Disección señalización complejos por purificación de la afinidad de complementación Bimolecular (BiCAP)

Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en biología celular y bioquímica, como cómo el ensamblaje dinámico de proteínas y complejos de proteínas controla las vías de señalización y el comportamiento celular. La principal ventaja de esta técnica es que podemos aislar específicamente dos proteínas que interactúan, mientras que excluimos las proteínas individuales no complejadas y los socios de unión que compiten entre sí. Aunque utilizamos este método para proporcionar información sobre la dimerización receptiva de la tirosina quinasa en el cáncer de mama, también se puede aplicar a cualquier otro entorno fisiológico o enfermedad.

La primera vez que tuvimos una idea para este método fue cuando nos dimos cuenta de que el nanocuerpo de GFP reconocía el epítopo tridimensional de GFP y otras proteínas fluorescentes. Para empezar, agregue 150 nanogramos de vector de entrada, 150 nanogramos de vector de destino y ocho microlitros de tampón TE a un tubo de 0,2 mililitros. A continuación, agregue dos microlitros de recombinasa y ZiMex, y centrifugue los dos brevemente.

Incubar la reacción durante una hora a temperatura ambiente, luego agregar un microlitro de solución de proteinasa K e incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos para detener la reacción. A continuación, descongele las células competentes para el choque térmico en hielo. Y transfiera 50 microlitros de las células a un tubo de polipropileno de fondo redondo de 14 mililitros.

Agregue un microlitro de producto de reacción a las células y mezcle suavemente. Incubar las células durante 20 minutos en hielo. A continuación, someta las células a un baño de agua a 42 grados centígrados durante 45 segundos antes de devolverlas al hielo.

Agregue un mililitro de medio LB a las celdas. E incubar la muestra agitando durante una hora a 37 grados centígrados. Luego, coloque la transformación en una placa de agar de 10 centímetros con ampicilina e incube a 37 grados centígrados durante la noche.

Para comenzar la purificación del plásmido, agregue ampicilina y 100 mililitros de medio LB a un matraz cónico grande. A continuación, utilice un asa de inoculación para eliminar una sola colonia de la placa de agar. Sumerja el circuito de inoculación en medio LB y mezcle brevemente, luego cubra la parte superior del matraz con papel de aluminio e incube durante la noche, a 37 grados centígrados agitando.

A partir de aquí, purifique el ADN plasmídico utilizando un kit de purificación de ADN plásmido Maxiprep estándar, antes de proceder con la transfección. Primero, siembre las células HEK 293T en platos de 10 centímetros, que contienen 10 mililitros de DMEM. A continuación, diluir 2,5 microgramos de cada vector de complementación de fluorescencia bimolecular en 500 microlitros de tampón de transfección.

Agregue 10 microlitros del reactivo de transfección y agite la mezcla durante 10 segundos. A continuación, centrifugar brevemente las muestras e incubarlas a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, agregue la mezcla de transfección de ADN gota a gota al plato.

A continuación, incubar las muestras durante ocho a 24 horas. Prepare un tampón de lisis celular y un tampón de lisis celular complementado como se describe en el protocolo de texto. A continuación, lave las células con PBS helado dos veces.

Aspire el PBS y agregue un milímetro de tampón de lisis celular suplementado con hielo y hielo. A continuación, coloque el plato en hielo e incube durante cinco minutos. A continuación, utilice un raspador de células para extraer las células y transfiéralas a un tubo de microcentrífuga refrigerado.

Centrifugar el tubo a 18.000 veces la gravedad durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, para eliminar los restos celulares, luego transfiera el sobrenadante transparente a un tubo de microcentrífuga nuevo. Lave un volumen apropiado de perlas de agarosa en un mililitro de PBS, luego centrifugue las perlas a 300 veces la gravedad y retire con cuidado el sobrenadante. A continuación, añada 20 microlitros de perlas de agarosa a cada muestra.

E incubar a cuatro grados centígrados durante dos horas, con rotación de extremo a extremo. Centrifugar las perlas a 300 veces la gravedad y lavarlas en tampón de lisis celular tres veces. A continuación, vuelva a suspender las perlas lavadas en 50 microlitros de tampón de muestra diluido.

Finalmente, caliente las muestras a 95 grados centígrados durante dos o tres minutos. En este estudio, se utiliza el método BiCAP para observar una interacción positiva para varios tipos de proteínas aproximadamente 16 horas después de la co-transfección de HEK293T células. La microscopía confocal se utiliza para observar la dimerización de la RTKERBB2 en la membrana plasmática y la unión de la ubiquitina a la ligasa E3 UBR5.

Después de la purificación por afinidad con el nanocuerpo GFB, solo se puede detectar en la muestra de co-transfección la proteína de control Venus de longitud completa y las proteínas marcadas V1 y V2 que interactúan. Al intentar este procedimiento, recuerde optimizar la ubicación de la etiqueta de complementación de fluorescencia bimolecular y el extremo C-terminal o N-terminal de su proteína de interés. Esto es necesario para observar una interacción positiva proteína/proteína.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la técnica BiCAP y cómo aplicarla a la interacción de proteínas de su interés. Siguiendo este procedimiento, se podrían emplear muchas de las técnicas de caracterización posteriores, como ChIPseek para responder a preguntas adicionales, como cómo la dimerización de los factores de transcripción controla la unión al ADN.