Microscopía de coherencia óptica de campo completo para el análisis histológico de características estromales en injertos corneales

Este método puede mejorar la detección y selección de tejidos de donantes de córnea en bancos de ojos, mejorar los resultados del trasplante de córnea. La principal ventaja de esta técnica es su capacidad de evaluación de alta resolución y que la córnea permanece inmersa en una cámara cerrada llena de medio de almacenamiento durante toda la adquisición de imágenes, disminuyendo cualquier riesgo potencial de contaminación. Demostrando el procedimiento estará Maelle Vilbert, graduada de doctorado de nuestro laboratorio.

Para comenzar, coloque la córnea sumergida en un medio de almacenamiento en el portamuestras con el epitelio hacia arriba. Coloque un cubreobjetos de sílice limpio provisto con el portamuestras en la parte superior de la córnea. Luego, cierre el soporte girando suavemente su base hasta que la muestra esté ligeramente aplanada e inmovilizada debajo del cubreobjetos, proporcionando una superficie de imagen relativamente uniforme.

Tome precauciones para evitar cualquier burbuja de aire. Aplique una capa gruesa de gel oftálmico u óptico en el cubreobjetos como medio de inmersión. Inicialice el dispositivo encendiendo el interruptor de encendido en la parte posterior del dispositivo.

La iluminación de un LED verde en la parte frontal del dispositivo indica que la alimentación está encendida. Asegúrese de que la etapa de imagen esté despejada, excepto la bandeja móvil. A continuación, haga clic en Aceptar en el software de adquisición para inicializar los motores cuando se le solicite.

Para configurar el dispositivo, introduzca un identificador de muestra en el campo designado y obligatorio. Y, opcionalmente, introduzca una descripción de muestra y una descripción del estudio. A continuación, haga clic en Adquirir imagen de macro para crear una instantánea de la muestra que luego se puede utilizar con fines de posicionamiento lateral y navegación.

Una vez satisfecho, valide la imagen en el símbolo del sistema haciendo clic en Sí. Después de lo cual, el dispositivo moverá la bandeja de muestras debajo del objetivo y realizará un ajuste automático. Asegúrese de que el objetivo del microscopio esté bien sumergido en el gel óptico antes de continuar.

Prepare la adquisición yendo a la pestaña Explorar. Antes de adquirir una pila de imágenes, navegue hasta el centro de la córnea a través del joystick o la selección manual en la pantalla. Varíe la profundidad de imagen mediante la rotación del joystick, el ajuste del control deslizante o la entrada manual del teclado en la interfaz gráfica de usuario.

Luego ajuste el valor promedio a 40 para obtener imágenes corneales óptimas. Introduzca el valor de la superficie corneal o la primera ubicación de la imagen en el campo de profundidad. A continuación, seleccione la pestaña Adquirir para adquirir imágenes.

Seleccione y establezca el espaciado del sector que coincida con la resolución axial del dispositivo. Introduzca el valor del grosor corneal en Número de cortes. Revisar parámetros y tiempo de adquisición.

Y cuando esté satisfecho, presione OK para lanzar la adquisición. Durante la adquisición, evite el contacto con la mesa sobre la que se coloca el microscopio. Para evaluar el grosor del estroma y de la capa de Bowman, mida las distancias de las secciones transversales de la córnea.

Por ejemplo, agregue cinco puntos igualmente espaciados a través de la sección transversal como se describe en el manuscrito de texto. Dibuje una línea entre dos puntos de distancia conocida de acuerdo con el campo de visión predeterminado. Luego vaya a la pestaña Analizar y seleccione Establecer escala.

Introduzca la distancia conocida y la unidad de longitud en los campos correspondientes. Establezca en 1024 píxeles o 780 micrómetros y haga clic en Aceptar. Dibuje una línea entre dos puntos de distancia desconocida y lea la longitud o distancia medida directamente desde la barra de estado. Registre la media y el coeficiente de variación.

Haga clic en la pestaña Imagen y seleccione Reslice Z en Pilas para determinar la densidad de queratinocitos. Esto sumará las imágenes de cara estromal en grupos de siete para producir cortes de espesor comparable. Para un análisis más detallado, incluya todas las cortes faciales disponibles para el estroma anterior más antiguo, 15 imágenes para el estroma anterior, cinco imágenes para el estroma medio y cinco imágenes para el estroma posterior.

En cada imagen encubierta, seleccione una región de interés de 300 por 300 micrómetros. Para mejorar la visualización del núcleo, invierta la imagen usando Invertir en la pestaña Editar. Ajuste el contraste y el brillo haciendo clic en la pestaña Imagen y navegando a Brillo-Contraste.

Para contar manualmente los núcleos celulares, vaya a Plugins y navegue hasta Cell Counter en la pestaña Analyze. Presione Inicializar y, a continuación, seleccione un tipo de contador. Luego cuente los núcleos celulares haciendo clic en las características ovaladas oscuras en la imagen invertida, considerando las que aterrizan en un borde de imagen solo para dos de los cuatro lados de la imagen.

La córnea del donante humano seleccionado se hinchó después del almacenamiento en medio de cultivo de órganos, dando un modelo fisiopatológico de la córnea edematosa e impidiendo la adquisición de imágenes a través de todo el espesor corneal debido a la profundidad de penetración limitada. La transferencia a medio de cultivo de órganos suplementado con dextrina, redujo la hinchazón y dio lugar a córneas de donantes de grosor normal. Las córneas enfermas fueron reconocidas por cambios morfológicos y características estromales típicas, incluida una disminución en el grosor estromal variable o capa de Bowman.

La evaluación de la densidad de queratinocitos y la reflectividad estromal ayudó aún más en el análisis histológico y la diferenciación de tejidos corneales normales de patológicos con microscopía de coherencia óptica de campo completo, que está más allá de las capacidades de los sistemas de tomografía de coherencia óptica clínica. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar un análisis histológico cualitativo y cuantitativo del estroma corneal que permita la diferenciación de la enfermedad de los tejidos corneales humanos normales.