Name: Nuevo pasivo claro los métodos para la producción rápida de transparencia óptica en todo el tejido del SNC (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Aprende los métodos psPACT y mPACT para aclarar rápidamente tejido completo del SNC en roedores sin daño electroforético. Estas técnicas facilitan el análisis microscópico de vasculatura cerebral en modelos de enfermedades neurodegenerativas.

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Este trabajo fue apoyado por el proyecto cerebro Corea 21 PLUS para ciencias médicas, Universidad de Yonsei. Además, este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Nacional de investigación de Corea (NRF-2017R1D1A1B03030315).

Todos los procedimientos han sido aprobados por el Comité de ética de la investigación adecuada en el Colegio de medicina de la Universidad de Yonsei. Todos los animales experimentales son sacrificados con arreglo a las directrices del Comité de cuidado de los animales de laboratorio en la Universidad de medicina de la Universidad de Yonsei.
1. preparación de reactivos
PRECAUCIÓN: Paraformaldehido (PFA), acrilamida y sodio dodecil sulfato (SDS) son tóxicos irritantes y por lo tanto debe manejarse en una campana de humos con equipo de protección personal (PPE, bata, guantes, gafas protectoras).
<ol><li>solución de acrilamida (A.A) 4% (A4P0): Añadir 20 mL de solución de acrilamida del 40% a 180 mL de 0.1 M tampón fosfato salino (PBS).</li>
	<li>Solución al 0.25% VA-044: agregar 0.5 g de 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] diclorhidrato (VA-044) polvo en 200 mL de 0.1 M tampón fosfato salino (PBS). Mientras que el polvo VA-044 puede almacenarse a temperatura ambiente, deben almacenarse a 4 ° C sobre la solubilización en PBS. Para mejores resultados, prepare sólo la cantidad de solución necesaria para el experimento.</li>
	<li>Solución cóctel Pacto: Añadir 10 g de acrilamida a 225 mL de solución al 4% paraformaldehido (PFA) y ajustar el volumen a 200 mL con 4% PFA. Antes de usar Añadir 100 mg de polvo de VA-044 a 40 mL de la mezcla en un tubo cónico de 50 mL.</li>
	<li>Pacto de compensación buffer solución: Añadir 40 g de sulfato de sodio dodecyl (SDS) a 350 mL de PBS de 0,1 M y ajuste el volumen a 500 mL con PBS de 0,1 M. Para mPACT claro solución, Añadir 0,5% α-thioglycerol al Pacto de compensación buffer de solución.</li>
	<li>Los ratones utilizados en este estudio fueron ratones machos de BALB de 2 semanas de edad; las ratas utilizadas en este estudio fueron 2 semanas de edad SD-ratas macho.</li>
</ol>2. anestesia y la cirugía de la perfusión
PRECAUCIÓN: PFA acrilamida son tóxicos irritantes y por lo tanto debe manejarse en una campana de humos con PPE apropiado.
<ol><li>Anestesiar al animal en un ambiente libre de patógenos con 30 mg/kg zoletil utilizando una jeringa de 1 mL con una aguja de calibre 26. Vigilar al animal para 5-10 min.</li>
	<li>Una vez que el animal ha alcanzado un plano quirúrgico de anestesia, utilice el método de respuesta del pellizco del dedo del pie para determinar la profundidad de la anestesia. Confirman falta de respuesta. Nota: Los siguientes pasos involucrando cirugía de ratón y rata siguen un protocolo similar usado en un anterior estudio11.</li>
	<li>Haga una incisión de 5-6 cm por debajo de la caja torácica, a través del tegumento y de la pared abdominal.</li>
	<li>Utilice tijeras curvadas, romos para hacer una incisión en el diafragma, palpando la zona torácica para localizar el sitio de la incisión previamente.</li>
	<li>Extender la incisión a través de toda la longitud de la caja torácica para exponer la cavidad pleural.</li>
	<li>Desplazar con cuidado los pulmones. Hacer un corte a través de la caja torácica a la altura de la clavícula. Usando las tijeras de iris, haga una pequeña incisión en la parte posterior del ventrículo izquierdo. Inserte una aguja calibre 18 u oliva-punta de la perfusión en la aorta ascendente, pasando por el ventrículo corte.</li>
	<li>Asegure la aguja y evitar fugas por el corazón con una pinza de sujeción. Alternativamente, utilizar una pinza modificada para apretar la aorta alrededor de la punta de la aguja.</li>
	<li>Hacer una gran incisión en la aurícula derecha, teniendo cuidado de asegurar un mínimo daño a la aorta descendente. La rata está ahora lista para perfusión.</li>
</ol>3. toda perfusión y disección de la rata
PRECAUCIÓN: PFA acrilamida son tóxicos irritantes y por lo tanto debe manejarse en una campana de humos con PPE apropiado.
Nota: Los siguientes pasos de perfusión todo son un similar a un protocolo que se utiliza en un estudio previo por Woo et al. (2016) 10 , 11.
<ol><li>Fije la aurícula derecha del corazón a una aguja de calibre 18, teniendo cuidado de no introducir burbujas de aire.</li>
	<li>Rápida y uniformemente bomba utilizando una jeringa de 50 mL, de 50 mL de solución de PBS de 0,1 M fría que contiene heparina (10 unidades/mL).</li>
	<li>Conecte la aguja de calibre 18 para el tubo de la bomba peristáltica.</li>
	<li>Lave con 200 mL de solución de PBS de 0,1 M fría que contiene heparina (10 unidades/mL) a una velocidad de circulación de 10 mL/min.</li>
	<li>Fijar con 250 mL de solución fría de PFA 4% a una velocidad de circulación de 10 mL/min. La rata debe ser rígida en este momento.</li>
	<li>Recoger y almacenar la solución restante de PFA para su eliminación.</li>
	<li>Pacto, perfusión de los tejidos con una solución cóctel frío de Pacto de 4% PFA 4% acrilamida y 0.25% VA-044 polvo con una aguja de calibre 18 y retire la cabeza y columna vertebral. Exponer el cráneo haciendo una incisión de línea media del cuello a la nariz. Este paso adicional de la perfusión es necesaria para los métodos psPACT y mPACT; después de la fijación, inmediatamente aislar la cabeza y la columna vertebral y exponer el cráneo.</li>
	<li>Exponer la base del cráneo mediante la eliminación de cualquier cuello residual y muscular de la columna vertebral.</li>
	<li>Utilizar gubias y tijeras para pelar lejos del cráneo. Quitar el cerebro y la médula espinal.</li>
	<li>Guarde el tejido en 4% PFA a 4 ° C; los tejidos pueden conservarse hasta 1 semana.</li>
</ol>4. hidrogel monómero infusión y polimerización del SNC de rata y ratón
PRECAUCIÓN: Acrilamida, SDS, α-thioglycerol y PFA son irritantes y por lo tanto deben manejarse en una campana de humos y con PEE apropiado.
<ol><li>
Pacto (compensación técnica pasiva)
	<ol>
<li>Aislar y cultura todo SNC (cerebro y médula espinal) de las ratas y ratones fijadas a un tubo de 50 mL que contiene una solución cóctel fría de Pacto de 4% PFA, 4% de acrilamida y 0.25% VA-044 polvo y almacenar a 4 ° C por 24 h. Asegúrese de que el tejido está completamente inmerso en la s olution.</li>
		<li>Embeber la muestra en gas nitrógeno para 10 minutos utilizando un gel sistema de hibridación conectado a un tanque de nitrógeno: sistema a 37 ° C. Transferencia de tejidos en un tubo de 50 mL que contenga dulce frío (4 ° C) Pacto solución cóctel y conectar con la tapa del tubo, girar en el vacío.</li>
		<li>Para polimerizar el hidrogel, coloque el tubo que contiene la muestra en un incubador de agitación (150 rpm, 37 ° C) durante 3 horas o hasta que la polimerización sea completa.</li>
		<li>Usando papel secante (véase Tabla de materiales), quitar el restante hidrogel polimerizado alrededor de los tejidos.</li>
		<li>Transferir el tejido a un tubo de 50 mL conteniendo solución clearing (8% de SDS en PBS de 0,1 M, pH 8.0).</li>
		<li>Coloque la muestra en un incubador de agitación poner a 37 ° C y 150 rpm hasta que el tejido se ha borrado. En promedio, tarda unos 20 días para el ratón del CNS para lograr claridad completa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
psPACT (proceso separado técnica pasiva claro)
	<ol>
<li>Aislar todo SNC (cerebro y médula espinal) con hueso cortador y tijeras de PFA-fijo de ratones y ratas en una mesa de trabajo limpia.</li>
		<li>Transferencia de tejidos para un tubo de 50 mL que contiene 4% PFA y almacenar a 4 ° C por 24 h. aseguran que el tejido está totalmente inmerso en el fijador.</li>
		<li>Lavar el tejido fijo para 1 h en PBS de 0,1 M y luego se transfieren a la solución de A4P0 (4% acrilamida en PBS de 0,1 M). Tienda a 37 ° C durante 24 h.</li>
		<li>Lavar el tejido durante 5 minutos en PBS de 0,1 M.</li>
		<li>Sumergir el tejido en 0.25% VA-044 en PBS de 0,1 M. Mantenga a 37 ° C durante 6-24 h y luego se transfieren a la solución de PBS-044/VA de 0.25% fresca.</li>
		<li>Embeber la muestra en gas nitrógeno para 10 minutos utilizando un gel hibridación sistema (véase Tabla de materiales) conectado a un tanque de nitrógeno: transferencia de tejidos en un tubo de 50 mL que contenga dulce frío (4 ° C) solución de PBS-044/VA de 0.25% y conectar con la tapa del tubo. Encienda la aspiradora.</li>
		<li>Transferir el tejido a limpiar solución (8% de SDS en PBS de 0,1 M, pH 8.0).</li>
		<li>Incubar la muestra en un incubador de agitación poner a 37 ° C y 150 rpm hasta que el tejido se ha borrado. En promedio, tarda aproximadamente 17 días para mouse CNS para lograr claridad completa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
mPACT (técnica de compensación pasiva modificado)
	<ol>
<li>Aislar todo SNC (cerebro y médula espinal) con hueso cortador y tijeras de PFA-fijo de ratones y ratas en una mesa de trabajo limpia.</li>
		<li>Siga los pasos 4.2.2 - 4.2.8 del protocolo psPACT.</li>
		<li>Transferir el tejido a limpiar solución. Observe que a diferencia de los protocolos de Pacto y psPACT, mPACT requiere una solución claro de 0.5% α-thioglycerol además de SDS de 8% en PBS de 0,1 M, pH 8.0. Α-thioglycerol es un agente sin dorador que ayuda a eliminar tejido más rápidamente y con eficacia. Asegúrese de que el tejido se sumerge totalmente en la solución.</li>
		<li>Coloque la muestra en un incubador de agitación poner a 37 ° C y 150 rpm hasta que el tejido se ha borrado. En promedio, tarda aproximadamente 2 semanas para mouse CNS para lograr claridad completa.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Índice de refracción que empareja y el Immunostaining del CNS despejado
Nota: nllantas (Nycodenz solución basada en Índice de refracción que empareja) consiste en 0,8 g/mL Nycodenz polvo disuelto en 30 mL de tampón base (0,01% de azida sódica y Tween-20 en PBS de 0,1 M, pH 8.0). Se recomienda que la solución esté en a 37 ° C agitando incubadora para permitir la adecuada solvatación del polvo.
<ol><li>Incubar los tejidos en 0,1% Tritón X-100 en PBS de 0,1 M durante 2 h, luego bloquear con 2% albúmina sérica bovina (BSA) en PBS de 0,1 M durante 6 h.</li>
	<li>Lávese las secciones tres veces en SAFT (0,1% Tween-20 en PBS de 0,1 M) de 2 h. Mancha secciones con anticuerpos primarios (en este caso, un anticuerpo de anti-conejo PECAM-CD31, que tiñe los vasos sanguíneos) para 2 días.</li>
	<li>Mancha de secciones con anticuerpos secundarios (en este caso, un cabra anti-conejo IgG Cy3 fluorescente conjugado) en 2% de BSA durante 2 días.</li>
	<li>Lavado había etiquetado tejidos tres veces en SAFT durante 2 h y tienda en 15 mL llantas n2-10 días.</li>
	<li>Antes de la proyección de imagen, hacia tejidos etiquetados una pequeña cantidad de nllantas en platos de cultivo de tejidos de 35 o 60 milímetros. Fijar con silicona alrededor del borde inferior del plato.</li>
	<li>Añadir 1.5-2 mL de fresco nllantas.</li>
</ol>6. tratamiento de la imagen
<ol><li>Adquisición de imágenes de tejidos despejados con azulejo análisis mediante un aumento de 10 x-sistema de escaneo láser confocal microscopewith (véase Tabla de materiales). De tejido marcado con Cy3, utilizar longitudes de onda de 550-600 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+brain+imaging%3A+A+powerful+tool+for+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience.</a> Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+reveals+dynamics+of+ovarian+follicular+architecture+and+vasculature+in+three-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions.</a> Sci Rep. 7, 44810(2017).</li>
<li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology%2C+CLARITY%2C+to+intact+solid+organs+including+brain%2C+pancreas%2C+liver%2C+kidney%2C+lung%2C+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Dev Biol. 14, 48(2014).</li>
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<li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Exp Mol Med. 48 (12), 274(2016).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+clearing+of+the+mouse+central+nervous+system+using+passive+CLARITY%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+A+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Choi, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+the+receptor+for+advanced+glycation+end+products+in+neurons+and+astrocytes+in+a+triple+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Exp Mol Med. 46, 75(2014).</li>
<li>Chang, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contralaterally+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells+%28ENStem-A%29+migrate+and+improve+brain+functions+in+stroke-damaged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats.</a> Exp Mol Med. 45, 53(2013).</li>
<li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+differential+plaque+depositions+in+the+brains+of+Tg2576+and+Tg-APPswe%2FPS1dE9+transgenic+mouse+models+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease.</a> Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).</li>
<li>Kinameri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prdm+proto-oncogene+transcription+factor+family+expression+and+interaction+with+the+Notch-Hes+pathway+in+mouse+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis.</a> PLoS One. 3 (12), e3859(2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Mientras que los métodos de extracción pasiva, no electroforéticas emplean en pacto mejoró significativamente la consistencia alcanzada con tejido anterior claro métodos tales como la claridad2,3,4,7 , 8, la técnica aún tiene varios defectos, el más acuciante de que es la longitud de tiempo requerido para lograr el máximo tejido claridad12</s...

Un objetivo fundamental de la investigación científica y clínica consiste en lograr una comprensión completa de la estructura de órgano y función; sin embargo, la naturaleza extremadamente compleja de órganos mamíferos a menudo sirve como una barrera para alcanzar plenamente este objetivo1. CLARIDAD (intercambian lípidos claro cruzado por hibridación acrilamida rígido compatible con la proyección de imagen Tisssue-hidrogel)2,3,4, que implica la construcción de un híbrido basados en acrilamida hidrogel de tejidos intactos, logra separación óptica de una variedad de órganos, incluyendo el cerebro, el hígado y el bazo, mientras que preserva su integridad estructural5. CLARIDAD así ha permitido no sólo la visualización, sino también la oportunidad de disecar finamente complejas redes celulares y morfologías de tejido sin necesidad de seccionar.
Para lograr la separación de tejido, claridad emplea métodos electroforéticos para eliminar el contenido de lípidos de la muestra de mano. Mientras que la claridad se ha observado para producir híbridos de tejido-hidrogel físicamente estable, los estudios han demostrado que el uso de métodos de electroforesis tejido claro (ETC) produce resultados variables en cuanto a la calidad del tejido, incluyendo dorado, daño del epítopo, y pérdida de proteína de5,6. Para tratar estos temas, protocolos modificados como Pacto (pasivo claridad técnica), que sustituye el tratamiento etc. con una técnica pasiva, detergente iónico delipidation basado, han sido desarrollados7,8,9. A pesar de lograr una mayor consistencia en los resultados, sin embargo, pacto requiere más tiempo para obtener la máxima separación. Además, ninguna de estas técnicas todavía se aplicaron a la forma entera de la CNS, o en modelos más grandes roedores como las ratas y conejillos de Indias.
El presente estudio pretende abordar estas limitaciones proponiendo metodologías novela, psPACT (Pacto de proceso separado) y mPACT (Pacto modificado), para facilitar la rápida liquidación de CNS todo los órganos internos en modelos de ratón y rata10. Específicamente, psPACT procesos de tejidos en acrilamida 4% y 0.25% VA-044 en dos pasos separados durante la formación del hidrogel; mPACT esencialmente implica los mismos pasos, pero complementa la solución claro basado en SDS 0,5% α-thioglycerol como un reactivo clave. Ambas técnicas aprovechan la endógena sistémica y cerebroespinal circulatorio para reducir significativamente el tiempo necesario para producir la separación óptica. Como una prueba de principio, nos demuestran el uso de la microscopia confocal para analizar patrones de vasos sanguíneos en los tejidos despejado10.

<table><tbody><tr><td>Dodecil Sulfato de Sodio (SDS)</td><td>Affymetrix, Inc.</td><td>75819</td><td>Solución de limpieza</td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Axia-Shield</td><td>1002424</td><td>solución nRIMS</td></tr><tr><td>Solución de acrilamida al 40% Bio</td><td>Rad Laboratories, Inc.</td><td>161-0140</td><td>Polimerización (A4P0)</td></tr><tr><td>2,2&agudo;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-il)propano] Dihidrocloruro</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>017-19362</td><td>Polimerización (VA-044)</td></tr><tr><td>1-Tioglicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1753-100ML</td><td>Solución de limpieza (mPACT)</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Georgiachem</td><td>9005-64-5</td><td>Solución nRIMS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td>Inmunotinción</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Bovogen</td><td>BSA100</td><td>Heparina inmunoteñida</td></tr><tr><td></td><td>Merck Millipore</td><td>375095</td><td>Perfusión (PBS)</td></tr><tr><td>Azida de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>solución nRIMS</td></tr><tr><td>Anticuerpo PECAM-CD31</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-28188</td><td>Tinción inmunológica</td></tr><tr><td>de cabra anti-IgG Cy3 conjugado fluorescente</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>111-165-003</td><td>Tinción inmunológica</td></tr><tr><td>al 4% de paraformaldehído</td><td>Tech & Innovación</td><td>BPP-9004</td><td>Perfusión, Polimerización</td></tr><tr><td>20X Solución salina tamponada con fosfato (pH 7.4)</td><td>Tech & Innovación</td><td>BPB-9121</td><td>Perfusión, Tampón</td></tr><tr><td>10 mL stripette</td><td>Coatar</td><td>4488</td><td>Transferencia de solución</td></tr><tr><td>Tubo de 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>Tubo de limpieza</td></tr><tr><td>35 mm Placa de cultivo celular</td><td>SPL</td><td>20035</td><td></td></tr><tr><td>Imagen Placa confocal</td><td>SPL</td><td>211350</td><td></td></tr><tr><td>Imagen Jeringa de 1 mL Korea</td><td>vaccine Co., Ltd</td><td>26G 1/2</td><td>Anestesiar&nbsp;</td></tr><tr><td>Jeringa de 50 mL</td><td>Vacuna coreana Co., Ltd</td><td>21G1 1/4</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td> de perfusión <td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td>Polimerización (A4P0)</td></tr><tr><td>Papel Whatman 3MM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z270849</td><td>Papel secante para la eliminación de gel</td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>ZEN lite Software</td><td>Zeiss</td><td>ZEN 2012</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Longerpump</td><td>BT100-1F</td><td>Perfusión</td></tr><tr><td>EasyGel</td><td>Lifecanvas Technologies</td><td>EasyGel</td><td>Sistema de hibridación de gel tisular</td></tr></tbody></table>

nuevo pasivo claro los métodos para la producción rápida de transparencia óptica en todo el tejido del snc

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Desde el desarrollo de la claridad, un bioelectroquímicos limpieza técnica permite mapeo tridimensional fenotipo dentro de tejidos transparentes, una multitud de metodologías de novela claro incluyendo cúbicos (proyección de imagen de cerebro claro y sin obstrucciones cócteles y análisis computacional), interruptor (todo el sistema de control de tiempo de interacción) y la cinética de los productos químicos, mapa (ampliada análisis del proteoma), Pacto (técnica de claridad pasivo), se han establecido para ampliar las herramientas existentes para el análisis microscópico de tejidos biológicos. El presente estudio pretende mejorar y optimizar el procedimiento de Pacto original para una gran variedad de tejidos de roedores intactos, incluyendo el todo sistema nervioso central (CNS), riñones, bazo y embriones de ratón todo. Denominado psPACT (Pacto de proceso separado) y mPACT (Pacto modificado), estas nuevas técnicas proporcionan medios altamente eficaces de asignación de circuitos de células y visualizar estructuras subcelulares en los tejidos normales y patológicos intactos. En el siguiente protocolo, proporciona un contorno detallado, paso a paso cómo lograr separación máxima del tejido con mínima invasión de su integridad estructural a través de psPACT y mPACT.

Generación de un modelo transparente del CNS todo claro pasivo optimizado técnicas
Espacio óptico de los tejidos CNS todo ratón y rata se logró rápidamente utilizando diversas técnicas de compensación pasiva (figura 1). Un esquema de tejido claro con el tiempo se muestra en la figura 2A. A diferencia del método original del Pacto, psPACT (Pacto de proce...

Aquí, presentamos dos metodologías novedosas, psPACT y mPACT, para lograr la máxima transparencia óptica y posterior análisis microscópico de vascularización del tejido en el roedor intacto todo CNS.

Nuevo pasivo claro los métodos para la producción rápida de transparencia óptica en todo el tejido del SNC

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

El objetivo general de estos métodos psPACT y mPACT es la limpieza rápida de todo el tejido del SNC sin la necesidad de un sistema de limpieza electroforética del tejido. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los modelos de investigación de enfermedades humanas, como la enfermedad de Alzheimer o las lesiones y la degeneración y la tumorigénesis. La principal ventaja de esta técnica es que el tejido del SNC del ratón no se daña por el aclaramiento electroforético del tejido, y se elimina rápidamente mediante el aclaramiento pasivo modificado.Primero tuvimos la idea de este método después de usar el PACT original y el método anterior para limpiar el cerebro. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los métodos psPACT y mPACT son difíciles de ejecutar porque este método tiene múltiples etapas de preparación de la muestra. Comience preparando la solución de cóctel PACT agregando polvo VA-044 a una solución de 4% de PFA y 4% de acrilamida a una concentración final de 0.25%Después de perfundir los tejidos con la solución PACT, sumerja completamente todo el cerebro y la médula espinal en un tubo de 50 mililitros que contenga solución PACT enfriada y almacene a cuatro grados centígrados durante 24 horas.24 horas después, transfiera el tejido a un tubo de 50 mililitros que contenga una solución PACT fresca y fría, y conecte la tapa del tubo a un sistema de hibridación de gel de tejido, conectado a un tanque de nitrógeno y ajustado a 37 grados centígrados. A continuación, encienda el vacío y el gas durante 10 minutos para incrustar la muestra en el gas nitrógeno. Para polimerizar el hidrogel, coloque el tubo que contiene la muestra en una incubadora agitadora ajustada a 150 rpm y 37 grados centígrados durante tres horas o hasta que se complete la polimerización.Después de la incubación, use papel secante para eliminar el hidrogel polimerizado restante que rodea los tejidos. Luego, transfiera el tejido a un tubo de 50 mililitros que contenga solución de limpieza. Coloque la muestra en una incubadora agitadora ajustada a 37 grados centígrados y 150 rpm hasta que el tejido se haya limpiado.En promedio, el CNS del ratón tarda unos 20 días en alcanzar una claridad completa. Inicie psPACT con el SNC a partir de un ratón perfundido con 4% de PFA que se ha fijado posteriormente en 4% de PFA a cuatro grados Celsius durante 24 horas. Lave el tejido fijo durante una hora en PBS 0,1 molar.Después del lavado, transfiera el tejido a la solución A4P0 e incube a 37 grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente, después de lavar el tejido en PBS durante cinco minutos, sumerja el tejido en 0.25%VA-044 en PBS e incube a 37 grados Celsius durante seis a 24 horas. La separación de la acrilamida y el paso posterior de VA-044 evita la necesidad de eliminar los monómeros de hidrogel no polimerizados restantes que rodean el tejido, lo que puede comprometer la integridad final del tejido después de lograr la transparencia con PACT.Después de la incubación, transfiera los tejidos a una solución fresca y fría de VA-044. A continuación, incruste la muestra en gas nitrógeno durante 10 minutos. Transfiera el tejido a una solución aclaradora.Luego, incube la muestra en una incubadora agitadora configurada a 37 grados Celsius y 150 rpm hasta que el tejido se haya limpiado. En promedio, el SNC del ratón tarda aproximadamente 17 días en alcanzar una claridad completa. Para mPACT, siga el protocolo para psPACT hasta el paso de la solución de compensación.A continuación, sumerja completamente la solución de limpieza de tejidos que contenga un 0,5 % de alfa-tioglicerol, un agente que no oscurece, además de un 8 % de SDS en 0,1 molares de PBS. Coloque la muestra en una incubadora agitadora ajustada a 37 grados centígrados y 150 rpm hasta que el tejido se haya limpiado. En promedio, el SNC del ratón tarda solo dos semanas en alcanzar una claridad completa mediante mPACT.En el presente estudio, las muestras de cerebro de ratón tratadas a través del protocolo mPACT lograron transparencia óptica después de 14 días, por delante de las muestras tratadas a través de los protocolos PACT y psPACT. Las muestras enteras de SNC de rata aclaradas por mPACT lograron un aclaramiento máximo en 20 días. Solo los cerebros de ratas adultas, en lugar de todo el SNC, se limpiaron con mPACT en solo cinco días.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos semanas con todo el SNC del ratón si se realiza correctamente. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia y la anatomía exploraran las enfermedades fisiopatológicas, como las lesiones tisulares, las malformaciones del desarrollo, el cáncer y las enfermedades neurodegenerativas en modelos del SNC de mamíferos.

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Investigación

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Neurociencia

Aquí se describe un método rápido y sencillo a las células de la imagen marcados con fluorescencia en rodajas de cerebro semi-espesa. Mediante la fijación, corte, limpieza y ópticamente el tejido cerebral se describe la forma de imagen estándar de epifluorescencia y confocal se puede utilizar para visualizar las células individuales y las redes neuronales en el tejido nervioso intacto.

Un enfoque rápido para imágenes de fluorescencia de alta resolución en rodajas de cerebro semi-gruesa

Las técnicas de aclarado óptico están revolucionando la forma en que se visualizan los tejidos. En este informe describimos las modificaciones del protocolo original Clear-Lipid-Exchange-Acrylamide-Hibridado-Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) que produce resultados más consistentes y menos costosos.

Clearing óptico del sistema nervioso central del ratón Utilizando CLARITY pasiva

ACT-PRESTO (claridad técnica de presión activa derivada de la transmisión eficiente y estable de macromoléculas en órganos) permite el despeje rápido de los tejidos, eficiente, pero de bajo costo y la penetración rápida de anticuerpos en los tejidos aclarados por difusión pasiva o el parto asistido por presión. Usando este método, una amplia gama de tejidos se puede borrar, immunolabeled de múltiples anticuerpos, y la imagen de volumen.

ACT-PRESTO: Aclaración del tejido biológico y métodos para immunolabeling Volume Imaging

La combinación de etiquetado de anticuerpos, limpieza óptica y microscopía de luz avanzada permite el análisis tridimensional de estructuras u órganos completos. Aquí se describe un método sencillo para combinar la inmunoetiquetado de rodajas renales gruesas, la limpieza óptica con la canela etílico y la imagen confocal que permite la visualización y cuantificación de estructuras renales tridimensionales.

Limpieza óptica e imágenes del tejido renal inmunoetiquetado

La morfología dendrítica neuronal a menudo subyace a la función. De hecho, muchos procesos de enfermedad que afectan el desarrollo de las neuronas se manifiestan con un fenotipo morfológico. Este protocolo describe un método simple y poderoso para analizar cenadores dendríticos intactos y sus espinas asociadas.

Obtención de imágenes y cuantificación de dendritas neuronales intactas a través de CLARITY Tissue Clearing

El protocolo proporciona un método detallado de imágenes neuronales en cortes cerebrales utilizando un método de limpieza de tejidos, ScaleSF. El protocolo incluye la preparación del tejido cerebral, la clarificación del tejido, el manejo de rodajas despejadas y la microscopía de escaneo láser confocal de las estructuras neuronales desde los niveles mesoscópicos hasta los microscópicos.

Un método de limpieza de tejidos para imágenes neuronales de escalas mesoscópicas a microscópicas

Los esferoides tumorales se utilizan cada vez más para evaluar las interacciones entre células tumorales y microambientes y la respuesta a la terapia. El presente protocolo describe un método robusto pero simple para imágenes de semi-alto rendimiento de esferoides tumorales 3D utilizando una limpieza óptica rápida.

Limpieza óptica rápida para el análisis de semi-alto rendimiento de esferoides tumorales

El presente protocolo proporciona un procedimiento paso a paso para la limpieza óptica rápida y simultánea, el marcaje multirredondo y la reconstrucción volumétrica en 3D de decenas de secciones cerebrales humanas postmortem mediante la combinación de la técnica de transformación tisular corta (S WITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-tiodiethanol [TDE]) con imágenes de microscopía de fluorescencia de lámina de luz en un protocolo rutinario de alto rendimiento.

Aclarado óptico y etiquetado para microscopía de fluorescencia de lámina de luz en imágenes cerebrales humanas a gran escala

Este protocolo combina el aclaramiento óptico y el inmunomarcaje para obtener imágenes confocales de volumen completo de organoides de retina de montaje completo. Preserva la estructura 3D, lo que permite una visualización detallada de las vías neuronales clave, mejorando el estudio de la maduración de la retina, la organización espacial y sus posibles aplicaciones en el modelado de enfermedades y la medicina personalizada.

Visualización de organoides retinianos de montaje completo con resolución celular

Las técnicas de aclaramiento óptico, como las soluciones de moléculas absorbentes, reducen temporalmente la dispersión de la luz para mejorar la obtención de imágenes biológicas y ofrecen estrategias de imagen in vivo biocompatibles y reversibles para órganos profundamente integrados. Este protocolo presenta procedimientos experimentales detallados, así como procesamiento avanzado de imágenes para lograr imágenes dinámicas de alta calidad para la dinámica en tiempo real en animales vivos.

Aclaramiento óptico transitorio mediante moléculas absorbentes para la obtención de imágenes ex vivo e in vivo

Aprende los métodos psPACT y mPACT para aclarar rápidamente tejido completo del SNC en roedores sin daño electroforético. Estas técnicas facilitan el análisis microscópico de vasculatura cerebral en modelos de enfermedades neurodegenerativas.

Nuevo pasivo claro los métodos para la producción rápida de transparencia óptica en todo el tejido del SNC

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