Chips de microfluídica para dispersión ligera dinámica In Situ mediante difracción de rayos x de cristal y In Situ para la cristalografía Serial

El objetivo general de este procedimiento es fabricar y operar un dispositivo microfluídico para la cristalización de proteínas, la recopilación de datos de difracción de rayos X a temperatura ambiente. La principal ventaja de esta técnica es que la cristalización en el interior del chip minimiza la alteración mecánica de los cristales de proteína. Estos chips transparentes de rayos X son fáciles de producir, se pueden montar directamente en los goniómetros de la mayoría de las líneas de haz de sincrotrón y hacen un uso eficiente de los cristales disponibles al recopilar datos de difracción de rayos X.

Primero, coloque un molde maestro del diseño del chip de rayos X en una placa de Petri de 10 centímetros forrada con papel de aluminio. Mezcle unos 30 gramos de base y agente de curado de PDMS en una proporción de 10 a uno, y vierta el PDMS en el maestro hasta una altura de cuatro milímetros. Desgasifique el PDMS en un desecador de vacío durante cinco minutos y sople aire para eliminar las burbujas de aire restantes en la superficie del PDMS.

Cura el PDMS en un horno a 70 grados centígrados durante una hora. Luego, pele suavemente el molde PDMS curado del maestro. Use un bisturí para cortar el exceso de PDMS.

Antes de la fabricación del chip de rayos X, asegúrese de que el espacio de trabajo esté dispuesto para permitir un fácil acceso a todos los equipos y componentes necesarios durante la fundición de moldes epoxi. Para comenzar la fabricación de chips, diluya los precursores de una resina epoxi de dos componentes con etanol hasta una concentración de masa de etanol final del 40% en peso. Con un mezclador de vórtice, mezcle la resina epoxi y el etanol.

Desgasifique el molde de PDMS en un desecador al vacío durante 30 minutos para garantizar que el PDMS pueda absorber posteriormente pequeñas burbujas de aire de la resina epoxi. Corta un trozo de papel de poliimida de 7,5 micras de grosor de 70 milímetros por 70 milímetros y envuelve el papel de aluminio alrededor de un portaobjetos de vidrio de 75 milímetros por 50 milímetros. Pega los bordes del papel de aluminio a la parte posterior del portaobjetos para formar una superficie plana y rígida de poliimida.

Trate la lámina de poliimida con plasma de oxígeno durante 20 segundos. A continuación, incubar la lámina en una solución acuosa del 1% en volumen de APTS o GPTS durante cinco minutos a 20 grados centígrados. Durante la silanización, mezcle bien las soluciones precursoras de resina epoxi con una espátula pequeña.

Transfiera el molde de PDMS desgasificado del desecador al vacío a una superficie plana. Seque la lámina de poliimida silanizada con aire a presión o gas nitrógeno. Aplique rápidamente una gota de la mezcla de resina a cada microestructura del molde.

Coloque la lámina de poliimida con respaldo deslizante boca abajo sobre la resina epoxi y presione firmemente hacia abajo el portaobjetos. Cubra el conjunto con una lámina de plástico y una lámina de metal. Coloque pesos sobre la lámina de metal para aplicar una presión de hasta 1,4 newtons por centímetro cuadrado al conjunto.

Después de 15 minutos, separe suavemente el portaobjetos de vidrio de la lámina de poliimida con patrón epoxi y limpie la lámina de poliimida hasta que se seque. Vuelva a colocar el papel de aluminio, la lámina de metal y las pesas en la parte superior. Deje que el epoxi se cure a temperatura ambiente durante una hora.

Luego, retire las pesas, la lámina de metal y el papel de plástico. Retire suavemente la lámina de poliimida estampada del molde PDMS. Plasma trate la lámina estampada durante 20 segundos y silanice la lámina estampada con APTS o GPTS, como se describió anteriormente.

Silanice una lámina de poliimida prístina con la otra solución de silano en las mismas condiciones. Seque ambas láminas con aire presurizado. Luego, aplique una gota de agua desionizada sobre una superficie limpia, seca y plana.

Corte estructuras de virutas individuales en papel de poliamida y coloque el lado epoxi de la lámina de poliimida estampada hacia arriba sobre la gota de agua, y alise con cuidado el papel de aluminio hasta que esté completamente plano. Coloque la segunda lámina de poliimida sobre la lámina estampada con la silanizada hacia abajo. Alise suavemente a mano la segunda lámina de esquina a esquina opuesta para expulsar las burbujas de aire y unir las láminas de poliimida.

Para comenzar a fabricar los puertos de acceso, corte de una losa de PDMS curada de cuatro milímetros un bloque de tamaño suficiente para cubrir todos los puertos en el chip de rayos X de poliimida sin cubrir el compartimiento de cristalización. Tratamiento con plasma, silanización y secado del chip de poliimida y el bloque PDMS. Presione el bloque tratado en el chip sobre los puertos.

Cubra el chip con una lámina de plástico, un portaobjetos de vidrio limpio y una lámina de metal. Aplique 1,4 newtons por centímetro cuadrado de presión durante una hora. A continuación, utilice un punzón de biopsia de 0,75 milímetros para perforar los orificios de entrada y salida marcados en el diseño del chip.

Selle la parte posterior del chip con cinta aislante eléctrica de película de poliimida. A continuación, diluya una solución madre de material de recubrimiento de fluoropolímero transparente al 9 % en peso hasta el 0,45 % en peso con un disolvente fluorado. Conecte una aguja de calibre 27 de 5/8 de pulgada a la jeringa.

Coloque el tubo de politetrafluoroetileno sobre el extremo de la aguja. Cargue la solución de fluoropolímero en una jeringa Luer lock de un mililitro. Conecte el otro extremo del tubo a la salida del chip de rayos X.

Inyecte la solución de fluoropolímero en el chip hasta que se llenen todos los canales y elimine el exceso de solución de fluoropolímero utilizando una jeringa llena de aire. Coloque el chip relleno con el lado plano hacia abajo en una placa calefactora a 190 grados centígrados. Caliente el chip durante cinco minutos para evaporar el solvente, recubriendo así los canales con el fluoropolímero.

Antes del procedimiento de cristalización, filtre la solución proteica elegida con un filtro de 0,2 micras. Centrifugar la solución durante 15 minutos a 16, 100 veces g y 20 grados Celsius, y recuperar el sobrenadante para los experimentos de cristalización. Para comenzar el procedimiento de cristalización, combine volúmenes iguales de una solución de proteína y su precipitante.

Extrae unos 20 microlitros de esta mezcla en una jeringa. Use una aguja de calibre 27 de 5/8 de pulgada y un tubo de PTFE para conectar la jeringa a la entrada del chip de rayos X. Conecte una jeringa de aceite fluorado a la salida de la misma manera.

Mientras monitorea el chip bajo un microscopio, llene la solución de cristalización a través de la entrada en el chip con el diseño paralelo. Inyecte suficiente aceite fluorado para separar los compartimentos de cristalización en el chip. Luego, bloquee los puertos de entrada y salida con clips u otros enchufes estrechos.

Almacene el chip en las condiciones de cristalización adecuadas. La formación de cristales ahora se puede observar bajo un microscopio o mediante mediciones dinámicas de dispersión de luz. Cuando esté listo para la recopilación de datos, use cinta adhesiva de doble cara para fijar el chip de rayos X a un adaptador impreso en 3D para el goniómetro de placa.

Monte el adaptador de chip en el goniómetro de placa en la línea de luz del sincrotrón. Recopile y analice los datos de difracción. Se utilizó microscopía de campo claro para cuantificar la tasa de evaporación del agua de las cámaras de cristalización del chip de lámina de poliimida.

La dispersión dinámica de la luz podría detectar la nucleación inicial de cristales de taumatina en un chip PDMS en un portaobjetos de vidrio con geometría equivalente, lo que permitiría optimizar las condiciones de cristalización. Se recogieron 10 patrones de difracción de cada uno de los 83 cristales de taumatina cultivados en un chip de poliimida con una rotación de un grado durante cada fotograma. El conjunto de datos se dividió en cinco subconjuntos de datos por fotograma, y luego se evaluó la disminución de la intensidad de la potencia de difracción normalizada a lo largo del tiempo.

Para el cuarto conjunto de datos, la potencia de difracción había disminuido a menos del 50%Los valores del factor R de medición de los subconjuntos de datos aumentaron con el tiempo, lo que indica que los cristales sufrieron daños por radiación durante la recopilación de datos. Esto se atribuyó a los radicales libres generados durante la exposición a los rayos X, degradando los cristales vecinos en el mismo compartimento. Los cristales bipiramidales de taumatina tenían una amplia distribución de orientaciones en el chip de rayos X.

Los cristales ortorrómbicos de glucosa isomerasa también mostraron una amplia distribución de orientaciones cuando se cultivaron en un chip de poliimida. Sin embargo, los cristales de tiorredoxina tenían predominantemente orientaciones en los planos xy, xz e yz, posiblemente debido a su forma alargada. En general, estos chips son muy robustos y tienen un fondo de rayos X bajo.

Esto hace que este método de fabricación sea adecuado para otras técnicas de obtención de imágenes de rayos X, como la dispersión de rayos X de ángulo pequeño. Este procedimiento se puede adaptar fácilmente a sus necesidades experimentales. Por ejemplo, el diseño del chip se puede modificar ajustando las dimensiones de los compartimentos individuales o el número total de compartimentos por chip.

Un enfoque particular para nosotros fue diseñar un flujo de trabajo que no requiriera equipos costosos, como herramientas especializadas o bombas microfluídicas. Después de ver este video y leer el manuscrito, debería tener una buena comprensión de cómo cristalizar en chip, monitorear el proceso de cristalización y registrar y analizar datos de difracción utilizando el enfoque de chip. Una vez dominada, esta técnica permite la fabricación por lotes de chips microfluídicos a partir de un maestro PDMS en unas tres horas sin necesidad de una sala limpia dedicada.