitios anatómicos en la FRT ofre...

El FRT tiene la doble función de proteger contra patógenos permitiendo la implantación y el embarazo1. Para lograr esto, el FRT está compartimentado, con cada región anatómica mostrando características histológicas, inmunológicas y funcionales1.
DCs presentes en superficies de la mucosa que en contacto con microbios en el pulmón, el intestino y el tracto genital y vigilancia inmune por patógenos potenciales2. DCs tienen la capacidad única de primer ingenuo t-células y desencadenar respuestas inmunitarias adaptativa3. DCs en la FRT se especializan también tolerar antígenos extraños, como los que se encuentran en los espermatozoides y el desarrollo del feto, para permitir el embarazo acertado4. Por lo tanto, dependiendo de la ubicación, el fenotipo de la DC y la función va ser distintos. Es conocido que los DCs están fuertemente influenciadas por el ambiente del tejido, tal que su número, fenotipo y funciones son modificadas por el ambiente de tejidos en que residen3. Por lo tanto, para entender el papel que en las enfermedades infecciosas, embarazo y cáncer en la FRT FRT DCs, residente DCs necesitan ser estudiados, desde sangre derivada DC modelos son insuficientes para abordar las complejidades reglamentarias encontradas los tejidos de la FRT.
La caracterización de tejido humano DCs residente es difícil debido al bajo número de células presentes en los tejidos de la mucosa y la dificultad de obtener muestras de tejido humano. DCs se han estudiado en la FRT usando immunohistochemistry5,6, que informa sobre la ubicación del celular dentro del tejido, pero excluye los estudios funcionales y está limitada en el número de identificación de marcadores celulares que pueden analizarse a la vez. Por otra parte, los protocolos de aislamiento de célula para análisis cytometric del flujo han sido desarrollados7,8,9. Algunos de estos protocolos, aprovechando la capacidad migratoria de DCs para aislar las células que migran. Estos métodos generalmente requieren incubaciones durante la noche y la selección de DCs activados, pero no permiten el estudio de DCs en el estado estacionario.
Aquí, usando especímenes de la histerectomia, optimizado un protocolo para aislar DCs de diferentes sitios anatómicos en la FRT, el endometrio (EM), el endocervix (CX) y el ectocérvix (ECX), que permite el análisis fenotípicas y funcionales. Utiliza un protocolo no proteolytic digestión enzimática, podemos proceder inmediatamente después de la digestión de tejido a células aislamiento y flujo cytometric caracterización sin activación de la célula. Mediante citometría de flujo multicolor y adaptación de estudios funcionales de bajo número de células, podemos identificar y caracterizar los subconjuntos raros de DCs en los diferentes sitios de la FRT.

<table><tbody><tr><td>Solución salina equilibrada de Hank (HBSS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30015.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Hyclone</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa IV</td><td>Sigma</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonucleasa I</td><td>Worthington Bioquímica</td><td>LS002140</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Sigma Aldritch</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>0.22 mmm Stericup 500 mL&nbsp;</td><td>filtro Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>100mm x 15mm placa de Petri de poliestireno</td><td>Fisherbrand FB0875712</td><td></td><td></td></tr> placa de <tr><td>Petri de poliestireno de 150mm x 15mm</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>Placa de poliestireno de 150mm x 25mm</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>Placa</td></tr> <tr>de cultivo celular tratada<td>Incubadora Isotemp</td><td>Fisher Scientific</td><td>FICO3500TABB</td><td>5.0% CO2</sub</td></tr><tr><td>>American Rotator V</td><td>American DADE</td><td>R4140</td><td></td></tr><tr><td>250 mmm malla de nylon</td><td>Sefar</td><td>03-250/50</td><td></td></tr><tr><td>20 mmm malla de nylon</td><td>Sefar</td><td>03-20/14</td><td></td></tr><tr><td>Beckman GS-6R Centrífuga</td><td>Beckman</td><td>358702</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 con Gentamicina L-GLN, Rojo de fenol, 1 L</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>Suero AB humano</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma Aldritch</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Solución tampón de fosfato (PBS)</td><td>National Diagnostics</td><td>CL-253</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>Kit de eliminación de células muertas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de preseparación (30um)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Columna LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-410</td><td></td></tr><tr><td>Separador Quadro MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACS multi-soporte</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>USB</td><td>15694</td><td></td></tr><tr><td>CD1a Microperlas humanas</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-051-001</td><td></td></tr><tr><td>CD14 Microperlas, humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>eFluor 670 colorante de proliferación celular</td><td>eBiosciences</td><td>65-0840-85</td><td></td></tr><tr><td>placa inferior redonda de 96 pocillos</td><td>Falcon</td><td>9/8/2866</td><td></td></tr><tr><td>Zombie tinte de viabilidad amarillo</td><td>Biolegend</td><td>423104</td><td></td></tr><tr><td>CD3 APC/Cy7, antihumano</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>25-0038-T100</td><td></td></tr><tr><td>CD4 PE, anti-humano</td><td>eBiosciences</td><td>12-0048-42</td><td></td></tr><tr><td>CD8a FITC, anti-humano</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0086-T100</td><td></td></tr><tr><td>Gallios Citómetro de flujo</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>B43618</td><td>10 color, VBR</td></tr><tr><td>MACSquant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td>8 colores, VBR</td></tr></tbody></table>

aislamiento de las células dendríticas del tracto reproductivo femenino humano estudios fenotípica y funcional

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

La caracterización de las humanos las células dendríticas (DCs) residentes en los tejidos de la mucosa es un reto debido a la dificultad en la obtención de muestras, y el bajo número de DCs presenta por tejido. Sin embargo, el fenotipo y la función de DCs es modificada por el ambiente del tejido, es necesario analizar poblaciones residentes de DC de tejidos, como sangre había derivada DCs incompleto reflejar las complejidades de la DCs en los tejidos. Aquí presentamos un protocolo para aislar DCs del humano aparato reproductor femenino (FRT) utilizando a especímenes de la histerectomia que permite el análisis fenotípicas y funcionales. El protocolo consiste en la digestión del tejido para generar una célula mixta de suspensión celular, seguido por la selección de grano magnético positivo. Nuestro protocolo de digestión de tejido no hienden marcadores de superficie, que permite el análisis fenotípico y funcional de DCs en el estado estacionario, sin activación de incubación o de la célula durante la noche. Este protocolo puede ser adaptado para el aislamiento de otros tipos de células inmunes o aislamiento de DCs de otros tejidos.

Siguientes digestión del tejido, la liberación de hojas epiteliales y las glándulas puede ser observada, como se muestra en la figura 1A; se trata de un control positivo que indica que la digestión enzimática fue exitosa. El número de células viables totales y DCs recuperados por gramo de tejido también se muestra en la figura 1B y figura 1, respectivamente. Las células inmunitarias representan entre...

Aquí describimos un método para aislar y purificar las células dendríticas de diferentes compartimentos anatómicos en el tracto reproductor femenino humano para la evaluación de sus características fenotípicas y funcionales. Este método puede adaptarse para aislar a otras células inmunes o las células dendríticas de otros tejidos de la mucosa.

Aislamiento de las células dendríticas del tracto reproductivo femenino humano estudios fenotípica y funcional

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar células dendríticas de diferentes compartimentos anatómicos en el tracto reproductivo femenino humano para evaluar sus características fenotípicas y funcionales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre las células dendríticas residentes en el tejido en el tracto genital femenino, como la compartimentación anatómica de subconjuntos específicos y sus características funcionales. La principal ventaja de esta técnica es que nuestro protocolo de digestión tisular no escinde los marcadores de superficie, lo que permite el aislamiento inmediato de las células dendríticas sin incubación ni activación celular durante la noche.Si bien este método se optimizó para aislar células dendríticas del tracto reproductivo femenino humano, también se puede adaptar para aislar otras células inmunitarias o células dendríticas de otros tejidos. Los encargados de demostrar el procedimiento estarán a cargo de Fiona Barr y Jared Fortier, técnicos de nuestro laboratorio. Comience este procedimiento enjuagando el tejido con HBSS modificado.Coloque el tejido en una placa de Petri de 100 por 15 milímetros cuadrados y agregue aproximadamente tres mililitros de un cóctel de enzimas de digestión para evitar que el tejido se seque. Mientras usa fórceps para estabilizar el tejido, píquelo con un bisturí para aumentar el área de superficie del tejido expuesto al cóctel de enzimas de digestión. Corta el pañuelo en trozos pequeños.Agregue suficiente cóctel de enzimas de digestión para cubrir todas las piezas de tejido y coloque la tapa en la placa de Petri. Incubar a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono en un rotor a aproximadamente 80 rpm durante 45 minutos. Asegúrese de que la velocidad del rotador mezcle completamente el cóctel de enzimas de digestión sin derramarse ni producir burbujas.Después de 45 minutos, visualice la preparación del tejido con un microscopio óptico invertido con los objetivos 4X y 10X. Una digestión enzimática exitosa debería liberar láminas epiteliales y glándulas, como se muestra en esta imagen representativa. Realizar la separación de células individuales en un entorno estéril.Primero, coloque una malla tensa de 250 micrómetros con soporte en una placa de Petri cuadrada de 150 por 15 milímetros y asegúrese de que la malla esté a unos 0,5 centímetros por encima de la superficie de la placa de Petri. A continuación, humedezca la malla con dos mililitros de HBSS modificado y transfiera el tejido digerido a la malla. Usando la superficie plana de un émbolo de jeringa de 10 mililitros, muela suave pero firmemente el tejido picado digerido a través de la malla.Una vez que los fragmentos de tejido se hayan dispersado completamente, eleve la malla y el soporte de dos a tres centímetros por encima de la placa de Petri y enjuague con tres mililitros de HBSS modificado para recuperar células adicionales. Transfiera la suspensión de la celda a un tubo cónico de 50 mililitros. Coloque una malla de 20 micrómetros con soporte a unos dos o tres centímetros por encima de una placa de Petri nueva y humedézcala con dos mililitros de HBSS modificado.Pase la suspensión de la celda a través de la malla y enjuague con seis mililitros de HBSS modificado. Recoja la suspensión de células mixtas y centrifugue a 500 veces g durante 10 minutos. Aspire el líquido y vuelva a suspender el pellet en cuatro mililitros de HBSS modificado.Coloque la suspensión de células mixtas sobre tres mililitros de solución de polisacarosa para la centrifugación en gradiente de densidad. Centrifugar a temperatura ambiente a 500 veces g durante 30 minutos sin freno. Recoja la banda blanca de la parte superior de la solución de polisacarosa y lávela con PBS.Una vez que se haya recolectado la suspensión de células mixtas enriquecidas, cuente las células usando un hemocitómetro en un microscopio óptico con el objetivo 10X. Gire todas las celdas de la suspensión celular durante 10 minutos. Aspire completamente y deseche el sobrenadante.Luego, agregue perlas de eliminación de células muertas e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de 15 minutos, coloque un filtro de 30 micrómetros en la parte superior de la columna para retener los restos de tejido o los agregados celulares restantes. Enjuague el filtro y la columna con tampón de eliminación de células muertas.Luego, aplique la suspensión celular y permita que las celdas marcadas con perlas fluyan a través de la columna magnética. Enjuague la columna con tres mililitros de tampón de eliminación de células muertas cuatro veces. Recoja el flujo continuo que contiene las células vivas.Después de la eliminación de las células muertas, gire las células hacia abajo. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de la célula en tampón de selección magnética, 80 microlitros de tampón por uno por 10 a las siete células. Para una selección positiva de las poblaciones de células dendríticas, agregue perlas magnéticas CD1a o CD14 e incube a cuatro grados Celsius durante 15 minutos.Lave las celdas con el tampón de selección magnética, centrifuga, retire el tampón por completo y vuelva a suspender las celdas en un mínimo de 500 microlitros de tampón de selección magnética. Fije la columna al imán y agregue un filtro de 30 micrómetros en la parte superior de la columna para retener cualquier resto de restos de tejido o agregados celulares. Enjuague el filtro y la columna con tampón de selección magnética.Aplique la suspensión de celda a la columna. Enjuague tres veces con tres mililitros de tampón de selección magnética. Transfiera la columna a un tubo de 15 mililitros.Agregue cinco mililitros de tampón de selección magnética y aplique el émbolo para liberar las celdas seleccionadas de la columna. Para aumentar la pureza, repita los pasos de purificación con las células recuperadas utilizando una nueva columna. Posteriormente, evaluar la pureza celular mediante citometría de flujo y microscopía, como se describe en el protocolo de texto.Antes de comenzar este ensayo, las células T vírgenes se aíslan de las células mononucleares de sangre periférica utilizando un kit disponible en el mercado. Lave las células T ingenuas dos veces con PBS. Resuspender las células en 500 microlitros de PBS.El resto del protocolo se realiza en la oscuridad. Mientras vórtice suavemente las células en el gabinete de bioseguridad, agregue 500 microlitros de una solución 2X de tinte de proliferación celular a las células. Incuba las células a 37 grados centígrados durante 10 minutos.Detenga el marcaje celular agregando a las células cinco mililitros de medio de cultivo celular con suero AB humano al 10%. Incubar en hielo durante cinco minutos, protegido de la luz. Centrifugar las células a unas 500 veces g durante siete minutos.Aspirar el medio y resuspender las células en cinco mililitros de medio de cultivo celular con un 10% de suero AB humano. Antes de la última centrifugación, tome una alícuota de células para contar. Después del tercer lavado, vuelva a suspender las células en un medio de cultivo celular con un 10% de suero AB humano a la concentración celular deseada.Para iniciar el cocultivo alogénico de células T vírgenes de células dendríticas, coloque las células dendríticas aisladas y las células T vírgenes en una placa de fondo redondo de 96 pocillos en una proporción de 1 a 15 células dendríticas y células T. Centrifugar la placa a unas 500 veces g durante tres minutos para asegurarse de que las celdas estén ubicadas en el centro del pocillo. Incubar a 37 grados centígrados durante seis días.Monitoree las células por microscopía. Después de seis días, evalúe la proliferación celular mediante citometría de flujo, como se describe en el protocolo de texto. Este gráfico muestra el rango del número total de células viables recuperadas después del procesamiento de tejidos y la eliminación de células muertas en cada compartimento del tracto reproductivo femenino, endometrio, endocérvix y ectocérvix.A continuación se muestra el número de células dendríticas viables recuperadas por gramo de tejido después del aislamiento magnético de las perlas. La morfología dendrítica de las células aisladas se determinó por microscopía siguiendo la tinción de Giemsa. La expresión de marcadores fenotípicos antes y después del aislamiento de las perlas se determinó mediante citometría de flujo.Después del aislamiento de las perlas CD1a positivas y CD14 positivas, la pureza osciló entre el 85 y el 92%. Se realizó un ensayo de estimulación alogénica para evaluar la funcionalidad de las células dendríticas. La formación de grupos de células T durante la proliferación se confirmó mediante tinción con colorante de proliferación. A continuación, se cuantificó la proliferación mediante citometría de flujo.Aquí se muestra la estrategia de compuerta para identificar diferentes células dendríticas en la suspensión de células mixtas. Cada población cerrada en parcelas multicolores se muestra en el siguiente panel. Siguiendo la estrategia de compuertas, se identifican subconjuntos específicos de células dendríticas.Se espera un número bajo de células, ya que las células dendríticas tisulares son poblaciones raras. Una vez dominado, el aislamiento de las células dendríticas de los tejidos se puede realizar en cuatro o cinco horas si se realiza correctamente. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo digerir y procesar enzimáticamente los tejidos para generar una sola suspensión de células mixtas y realizar una selección magnética de células dendríticas para una mayor caracterización.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Una preparación altamente purificada de células dendríticas del pulmón del ratón se describe. Especial énfasis se da al aislamiento de subgrupo de células dendríticas convencionales.

Aislamiento de células dendríticas del pulmón de ratón

Aquí, le detallamos una metodología para el aislamiento rápido de las células dendríticas de ratones intestinales (DCS) y los macrófagos. Caracterización fenotípica de los países en desarrollo y los macrófagos intestinales se realiza utilizando varios colores, mientras que el flujo de análisis de citometría de enriquecimiento de bolas magnéticas seguido por la selección de células se utiliza para producir poblaciones de alta pureza para los estudios funcionales.

Aislamiento y caracterización de las células dendríticas y los macrófagos del intestino delgado de ratón

Un modo eficaz de aislar los linfocitos de ratón tracto genital se describe. Este método tiene la ventaja de digestión enzimática y separación por gradiente de Percoll para permitir el aislamiento eficiente. Esta técnica es también adaptable a para su uso en otras...

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Este protocolo detalla un método para aislar células presentadoras de antígeno de timo humano a través de diferentes etapas de la digestión enzimática del tejido seguido por centrifugación de densidad de la suspensión de células individuales y la clasificación finalmente magnético y / o FACS de las poblaciones de células de interés.

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Existen distintos subconjuntos de células dendríticas como poblaciones raras en los órganos linfoides y, por lo tanto, son difíciles de aislar en número y pureza suficientes para los experimentos inmunológicos. Aquí describimos un método de alta eficiencia y alto rendimiento para el aislamiento de todos los principales subconjuntos actualmente conocidos de células dendríticas esplénicas de ratón.

Un método de rendimiento eficiente y de alta para el aislamiento de ratón subconjuntos de células dendríticas

Este estudio compara dos métodos diferentes de aislamiento de monocitos humanos para obtener células dendríticas (CD) in vitro. Los monocitos se seleccionan por adherencia o se enriquecen negativamente por separación magnética. Se comparará el rendimiento y la viabilidad de los monocitos junto con la viabilidad, la proliferación y la expresión de marcadores de superficie CD11c/CD14 entre ambos métodos.

Caracterización de las células dendríticas derivadas de monocitos humanos mediante imágenes de Citometría de Flujo: una comparación entre dos protocolos de aislamiento de monocitos

Describimos aquí un método de aislamiento para obtener linfocitos intraepiteliales endocervicales humanos para el análisis de células T gamma delta intraepiteliales. Este protocolo puede ampliarse para la purificación de las células T gamma delta endocervicales mediante perlas magnéticas o mediante clasificación de células.

Aislamiento y Análisis de citometría de flujo, de Human endocervical Gamma Delta T Cells

Derivados de monocitos DC (MoDC) puede detectar pequeñas cantidades de moléculas asociadas de peligro y por lo tanto son fácilmente preparada. Proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento de MoDC de sangre y los tumores y su activación con complejos inmunes mientras destacando medidas claves que deben considerarse para evitar su activación prematura.

Protocolo de aislamiento de células dendríticas derivadas de monocitos de ratón y su activación posterior In Vitro con complejos inmunes Tumor

Este protocolo muestra un método para el aislamiento de las células decidual humanas primarias recogidas de las membranas fetales de la placenta de término que puede ser utilizada para una variedad de aplicaciones (es decir, inmunocitoquímica, citometría de flujo, etc.) con el objetivo de para estudiar el papel de diferentes poblaciones celulares en complicaciones del embarazo.

Aislamiento de células Decidual humanas primarias de las membranas fetales de la placenta de término

Aquí, presentamos un protocolo para desarrollar y caracterizar células dendríticas tolerogénicas (TolDCs) y evaluar su utilidad de la inmunoterapia.

Desarrollo y caracterización funcional de células dendríticas tolerogénicas murino

Aquí, describimos las condiciones de cultivo in vitro , el aislamiento y el aumento de la generación de vesículas extracelulares (EV) de Echinococcus granulosus. Los pequeños vehículos eléctricos se caracterizaron mediante dispersión dinámica de la luz y microscopía electrónica de transmisión. La captación por las células dendríticas derivadas de la médula ósea y su modulación fenotípica se estudiaron mediante microscopía confocal y citometría de flujo.

Aislamiento y absorción de células dendríticas de pequeñas vesículas extracelulares de Echinococcus granulosus

Aprende a aislar células dendríticas del tracto reproductivo femenino humano para estudios fenotípicos y funcionales. Este método preserva marcadores de superficie y permite su aplicación en otras células inmunes.

Aislamiento de las células dendríticas del tracto reproductivo femenino humano estudios fenotípica y funcional

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