Name: Aislamiento y cultivo de Microglia roedor para promover una dinámica ramifican morfología en medio libre de suero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Aprenda a aislar y cultivar microglía de roedores en medio libre de suero para estudiar su morfología ramificada y dinámica. Este método permite investigar interacciones celulares en neurociencia.

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Este trabajo fue apoyado por la Christopher y Dana Reeve Foundation internacional Consorcio de investigación en lesión de la médula espinal, el Dr. Miriam y Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation, la Fundación de JPB, el Instituto Novartis de investigación básica, generosas contribuciones de Vicente y Stella Coates y Damon Runyon Cancer Research Foundation (DRG-2125-12).

Todos los procedimientos que involucran a roedores conforman a las directrices de la Universidad de Stanford, que cumplan con las políticas y las leyes estatales y nacionales. Todos los procedimientos animales fueron aprobados por el Comité Administrativo de la Universidad de Stanford sobre cuidado de animales de laboratorio.
Nota: Todas las composiciones solución y buffer son proporcionadas en la Tabla de materiales.
1. prepare una placa de Petri Immunopanning de CD11b (día 0)
Nota: Preparar 1 immunopanning plato de cada cerebro de rata juvenil 1-2.
<ol><li>Añadir 25 mL de 50 mM solución de Tris pH 9.5 a un plato de Petri de 15 cm.</li>
	<li>Añadir cabra anti-ratón IgG (cadenas H + L) en el plato para una concentración final de 6 μg/mL. Remolino de placa para distribuir uniformemente.</li>
	<li>Incubar el plato para 1-3 h a 37 ° C.</li>
	<li>Platos de enjuague tres veces con DPBS++ (tampón fosfato salino (PBS) con Ca2 + y Mg2 +), reemplácelo con una solución de lavado tampón que contiene 1 μg/mL de anticuerpos OX42. Deje los platos durante la noche a temperatura ambiente sobre una superficie plana.</li>
</ol>2. tejido colección (día 1)
Nota: Este protocolo debe tomar ~ 3-4 h.
<ol><li>Antes de empezar, asegúrese de que todas las soluciones son estériles y refrigeradas con hielo. Enfriar todos los instrumentos en el hielo y esterilizar con etanol antes de usarlo.</li>
	<li>Siguientes procedimientos regulatorios apropiados, sacrificar a una rata de laboratorio juvenil por asfixia dióxido de carbono. Nota: Como alternativa, animales más jóvenes que sean sacrificados con una dosis letal de ketamina/xilacina (100-200 μL de 24 mg/mL ketamina, xilacina 2.4 mg/mL). Ketamina/xilacina debe usarse si los animales son menos de 14 días de edad. Si utiliza múltiples animales, extraer el tejido de un animal y lo coloca en DPBS previamente enfriada++ en hielo antes de proceder a los siguientes animales.</li>
	<li>Pellizque un hindpaw y asegurar la insensibilidad completa del animal antes de proceder.</li>
	<li>Transcardially perfusión el animal con 10-30 mL de tampón de la helada de la perfusión mediante una aguja de 27½-G hasta que el búfer funcione claro. Nota: Volumen de perfusión tampón variará dependiendo del tamaño, edad del animal.</li>
	<li>Inmediatamente después de la perfusión, quitar la cabeza del animal. Provenientes de la médula espinal cortada el cóndilo occipital a cada lado con tijeras de disección, tenga cuidado de no dañar el cerebro. Después de cortar cada lado con cuidado, corte para arriba de un lado a lo largo de los parietales y el hueso frontal hacia el hueso nasal. Con pinzas cuidadosamente tire hacia atrás la parte superior del cráneo, rápidamente Retire el cerebro (o estructuras de CNS de interés) y coloque en DPBS previamente enfriada++ en hielo.</li>
	<li>Repita para todos los animales restantes. Nota: Todos los pasos de procedimiento deben realizarse en una campana de flujo laminar en condiciones estériles adecuadas.</li>
</ol>3. mecánica disociación (día 1)
<ol><li>Después de todos los cerebros han sido recogidos, picar un cerebro en trozos de3 1 mm en una placa Petri sobre el hielo con una hoja de bisturí frío y transferir a un homogeneizador dounce helada con 5-7 mL de tampón de douncing helada. Disociar un cerebro en un momento.</li>
	<li>Disociar el tejido con 10-20 movimientos suave e incompletas con un homogeneizador de dounce sueltas. Tenga cuidado de no aplastar directamente el tejido en la parte inferior de la homogeneizadora, pero en su lugar impulsar el tejido a través del espacio entre los lados del pistón y el homogenizador.</li>
	<li>Retire con cuidado el pistón para evitar la introducción de burbujas de aire. Permite trozos de tejido mal disociada a instalarse en la parte inferior de la homogeneizadora y transferir el sobrenadante a un tubo cónico de 50 mL refrigerado nuevo.</li>
	<li>Reemplazar el volumen quitado con tampón de douncing fresca y repita los pasos 3.2 y 3.3 para un total de 3-4 rondas o hasta que todo el tejido ha sido disociado. Repita el procedimiento para cada cerebro.</li>
</ol>4. mielina retiro (día 1)
Nota: Eliminación de la mielina se utiliza para el aislamiento de la microglía de animales mayores de P12.
<ol><li>Medir el volumen de la suspensión de células en el tubo cónico de 50 mL con una pipeta de 25 mL, luego agregar helado douncing tampón para ajustar el volumen total en mL 33,5.</li>
	<li>Añadir 10 mL de tampón de separación de mielina (MSB) a la suspensión de células y mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces. Esto resultará en una concentración final del 23% de MSB en un volumen de 43,5 mL.</li>
	<li>Centrifugar las células durante 15 min a 500 x g a 4 ° C con el frenado lento. Nota: La centrífuga debe tomar aproximadamente 1.5-2 min a desacelerarse. Esto generará una capa superior de mielina y restos de células muertas, un sobrenadante algo turbio y un pellet más pequeños que se enriquece para células vivas.</li>
	<li>Quitar la capa superior de la ruina del myelin y el sobrenadante con una pipeta. Tenga cuidado al retirar la capa superior para asegurar que gran parte se elimina como sea posible.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células en 12 mL de tampón de lavado. Triturate suavemente la suspensión de celular romper cualquier grumos de células que puedan quedar.</li>
</ol>5. Immunopanning (día 1)
<ol><li>Pasar la suspensión celular a través de un colador de celular de 70 μm para eliminar basura grande o grupos de células.</li>
	<li>Enjuagar el plato barrido tres veces con DPBS++OX42 cubierto. No permita que la placa se seque completamente entre lavados.</li>
	<li>Retirar el último lavado DPBS++ y aplique la suspensión filtrada al plato barrido. Suavemente la placa para distribuir las células del remolino, luego Incube la placa en una superficie plana, a temperatura ambiente durante 20 minutos permitir que las células se adhieran. No incubar más de 20 min o células será muy difíciles recuperarse del plato.</li>
	<li>Enjuagar el plato barrido con DPBS++ 10 veces para eliminar las células no adherentes. Microglia será tan firmemente conectada a la placa, agitar la placa con cada enjuague para asegurar el retiro de otras células no adherentes.</li>
	<li>Retirar el último lavado DPBS++ y reemplace con DPBS++ de 15 mL y 200 μL tripsina (solución stock de 1.25%).</li>
	<li>Incubar el plato ≤10 min a 37 ° C con 10% CO2 para trypsinize. Nota: No continúe más de 10 min o microglia será difícil de quitar.</li>
	<li>Después de 10 min de la tripsinización, microglia todavía se ser pegado a la placa. Vierta de tripsina/DPBS++ y lave suavemente 2 x con DPBS++ eliminar tripsina, reemplazar con 12 mL de medio de crecimiento de microglia helada (MGM).</li>
	<li>Lavado plato en hielo durante 2 minutos para ayudar a debilitar la interacción celular/substrato y asegúrese de que el plato es plana para evitar que áreas del plato barrido de la desecación.</li>
	<li>Pipetear enérgicamente con un controlador de pipeta y pipeta 10 mL de alta velocidad para recuperar las células de la fuente de barrido. Dibujar una cuadrícula de 16 x 16 con la corriente de líquido de la pipeta para tratar de eliminar todas las células.</li>
	<li>Compruebe las células bajo un microscopio de 20 aumentos para asegurarse de que las células han separado de la placa. Marcar puntos sobre el plato donde las células se pegan todavía y repita el pipeteo en esas áreas.</li>
	<li>Recoger la suspensión celular y alícuota 3-4 mL del sobrenadante por el tubo cónico de 15 mL. Vuelta por 15 min a 500 x g a 4 ° C con el frenado lento. Nota: Microglia a través de un pequeño volumen de giro permite la recuperación máxima de las células.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante, dejando 0,5 mL de MGM con el precipitado de células.</li>
	<li>Resuspender cada precipitado en MGM restante y las células de los tubos de la piscina.</li>
	<li>Contar celdas con hemocitómetro.</li>
	<li>Células de la placa como se describe en los pasos 6 - 7 dependiendo de la aplicación.</li>
	<li>Células en cultivo a 37 ° C con 10% CO2. Nota: Las células pueden ser cultura para hasta 3-4 semanas con cambios regulares de los medios de comunicación o una semana sin cambios de los medios de comunicación.</li>
</ol>6. punto capa las placas de cultivo de tejidos/cubreobjetos (día 1)
<ol><li>Placa de 15 μl de la capa de colágeno IV en el centro de una placa de cultivo de tejidos recubiertos 24-pozo aniónico/catiónico (para detalles, véase Tabla de materiales ) e incubar por 15 min a 37 ° C con 10% CO2.</li>
	<li>Después de contar las células con hemocitómetro diluir las células a 2.3 x 105/ml en MGM. Aspirar en lugar de colágeno IV y placa 15 μl de la suspensión celular a este lugar; Esto le dará 3.5 x 103 células/punto. Incubar durante 5-10 min a 37 ° C con 10% CO2 para permitir que las células se adhieren, Añadir 500 μl de CO2 -equilibrado que contiene medio de crecimiento TGF-β2 y IL-34/colesterol (TIC) suavemente hacia el pozo.</li>
	<li>Si la galjanoplastia en cubreobjetos, primera capa cubreobjetos de vidrio estéril con 10 μg/mL estratagema-D-lisina (PDL) en H2O por 1 h a temperatura ambiente, lavar 3 veces con H2O y dejar secar en una campana bajo luz UV. Una vez seco cubreobjetos, proceder con la galjanoplastia del punto sobre el cubreobjetos como se describe en el paso 6.2.</li>
</ol>7. recubrimiento para el aislamiento de RNA/proteína
<ol><li>El día 1, capa toda la zona de un 24-pozo aniónico/catiónico revestido en placa de cultivo de tejidos con la capa de colágeno IV e incubar por 10 min - 1 h a 37 ° C con 10% CO2, luego retire e inmediatamente la placa 3-5 x 104 células/pozo en CO2 equilibrado Medios de comunicación TIC.</li>
	<li>En el día 2, realizar un cambio de media de 50% para cada uno bien el día después de la preparación. Las células muertas tienden a cluster en el centro del pozo, así que los medios de comunicación a partir de ahí.</li>
	<li>Realizar un cambio de media de 50% cada 2-3 días para mantener los cultivos. Si los cambios de los medios de comunicación introducen una variable no deseada de las culturas, las células pueden sobrevivir aproximadamente una semana sin ningún cambio de los medios de comunicación, frente a más de 3 semanas con mantenimiento regular.</li>
</ol>

<ol><li>Colonna, M., Butovsky, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Function+in+the+Central+Nervous+System+During+Health+and+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration.</a> Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).</li>
<li>Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+Dynamic+Mediators+of+Synapse+Development+and+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity.</a> Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).</li>
<li>Lou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purinergic+receptor+P2RY12-dependent+microglial+closure+of+the+injured+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).</li>
<li>Haynes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P2Y12+receptor+regulates+microglial+activation+by+extracellular+nucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).</li>
<li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li>
<li>Lavin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophage+enhancer+landscapes+are+shaped+by+the+local+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment.</a> Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).</li>
<li>Hoeffel, G., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+Tissue-Resident+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of Tissue-Resident Macrophages.</a> Front Immunol. 6, 486(2015).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li>
<li>Bohlen, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival%2C+Specification%2C+and+Function+Revealed+by+Defined-Medium+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li>
<li>Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+Cells+in+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Myeloid Cells in the Central Nervous System.</a> Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).</li>
</ol>

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pueda interpretarse como un potencial conflicto de interés.

Porque microglia sirva de centinela de las células inmunes de la CNS, son altamente sensibles a los cambios ambientales; por lo tanto, se requiere gran cuidado para reducir al mínimo las respuestas inflamatorias dentro de las células durante el aislamiento y cultura8. Esto se logra en este protocolo a través de la velocidad y la temperatura. Mantener las células en hielo o a 4 º C siempre que sea posible reduce la activación, por lo que realizará todos los pasos de centrifugación a 4 ° C, los anim...

Como los macrófagos de la parenquimia del CNS, microglia interactuar con una amplia gama de circuitos neuronales y gliales redes de señalización. Desempeñan funciones vitales en el desarrollo y homeostasis del cerebro a través de la poda sináptica, separación de células apoptotic y transitorias interacciones con procesos neuronales1,2. Microglia son primeros respondedores a lesiones neurológicas, ampliando sus procesos de largas y delgadas a los sitios de lesión para coordinar las respuestas inflamatorias y limitar el sangrado3,4. Cambios en la morfología de microglial y función son ubicuos en lesiones CNS agudas y crónicas, y microglia exposición altera morfología, localización y expresión de mediadores inflamatorios en una amplia gama de Estados de enfermedad1. Estudios genéticos en humanos indican que las mutaciones que alteran el riesgo de enfermedades neurodegenerativas son a menudo predominantemente o exclusivamente expresadas por microglia del sistema nervioso intacto, apuntando hacia un papel crítico para la microglia en la patogénesis de la enfermedad o progresión de la5 . Dada su prominencia en accidentes y enfermedades, favorecer la comprensión de la biología de microglial es una alta prioridad para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos.
Han surgido muchos avances fundamentales para la comprensión de la biología de microglial extrapolando mecanismos descubiertos en estudios de otras poblaciones de macrófagos incluyendo métodos de cultivo, perfiles de expresión génica y definiciones funcionales y técnicas / morfológicas Estados. Aunque generalizado macrófago funciones a menudo juegan de manera sorprendente dentro del panorama de la CNS, microglía son altamente especializados, exhiben una morfología ramificada y una firma de expresión de gen único que les diferencia de otros tejidos los macrófagos6. Microglia tienen un linaje que es distinto de la mayoría de los otros macrófagos; colonizar el SNC durante una temprana ola embrionaria de hematopoyesis primitiva y uno mismo-renovar toda la vida, independiente de las contribuciones de hematopoyesis definitiva7. La firma de expresión de gen completamente maduros de microglia adultos no se logra hasta la segunda semana postnatal8. Señales ambientales del tejido circundante juegan un papel importante en el dictado de macrófagos de tejido-específica características6, que en el SNC incluye exposición limitada a factores transmitidos por la sangre por la barrera hemato - encefálica9.
Un obstáculo para comprender plenamente microglial contribuciones a CNS homeostasis y enfermedad es la dificultad de recapitular las propiedades especializadas de microglia madura visto en vivo con células purificadas en vitro. Muchos métodos han sido desarrollados para aislar y microglia intacta de la cultura, pero la mayoría de enfoques dependen de suero para apoyar la supervivencia de la célula. Hemos demostrado que además del suero, que es un reactivo inherentemente variable que contiene una gran variedad de moléculas bioactivas, es particularmente problemático cuando trabajo con microglia ya que promueve una morfología ameboides, incrementa la proliferación, y aumento de fagocitosis9 a menudo visto en vivo cuando microglía están expuestos a factores de sangre después de la interrupción de la barrera blood - brain. De estas métricas, expuestas al suero de las células se asemejan a microglia en lesiones o enfermedades, pero tales alteraciones se reducen cuando microglia se cultivan en el medio de crecimiento definido con CSF-1 (o IL-34), TGF-β, colesterol y selenita.
Este protocolo proporciona información detallada para el cultivo de rata juvenil microglia en condiciones libres de suero, relacionados con la obra recientemente publicada9. Este protocolo se ha racionalizado para las ratas de día postnatal 21-30 (P21 - P30), pero puede ser adaptado para aislar microglia de ratas y ratones de cualquier edad, aunque el rendimiento y la viabilidad general varían dependiendo de la especie y edad del animal. Máximo rendimiento y viabilidad óptima se logra cuando se usa ligeramente inmaduro microglia (~ P9), con rendimientos y viabilidad estrechándose gradualmente a algo de niveles más bajos en animales adultos. Microglía también puede ser aislado de ratones, pero hemos encontrado que las células de rata muestran significativamente mayor rendimientos, viabilidad y la complejidad de la morfología ramificada, en comparación con las células de ratón en cultivos libres de suero. Animales de edad superior a P50 no han sido evaluadas con este protocolo. Este procedimiento de aislamiento de immunopanning ha sido optimizado para reducir al mínimo cambios en perfiles transcripcionales microgliales durante el aislamiento y para maximizar la viabilidad posterior de las células. Usando estas técnicas y formulaciones de los medios de comunicación, cultivos primarios de alta viabilidad pueden mantenerse por semanas. Microglia cultivada bajo estas condiciones presentan una morfología muy ramificada con rápida extensión y retracción de los procesos y relativamente bajas tasas de proliferación. Resaltar la importancia de suero-exposición de estas características y discutir las fortalezas y debilidad de este método en comparación con otros enfoques.

<table><tbody><tr><td>Rata: Sprague-Dawley</td><td>Charles River</td><td>Cat# 400</td><td></td></tr><tr><td>ratón anti-rata CD11b monoclonal (clon OX42)</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat# MCA275R</td><td>Paneo: 1:1,000; Tinción: 1:500</td></tr><tr><td>Cabra policolonia anti-Iba1</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB5076</td><td>Tinción: 1:500</td></tr><tr><td>Conejo policlonal anti-Ki67</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB15580</td><td>Tinción: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Burro anti-ratón 594</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 11055</td><td>Tinción: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-cabra 488</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-21203</td><td>Tinción: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-31573</td><td>Tinción: 1:500</td></tr><tr><td>Triton-X (detergente en tinción ICC)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 28313</td><td></td></tr><tr><td>Heparán sulfato</td><td>Galen Suministros de laboratorio</td><td>Cat# GAG-HS01</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Cat# M3149</td><td></td></tr><tr><td>Peptona de sólidos lácteos</td><td>Sigma</td><td>Cat# P6838</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; 2</td><td>Peprotech</td><td>Cat# 100-35B</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL-34</td><td>R& D Systems</td><td>Cat# 5195-ML/CF</td><td></td></tr><tr><td>Lana ovina colesterol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>Cat# 700000P</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno IV</td><td>Corning&nbsp;</td><td>Cat# 354233</td><td></td></tr><tr><td>Ácido oleico</td><td>Cayman Chemicals&nbsp;</td><td>Cat# 90260</td><td></td></tr><tr><td>11(Z)Ácido eicosadienoico (gondoico) Productos</td><td>químicos de las Islas Caimán&nbsp;</td><td>Cat# 20606</td><td></td></tr><tr><td>Calceína AM colorante</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium homodimer-1</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# E1169</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Worthington Cat</td><td># DPRFS</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>Cat# 17-5445-02</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>Cat# T9935</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>Cat# 21041-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/ Estreptomicina</td><td>Gibco Cat</td><td># 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Gibco</td><td>Cat# 25030-081</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteína&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# A9165</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>Cat# 16634</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# T1147</td><td></td></tr><tr><td>Selenito de sodio</td><td>Sigma</td><td>Cat# S-5261</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (alta glucosa)</td><td>Gibco</td><td>Cat# 11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>Cat# 0100-20&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lisina &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Placas Primarias&nbsp;</td><td>VWR</td><td>Cat# 62406-456</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Reactivos bursátiles&nbsp; </fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrina</td><td></td><td></td><td>Reconstitución: 10 mg/mL en PBS Concentración utilizada: 1:100 Almacenamiento: -20&deg; C</td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td></td><td></td><td>Reconstitución: 5 mg/mL en H2O Concentración utilizada: 1:1.000 Almacenamiento: -20&deg; C</td></tr><tr><td>Selenito</td><td></td><td></td> de sodio <td>Reconstitución: 2.5 mg/mL en H2O Concentración utilizada: 1:25,000 Almacenamiento: -20&deg; C</td></tr><tr><td>Colágeno IV</td><td></td><td></td><td>Reconstitución: 200 &mu; g/mL en PBS Concentración utilizada: 1:100 Almacenamiento: -80&deg; C</td></tr><tr><td>TGF-b2</td><td></td><td></td><td>Reconstitución: 2 mg/mL en PBS Concentración utilizada: 1:1,000 Almacenamiento: -20&deg; C</td></tr><tr><td>IL-34</td><td></td><td></td><td>Reconstitución: 200 &mu; g/mL en PBS Concentración utilizada: 1:1,000 Almacenamiento: -80&deg; C</td></tr><tr>Colesterol <td></td><td></td> de<td>lana ovina</td><td>Reconstitución: 1,5 mg/mL en etanol al 100% Concentración utilizada: 1:1.000 Almacenamiento: -20&deg; C</td></tr><tr><td>Sulfato</td><td></td><td></td> de heparán <td>Reconstitución: 1 mg/mL en H2O Concentración utilizada: 1:1.000 Almacenamiento: -20&deg; C</td></tr><tr><td>Ácido oleico/Ácido</td><td></td><td></td> gondoico <td>Reconstitución: Gondoico: 0,001 mg/mL; Oleico: 0,1 mg/mL en etanol al 100% Concentración utilizada: 1:1.000 Almacenamiento: -20&deg; C</td></tr><tr><td>Reconstitución de heparina</td><td></td><td></td><td>: 50 mg/mL en PBS Concentración utilizada: 1:100 Almacenamiento: -20&deg; C</td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Solutions&nbsp; Receta de tampón</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> > <td>perfusión</td> </fuerte<td>: 50 &mu; g/mL de heparina en DPBS++ (PBS con Ca++ y Mg++) Observaciones: Úselo cuando esté helado</td></tr><tr>Receta<td>de tampón</td><td></td><td></td> Douncing<td>: 200 &mu; L de 0,4% de DNasaI en 50 mL de DPBS++ Observaciones: Úselo cuando esté helado</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de paneo <td>Receta: 2 mg/mL de peptona de sólidos lácteos en DPBS++Medio de</td></tr> crecimiento de <tr><td>microglía (MGM)</td><td></td><td></td><td>Receta: DMEM/F12 que contiene 100 unidades/mL de penicilina, 100 &mu; g/mL de estreptomicina, 2 mM de glutamina, 5 &mu; g/mL de N-acetilcisteína, 5 y mu; g/mL de insulina, 100 &mu; g/mL de apo-transferrina y 100 ng/mL de selenito de sodio Observaciones: Use MGM helado para desbancar la microglía de la placa de inmnopanning.</td></tr><tr><td>Receta de recubrimiento</td><td></td><td></td> de colágeno IV<td>: MGM que contiene 2 &mu; g/mL de colágeno IV</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> de separación de mielina <td>Receta: 9 mL de Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS sin Ca++ y Mg++, 9 &mu; L 1 M CaCl2, 5 &mu; L 1 M MgCl2 Observaciones: Mezclar bien después de la adición de&nbsp; CaCl2 y MgCl2</td></tr><tr><td>TGF-b2 / IL-34 / Medios de crecimiento que contienen colesterol (TIC)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Receta: MGM que contiene 2 ng/mL de TGF-b2 humano, 100 ng/mL de IL-34 murino, 1,5 &mu; g/mL de colesterol de lana ovina, 10 &mu; g/mL de heparán sulfato, 0,1 &mu; g/ml de ácido oleico, y 0,001 &mu; g/ml de ácido gondoico Observaciones: Asegúrese de agregar colesterol a los medios calentados a 37 & grados; C y no agregue más de 1.5 &mu; g/mL o se precipitará. No filtre los medios que contengan colesterol. Equilibre los medios TIC con 10% de CO2 durante 30 minutos a 1 hora antes de agregarlos a las celdas para asegurar un pH óptimo.</td></tr></tbody></table>

aislamiento y cultivo de microglia roedor para promover una dinámica ramifican morfología en medio libre de suero

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Microglía representan el 5-10% de todas las células del sistema nervioso central (SNC) y son cada vez más llamar la atención debido a sus contribuciones durante el desarrollo, homeostasis y enfermedad. Aunque los macrófagos han sido estudiados en detalle por décadas, características especializadas de la microglía, los macrófagos residentes de tejido del SNC, se han mantenido en gran parte misteriosa, en parte debido a las limitaciones en la capacidad para recapitular microglial maduro propiedades en la cultura. Aquí ilustramos un sencillo procedimiento para el aislamiento rápido de puro microglia del cerebro de roedores maduros. También describimos las condiciones de cultivo libre de suero que soportan altos niveles de microglial viabilidad con el tiempo. Microglia cultivada bajo estas condiciones del medio definen exhiben elaborados procesos ramificados y comportamiento dinámico de la vigilancia. Ilustramos algunos efectos de la exposición del suero en microglia cultivada y discutir cómo estas culturas sin suero comparan culturas expuestas al suero, así como microglia en vivo.

Este protocolo describe un método de cultura alta pureza ramificado microglia de ratas juveniles. Resultados similares pueden obtenerse utilizando animales inmaduros, perinatales y adultos, como se explica a continuación. Desde aislamientos celulares suelen incluyen matices sutiles y muchas oportunidades para que las células mueren, usamos puntos de control de calidad para ayudar a determinar el éxito en varios pasos. Normalmente supervisamos suspensiones celulares usando un hemocitómetro...

Esfuerzos para comprender la función microglial en detalle han impedido por la falta de modelos de cultura microglial que recapitular las propiedades de microglia maduros en vivo . Este protocolo describe un acercamiento aislamiento y cultura diseñado para mantener la supervivencia robusta de microglia altamente ramificados de rata maduro medio definido en condiciones.

Aislamiento y cultivo de Microglia roedor para promover una dinámica ramifican morfología en medio libre de suero

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

El objetivo general de este protocolo de cultivo celular es generar cultivos de microglía de alta pureza a partir de roedores adultos o en desarrollo que puedan mantenerse sin exposición al suero. Este procedimiento puede ayudar a responder preguntas clave en neurociencia relacionadas con la morfología de la microglía, la cetosis fibrosa y la interacción de la microglía con otros tipos de células del SNC. La principal ventaja de este protocolo es que la microglía puede aislarse rápidamente del tejido de roedores de cualquier edad y cultivarse sin exposición al suero.Para extirpar el cerebro, corte el cóndilo occipital de la médula espinal de un animal por ambos lados con unas tijeras de disección, teniendo cuidado de no dañar el cerebro. Luego, corte la piel a lo largo de la parte superior del cráneo y corte un lado a lo largo del hueso parietal y frontal hacia el hueso nasal. Tire con cuidado de la parte superior del cráneo con pinzas, extraiga rápidamente el cerebro y colóquelo en DPBS preenfriado sobre hielo.Repita el procedimiento para todos los animales restantes. Después de que los cerebros se hayan recolectado en DPBS fríos, corte cada cerebro en trozos de un milímetro en un cubo en una placa de Petri sobre hielo con una hoja de bisturí fría y transfiéralo a un homogeneizador de onzas heladas con cinco a siete mililitros de tampón de douncing helado. A continuación, utilice un homogeneizador de rebote holgado para disociar el tejido con 10 a 20 movimientos suaves e incompletos.Tenga cuidado de no aplastar directamente el tejido en la parte inferior del homogeneizador. En su lugar, impulse el tejido a través del espacio entre los lados del pistón y el homogeneizador. Es importante homogeneizar lentamente el tejido con múltiples rondas de douncing para preservar la viabilidad de la microglía.Después, retire con cuidado el pistón para evitar que se introduzcan burbujas de aire. Permita que los trozos de tejido mal disociados se depositen en el fondo del homogeneizador y transfieran el sobrenadante a un nuevo tubo cónico refrigerado de 50 mililitros. Posteriormente, reemplace el volumen eliminado con un tampón de douncing nuevo y repita el procedimiento de disociación durante un total de tres a cuatro rondas, o hasta que todo el tejido se haya disociado.En este procedimiento, agregue tampón de douncing helado al tubo cónico de 50 mililitros que contiene la suspensión celular y ajuste el volumen total a 33,5 mililitros. A continuación, agregue 10 mililitros de MSB a la suspensión de celdas y mezcle bien invirtiendo el tubo varias veces. Esto dará como resultado una concentración final del 23% de MSB en un volumen de 43,5 mililitros.Después de eso, centrifugar las celdas durante 15 minutos a 500 x g a 4 grados centígrados con frenado lento. A continuación, retire la capa superior de mielina y residuos y el sobrenadante con una pipeta. Tenga cuidado al quitar la capa superior para asegurarse de que se elimine la mayor cantidad posible.A continuación, vuelva a suspender el pellet de celda en 12 mililitros de tampón de paneo. Tritura suavemente la suspensión celular para romper los grumos de células restantes. En este paso, pase la suspensión celular a través de un filtro de celdas de 70 micrómetros para eliminar desechos grandes o grupos de celdas.Enjuague el plato panorámico recubierto de OX42 tres veces con DPBS. No permitas que la placa se seque por completo entre lavados. Vierta el último lavado de DPBS y aplique la suspensión de celda filtrada a la placa de paneo.Gire suavemente la placa para distribuir las células. Luego, incube la placa en una superficie plana a temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir que las células se adhieran. No incube más de 20 minutos o será muy difícil recuperar las células del plato.Después, enjuague la placa de paneo con DPBS 10 veces para eliminar las células no adherentes. La microglía se adherirá firmemente a la placa, así que agite la placa con cada enjuague para asegurar la eliminación de otras células no adherentes. Vierta el último lavado de DPBS y reemplácelo con 15 mililitros de DPBS y 200 microlitros de tripsina.Para tripsinizar las células, incube la placa durante menos o igual a 10 minutos a 37 grados centígrados. Después de 10 minutos de tripsinización, la microglía todavía estará adherida a la placa. Vierta la mezcla y lave suavemente el plato dos veces con DPBS para eliminar la tripsina.Luego, reemplácelo con 12 mililitros de MGM helado. Posteriormente, coloque la placa de panorámica en hielo durante dos minutos para ayudar a debilitar la interacción entre la célula y el sustrato y asegúrese de que la placa esté plana para evitar que se sequen áreas de la placa de panorámica. Después de eso, pipetee vigorosamente con una pipeta de 10 mililitros y un controlador de pipeta a alta velocidad para recuperar las células de la placa de paneo.Dibuja una cuadrícula de 16 por 16 con el chorro de líquido de la pipeta para intentar eliminar todas las células. Es importante encontrar un equilibrio entre la recuperación celular general y la salud de su cultivo. El pipeteo repetido del sobrenadante celular contra la placa de paneo dará como resultado una reducción de la viabilidad de su cultivo.Revise las células bajo un microscopio con un aumento de 20x para asegurarse de que se hayan desprendido de la placa. Marque los puntos en la parte superior de la placa donde están atascadas las células y repita el pipeteo en esas áreas. Recoja la suspensión celular y asigne de tres a cuatro mililitros de sobrenadante en cada tubo cónico de 15 mililitros.Gíralo durante 15 minutos a 500 x g a cuatro grados centígrados con frenado lento. Pasados los 15 minutos, aspirar el sobrenadante, dejando 0,5 mililitros de MGM con el pellet de células. Luego, vuelva a suspender cada gránulo en el MGM restante y extraiga las células de todos los tubos.Después de eso, cuente las células con un hemocitómetro. Ahora, coloque 15 microlitros de recubrimiento de colágeno IV directamente en el centro de una placa de cultivo de tejido con recubrimiento catiónico aniónico de 24 pocillos e incube durante 15 minutos a 37 grados centígrados. Después de contar las células con un hemocitómetro, dilúyalas a 2,3 x 10 por cinco por mililitro en MGM.Aspire el punto IV de colágeno e inmediatamente coloque 15 microlitros de suspensión celular en este punto para producir 3,5 x 10 a las tres células por punto. A continuación, incube durante cinco a diez minutos a 37 grados centígrados para permitir que las células se adhieran. Luego, agregue suavemente 500 microlitros de TIC equilibrado de CO2 al pozo.Si se enchapa en cubreobjetos, primero cubra los cubreobjetos de vidrio estéril con 10 microgramos por mililitro de PDL en agua durante una hora a temperatura ambiente. Luego, lávelos tres veces con agua y déjelos secar en una capucha bajo luz ultravioleta antes de continuar con el recubrimiento puntual en los cubreobjetos. Con el fin de demostrar el éxito del aislamiento y cultivo de microglía de alta pureza, aislamos microglía de ratas P21 y cultivamos estas células en TIC o TIC suplementadas con FCS al 10% durante ocho días.A continuación, las células se fijaron y se tiñeron con marcadores microgliales y marcadores de proliferación. Las células cultivadas en TIC muestran una morfología ramificada, bajos niveles de proliferación y expresión de marcadores de microglía. En comparación, las células cultivadas en TIC suplementadas con 10% de FCS también se tiñeron para marcadores microgliales, pero muestran altos niveles de proliferación y morfología ameboide, propiedades que a menudo se observan en la microglía activada.Además de la tinción de marcadores celulares, RNA-Seq en células recién aisladas puede proporcionar una herramienta potente y sensible para evaluar el perfil de ARN de las células y puede ayudar a informar sobre la pureza inicial de los cultivos. El micropanning de CD11b generalmente da como resultado un pequeño porcentaje de neutrófilos positivos para CD11b y arrastre de monocitos, además de microglía positiva para CD11b. Estas células morirán en TIC después de unos días, pero pueden complicar el análisis de puntos de tiempo anteriores.Aquí hay una película de lapso de tiempo de la microglía de rata P21 después de 14 DIV en TIC. Después de dos semanas, los cultivos libres de suero muestran un comportamiento de vigilancia dinámico con rápidas extensiones y retracciones del proceso en toda la placa. Aquí hay una película de lapso de tiempo de la microglía de rata P21 después de cinco DIV en TIC antes y después de la exposición al suero fetal de ternero.Un cambio morfológico rápido es evidente después de la exposición al suero. Una vez dominado, este protocolo se puede hacer en cuatro o cinco horas, si se realiza correctamente. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros ensayos para controlar la fagocitosis, la quimiotaxis, la supervivencia, la liberación de citoquinas, las respuestas transcripcionales a los estímulos, con el fin de responder preguntas adicionales sobre la función de la microglía.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar rápidamente la microglía del tejido de roedores adultos y cultivarlos en condiciones libres de suero.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Aislamiento de la microglía primaria a partir de la heterogeneidad celular del cerebro es esencial para investigar su papel en las dos condiciones fisiológicas y patológicas. Este protocolo describe un aislamiento mecánico y técnica mixta de cultivo celular que proporciona un alto rendimiento y alta pureza, viables células primarias microgliales...

El aislamiento de la microglía Primaria cultivos mixtos de células gliales del tejido neonatal cerebro de rata

Este video muestra un método para aislar y cultivar microglía de cerebros de ratas. Consiste en separar la microglía de otras células neuronales y no neuronales mediante placas recubiertas con un anticuerpo monoclonal específico para la microglía.

Aislamiento y cultivo de microglía a partir de cerebros de rata utilizando medios sin suero

Este video muestra una técnica para la eliminación selectiva de microglía de un cultivo neuronal primario de rata. Las neuronas granulosas cerebelosas se tratan con un antimetabolito para eliminar las células gliales en proliferación. Además, se tratan con agentes dirigidos a los lisosomas para agotar la microglía del cultivo.

Eliminación selectiva de la microglía de un cultivo de neuronas de gránulos cerebelosos de rata

Nosotros describimos métodos para el aislamiento / cultura eficiente y rápida de la microglia viable desde la corteza cerebral neonatal y adulto de la médula espinal. La disección y placas de microglia cortical se puede lograr dentro de los 90 minutos, con la cosecha microglial posterior que tiene lugar ~ 10 días después de la disección inicial.

Microglia cultivo del Sistema Nervioso Central Neonatal y Adultos

Una clave para el éxito de la investigación de la biología microglial es la preservación de immunofunction microglial ex vivo durante el aislamiento del tejido del SNC. Aislar microglia mediante agitación rotatoria resultados en cultivos de células de alta pureza y inmunofuncional según la evaluación de imágenes fluorescentes, inmunocitoquímica y ELISA después de la activación microglia con el lipopolisacárido estímulos proinflamatorias (LPS) y Pam 3 CSK 4 (Pam).

Aislamiento de cortical Microglia con Inmunofenotipo Conservas y funcionalidad de murinos Neonatos

Aquí, se presenta un protocolo para aislar microglia de crías de ratón postnatal (día 1) para la experimentación in vitro. Este método improvisada de aislamiento genera tanto alto rendimiento y pureza, una ventaja significativa sobre métodos alternativos que permite amplia experimentación gama para los fines de elucidar la biología microglial.

El aislamiento magnético rápida y refinado CD11b de la microglia primaria con mayor pureza y versatilidad

Se presenta un protocolo para el aislamiento de primaria microglia del cerebro murino. Esta técnica ayuda a promover la comprensión actual de condiciones neurológicas. Centrifugación de gradiente de densidad y separación magnética se combinan para producir suficiente rendimiento de una muestra muy pura. Además, describiremos los pasos para la caracterización de la microglia.

Caracterización y aislamiento de Microglia primarios de ratón por centrifugación de gradiente de densidad

Este protocolo es un método eficiente, rentable y robusto para aislar la microglia primaria del tejido cerebral humano vivo, adulto. La microglia humana primaria aislada puede servir como una herramienta para estudiar los procesos celulares en la homeostasis y la enfermedad.

Obtención de Microglia Humana del Tejido Cerebral Humano Adulto

Los cultivos primarios de microglía se utilizan comúnmente para evaluar nuevas moléculas antiinflamatorias. El presente protocolo describe un método reproducible y relevante para aislar magnéticamente la microglía de cachorros neonatos.

Aislamiento magnético de células microgliales de ratones neonatos para cultivos celulares primarios

Este protocolo describe el aislamiento de astrocitos y microglía purificados de la médula espinal de ratones adultos, lo que facilita aplicaciones posteriores como el análisis de ARN y el cultivo celular. Incluye métodos detallados de disociación celular y procedimientos diseñados para mejorar tanto la calidad como el rendimiento de las células aisladas.

Aislamiento de astrocitos puros y microglía de la médula espinal de ratón adulto para ensayos in vitro y estudios transcriptómicos

La microglía está considerada como una de las células más versátiles del cuerpo, capaz de adaptarse morfológica y funcionalmente. Su heterogeneidad y multifuncionalidad permiten el mantenimiento de la homeostasis cerebral, a la vez que se relacionan con diversas patologías neurológicas. Aquí se describe una técnica para purificar la microglía de la médula espinal.

Enriquecimiento rápido y eficiente de la microglía de la médula espinal de ratón

Aprenda a aislar y cultivar microglía de roedores en medio libre de suero para estudiar su morfología ramificada y dinámica. Este método permite investigar interacciones celulares en neurociencia.

Aislamiento y cultivo de Microglia roedor para promover una dinámica ramifican morfología en medio libre de suero

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