Endorreduplicación medición por citometría de flujo de protoplastos aislados de tubérculos

El objetivo general de este experimento es evaluar los niveles de endorreduplicación dentro de los tubérculos de papa. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la morfología de los tubérculos de papa, como la etapa de desarrollo en la que los tejidos de los tubérculos experimentan endorreduplicación. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona resultados mucho más claros en comparación con las preparaciones típicas de citometría de flujo.

La demostración del procedimiento será Parker Laimbeer. Un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Después de preparar soluciones y tampones de acuerdo con el protocolo de texto, esterilice la superficie de los tubérculos de papa sumergiéndolos en etanol al 71% durante al menos cinco minutos.

Retire los materiales vegetales del etanol y déjelos secar al aire. Prepare y etiquete tubos cónicos estériles de 50 mililitros para cada muestra y alícuotas de 15 mililitros de solución de incubación de plasmólisis esterilizada con filtro o PIS, en cada uno. El uso de un bisturí esterilizado o un corcho muestra aproximadamente un centímetro cúbico del deseo de esterilizar el tejido.

Use el bisturí esterilizador para picar el tejido en trozos gruesos de aproximadamente tres milímetros cúbicos. Y transfiera el tejido a un tubo cónico que contenga PIS. A continuación, incubar el tejido a cuatro grados centígrados durante la noche.

Para generar protoplastos de patata, comience preparando y filtrando una cantidad adecuada de solución enzimática o ES con manitol 0,71 molar, cloruro de calcio tres milimolares y fosfato monopotásico milimolar. Un milimolar de cloruro de magnesio, 4% de celulasa Onozuka R-10, 0,8% de macerozima R-10, 1% de hemicelulasa y 10 milimolares de tampón MES, pH 5,8. Con una pipeta serológica, aspire el PIS de las muestras de los tubos.

Agregue 10 mililitros de ES a cada muestra e invierta los tubos dos o tres veces. A continuación, incubar las muestras a 29% Celsius y 180 RPM durante la noche. El tercer día, para cosechar y lavar los protoplastos, retire las muestras del agitador y déjelas reposar durante aproximadamente 10 minutos.

Con una pipeta serológica, aspire la mayor cantidad posible de la solución CE, teniendo cuidado de evitar el tejido digerido. A continuación, con una micropipeta y mientras sujeta el tubo en ángulo, retire de nuevo cualquier resto de solución CE, evitando el tejido digerido. Es fundamental eliminar la mayor cantidad posible de la solución de lavado de protoplast para evitar daños en los núcleos.

Sostener el tubo en ángulo puede ayudar con la extracción de la solución mientras se dejan los protoplastos. Agregue 15 mililitros de PWS a cada muestra. E invierta el tubo suavemente dos o tres veces.

Deje que los protoplastos se asienten durante 10 minutos. A continuación, utilice una pipeta serológica para extraer el PWS. Y una micro pipeta para eliminar cualquier líquido restante.

Mientras mantiene las muestras en hielo, agregue 1,5 mililitros de FCB helado a cada tubo. Agite o agite brevemente cada muestra para romper el tejido agregado. Es importante romper los grupos de tejido de tubérculos para que el FCB pueda penetrar completamente en las células y liberar los núcleos.

Si se va a agregar un control, a partir de este paso, use una cuchilla de afeitar para picar finamente una hoja pequeña en 1,5 mililitros de FCB helado. Las muestras de control deben ser del mismo tipo que las muestras experimentales, preferiblemente del mismo genotipo. Inserte un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros con la punta cortada y una malla metálica de 106 micrómetros derretida hasta el fondo en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros.

A continuación, pase un mililitro de la suspensión de tejido FCB a través del filtro. Agregue 250 microlitros de la solución de ARN a cada muestra. A continuación, invierta los tubos e incubelos durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Agregue 125 microlitros de yoduro de propidio o solución de PI previamente preparada a cada muestra. Invierta e incube los tubos en hielo durante 30 minutos. Utilice las muestras lo antes posible y en dos horas evite la degradación.

Cree dos diagramas de puntos utilizando la escala logarítmica de dispersión directa frente a dispersión lateral y PI frente a dispersión lateral. Cree también un histograma con PI en el eje x. Se requiere una escala logarítmica para garantizar que todos los eventos estén dentro de la escala, ya que los núcleos pueden diferir enormemente en fluorescencia.

Cargue un tubo de una muestra de control conocida, como un tejido foliar in vitro, a partir de un genotipo de muestra. Y ajuste el voltaje para que todos los eventos estén a escala. Tome nota del canal del pico 2C en la muestra de control.

Los picos 2C de las muestras experimentales deben caer en el mismo lugar. Cargue una muestra de tubérculo experimental y asegúrese nuevamente de que todos los eventos estén a escala. Si se requieren ajustes, repita el ajuste de voltaje de la muestra de control para identificar el canal de picos 2C.

Cierre manualmente los núcleos de protoplasto utilizando el diagrama de dispersión lateral frente a PI. A continuación, configure el histograma PI para que solo muestre la región de los núcleos de protoplasto controlada. Recopile el número deseado de eventos de cada muestra.

Con frecuencia, los investigadores utilizan 10.000 eventos cerrados para la citometría de flujo. Sin embargo, aquí se utilizan eventos 2000 para muestras de protoplasto de tubérculos para acomodar más muestras y muestras con bajas concentraciones. La generación de protoplastos es necesaria para lograr resultados de citometría de flujo repetibles a partir de tubérculos de papa.

La morfología general de la cual se muestra aquí. La separación entre la médula y el parénquima perimedular se ilustra con líneas negras. El anillo vascular, que separa el parénquima de la corteza, se denota con una flecha negra.

Los protoplastos aislados deben ser esféricos y simétricos con la membrana plasmática intacta. Nótese la diferencia de tamaño entre los protoplastos de la hoja y del tubérculo, así como las diferencias de tamaño dentro de un tejido, lo que puede indicar diferentes niveles de endorreduplicación. Esta figura muestra la variación en los resultados que se pueden encontrar tanto en los diagramas de dispersión de citometría de flujo como en los histogramas.

Los núcleos intactos muestran una separación limpia entre los picos para cuantificar la abundancia relativa de células, mientras que las muestras integradas de los picos muestran bases desplazadas, anchas y superpuestas. En los diagramas de dispersión correspondientes, las cajas negras indican la activación de eventos nucleares para los histogramas y la agrupación de eventos se refleja en el ancho de los picos del histograma. Este experimento que analiza los niveles de endorreduplicación o EI confirma los resultados anteriores de que el tejido de la médula exhibe una EI más alta que el tejido de la corteza.

Sorprendentemente, el perfil del tejido del parénquima era similar al de la corteza y también era significativamente diferente del tejido de la médula. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener la esterilidad de las muestras durante las dos primeras incubaciones, así como mantener las muestras en hielo tanto como sea posible después de que se hayan lisado los protoplastos. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la manipulación genética, para responder a preguntas adicionales, como qué genes influyen en los niveles de endorreduplicación de los tubérculos.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo extraer protoplastos de los tubérculos de papa y prepararlos para la citometría de flujo para investigar sus niveles de endorreduplicación. No olvide que trabajar con yoduro de propidio puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el EPP adecuado al realizar este procedimiento.