Nuevo pasivo claro los métodos para la producción rápida de transparencia óptica en todo el tejido del SNC
8 de mayo de 2018
Aquí, presentamos dos metodologías novedosas, psPACT y mPACT, para lograr la máxima transparencia óptica y posterior análisis microscópico de vascularización del tejido en el roedor intacto todo CNS.
El objetivo general de estos métodos psPACT y mPACT es la limpieza rápida de todo el tejido del SNC sin la necesidad de un sistema de limpieza electroforética del tejido. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los modelos de investigación de enfermedades humanas, como la enfermedad de Alzheimer o las lesiones y la degeneración y la tumorigénesis. La principal ventaja de esta técnica es que el tejido del SNC del ratón no se daña por el aclaramiento electroforético del tejido, y se elimina rápidamente mediante el aclaramiento pasivo modificado.
Primero tuvimos la idea de este método después de usar el PACT original y el método anterior para limpiar el cerebro. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los métodos psPACT y mPACT son difíciles de ejecutar porque este método tiene múltiples etapas de preparación de la muestra. Comience preparando la solución de cóctel PACT agregando polvo VA-044 a una solución de 4% de PFA y 4% de acrilamida a una concentración final de 0.25%Después de perfundir los tejidos con la solución PACT, sumerja completamente todo el cerebro y la médula espinal en un tubo de 50 mililitros que contenga solución PACT enfriada y almacene a cuatro grados centígrados durante 24 horas.
24 horas después, transfiera el tejido a un tubo de 50 mililitros que contenga una solución PACT fresca y fría, y conecte la tapa del tubo a un sistema de hibridación de gel de tejido, conectado a un tanque de nitrógeno y ajustado a 37 grados centígrados. A continuación, encienda el vacío y el gas durante 10 minutos para incrustar la muestra en el gas nitrógeno. Para polimerizar el hidrogel, coloque el tubo que contiene la muestra en una incubadora agitadora ajustada a 150 rpm y 37 grados centígrados durante tres horas o hasta que se complete la polimerización.
Después de la incubación, use papel secante para eliminar el hidrogel polimerizado restante que rodea los tejidos. Luego, transfiera el tejido a un tubo de 50 mililitros que contenga solución de limpieza. Coloque la muestra en una incubadora agitadora ajustada a 37 grados centígrados y 150 rpm hasta que el tejido se haya limpiado.
En promedio, el CNS del ratón tarda unos 20 días en alcanzar una claridad completa. Inicie psPACT con el SNC a partir de un ratón perfundido con 4% de PFA que se ha fijado posteriormente en 4% de PFA a cuatro grados Celsius durante 24 horas. Lave el tejido fijo durante una hora en PBS 0,1 molar.
Después del lavado, transfiera el tejido a la solución A4P0 e incube a 37 grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente, después de lavar el tejido en PBS durante cinco minutos, sumerja el tejido en 0.25%VA-044 en PBS e incube a 37 grados Celsius durante seis a 24 horas. La separación de la acrilamida y el paso posterior de VA-044 evita la necesidad de eliminar los monómeros de hidrogel no polimerizados restantes que rodean el tejido, lo que puede comprometer la integridad final del tejido después de lograr la transparencia con PACT.
Después de la incubación, transfiera los tejidos a una solución fresca y fría de VA-044. A continuación, incruste la muestra en gas nitrógeno durante 10 minutos. Transfiera el tejido a una solución aclaradora.
Luego, incube la muestra en una incubadora agitadora configurada a 37 grados Celsius y 150 rpm hasta que el tejido se haya limpiado. En promedio, el SNC del ratón tarda aproximadamente 17 días en alcanzar una claridad completa. Para mPACT, siga el protocolo para psPACT hasta el paso de la solución de compensación.
A continuación, sumerja completamente la solución de limpieza de tejidos que contenga un 0,5 % de alfa-tioglicerol, un agente que no oscurece, además de un 8 % de SDS en 0,1 molares de PBS. Coloque la muestra en una incubadora agitadora ajustada a 37 grados centígrados y 150 rpm hasta que el tejido se haya limpiado. En promedio, el SNC del ratón tarda solo dos semanas en alcanzar una claridad completa mediante mPACT.
En el presente estudio, las muestras de cerebro de ratón tratadas a través del protocolo mPACT lograron transparencia óptica después de 14 días, por delante de las muestras tratadas a través de los protocolos PACT y psPACT. Las muestras enteras de SNC de rata aclaradas por mPACT lograron un aclaramiento máximo en 20 días. Solo los cerebros de ratas adultas, en lugar de todo el SNC, se limpiaron con mPACT en solo cinco días.
Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos semanas con todo el SNC del ratón si se realiza correctamente. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia y la anatomía exploraran las enfermedades fisiopatológicas, como las lesiones tisulares, las malformaciones del desarrollo, el cáncer y las enfermedades neurodegenerativas en modelos del SNC de mamíferos.
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Resumen
Este estudio presenta dos metodologías innovadoras, psPACT y mPACT, para mejorar la transparencia óptica y facilitar el análisis microscópico de la vasculatura del sistema nervioso central (SNC) de roedores intacta. Las técnicas buscan aclarar rápidamente todo el tejido del SNC sin dañarlo, abordando preguntas clave relacionadas con modelos de enfermedades humanas como la enfermedad de Alzheimer y la tumorigénesis.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Técnicas de aclarado de tejidos
- Imagen microscópica
Antecedentes
- El estudio se basa en métodos previos, destacando las limitaciones del aclaramiento tisular electroforético.
- Enfatiza la necesidad de procesos de aclaramiento rápidos y eficaces para el tejido del SNC de roedores.
- Ofrece soluciones tanto para la investigación básica como para las implicaciones clínicas en neurociencia.
Objetivo del estudio
- Desarrollar y validar psPACT y mPACT como protocolos eficientes para la clarificación de tejidos del SNC.
- Ampliar las capacidades de los investigadores que estudian condiciones neuropatológicas.
- Facilitar una mejor visualización de la vasculatura tisular en el SNC.
Métodos Utilizados
- Los métodos implican un protocolo de múltiples etapas para preparar y aclarar tejido del SNC utilizando soluciones PACT.
- Los modelos biológicos clave incluyen muestras del SNC de ratón y rata, con énfasis en lograr transparencia óptica.
- psPACT generalmente tarda unos 20 días en alcanzar una claridad completa, mientras que mPACT puede lograrlo en aproximadamente 14 días.
- Se emplean soluciones especializadas y ambientes de incubación para los procesos de polimerización y aclaramiento.
Resultados principales
- mPACT ofrece una reducción significativa del tiempo de aclarado de tejidos en comparación con los métodos tradicionales.
- Las muestras tratadas con mPACT mostraron transparencia óptica en un período más corto, lo que sugiere una eficiencia mejorada para aplicaciones de investigación.
- Las técnicas demuestran ser efectivas para facilitar el estudio de diversas afecciones neurológicas.
Conclusiones
- Este estudio permite una eliminación rápida y eficiente de tejido del SNC, mejorando las capacidades de investigación en el campo de la neurociencia.
- Las metodologías novedosas sirven como herramientas valiosas para explorar mecanismos de enfermedades y lesiones tisulares.
- Las implicaciones para comprender las enfermedades neurodegenerativas y mejorar los estudios patológicos mediante técnicas de imagen mejoradas son considerables.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Métodos pasivos de aclarado novedosos como psPACT y mPACT abordan un cuello de botella crítico en la I+D de neurociencia al permitir una transparencia óptica rápida y de alta fidelidad en tejidos del SNC completos, sin daño electroforético. Esta capacidad apoya la validación de dianas y la reducción del riesgo mecanicista en modelos de enfermedades neurodegenerativas, al preservar la arquitectura subcelular mientras acelera los tiempos de imagen. Las técnicas mejoran la confianza predictiva en estudios preclínicos de modelos de Alzheimer, tumorigénesis y lesión mediante una visualización mejorada de los fenotipos neuropatológicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas en modelos del SNC intactos al preservar estructuras subcelulares y circuitos celulares para estudios de interacción con el blanco.
- Valor operativo: Reduce los artefactos de procesamiento del tejido asociados con la eliminación electroforética, mejorando la reproducibilidad de los resultados del cribado fenotípico.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al proporcionar lecturas más claras de la progresión neurodegenerativa en sistemas relevantes para la enfermedad.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Genera preparaciones del SNC estandarizadas y transparentes adecuadas para imágenes de alta resolución de biomarcadores subcelulares y modulación de vías.
- Valor operativo: Elimina la necesidad de equipos electroforéticos especializados, reduciendo las barreras para la implementación del ensayo en diversos equipos de investigación.
- Escalabilidad: mPACT logra la transparencia del SNC de ratón en aproximadamente 14 días, lo que permite cronogramas predecibles para campañas de cribado de compuestos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Facilita la transición fluida desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante el mantenimiento de la integridad del tejido para estudios longitudinales de tumorigénesis y malformaciones del desarrollo.
- Reducción de Riesgos Mecánicos: Permite la visualización de estructuras subcelulares en tejidos patológicos, reduciendo la ambigüedad en la interpretación del mecanismo del blanco.
- Fidelidad del Modelo de Enfermedad: Permite una eliminación consistente del sistema nervioso central en especies de roedores (ratón/rata), mejorando la comparabilidad entre estudios en farmacología de seguridad.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
psPACT y mPACT se integran en la fase temprana de descubrimiento hasta la etapa preclínica, apoyando específicamente la validación de dianas mediante la optimización de compuestos líderes al proporcionar modelos del SNC cuantificables y listos para imágenes.
- Biología del Descubrimiento: Permite la comprobación de hipótesis mediante la creación de mapas tridimensionales de la expresión proteica y la distribución celular en tejidos intactos, aclarando la participación de vías en modelos de enfermedades.
- Selección: Proporciona preparaciones tisulares cuantitativas y reproducibles que permiten la evaluación estandarizada de los efectos de compuestos sobre la arquitectura del sistema nervioso central.
- Análisis: Genera resultados de imágenes de alta resolución que permiten a los equipos comparar cambios estructurales entre distintas condiciones de tratamiento con una mejor relación señal-ruido.
- Investigación Traslacional: Mantiene la continuidad proteómica y estructural desde la fase de descubrimiento hasta las etapas preclínicas, facilitando la alineación de biomarcadores en modelos de neurodegeneración y lesión.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable de aclarado del sistema nervioso central aplicable a múltiples proyectos que estudian neuropatologías, reduciendo el desarrollo metodológico redundante.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista mediante la visualización de tejidos intactos.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y la reproducibilidad al evitar parámetros electroforéticos variables y dependencias de equipos.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia en las decisiones de avance o interrupción al acelerar la generación de datos preclínicos para candidatos dirigidos al sistema nervioso central.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de programas de neurodegeneración y oncología mediante lecturas fenotípicas más rápidas y claras.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en histología de tejidos, química de hidrogeles y ejecución de protocolos de incubación para gestionar la preparación de muestras en múltiples etapas.
- Depende de incubadoras con agitación, sistemas de gas nitrógeno y ambientes con control de temperatura para las fases de polimerización y aclarado del hidrogel.
- Necesita la estandarización entre equipos en la preparación de soluciones (por ejemplo, concentraciones de VA-044, SDS) y controles de tiempo para garantizar la reproducibilidad entre laboratorios.
- La adaptación a tejidos no del SNC (por ejemplo, riñón, bazo) requiere validación de los tiempos de aclarado y de la preservación estructural, como se indica en la bibliografía citada.
- Limitación práctica: El éxito del protocolo depende de una ejecución meticulosa debido a las múltiples etapas de preparación, ya que cualquier desviación puede provocar un aclarado incompleto o daño tisular.
