Name: Análisis cuantitativo de la complejidad de la arborización dendrítica Neuronal en Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Aprende a analizar cuantitativamente la complejidad de la arborización dendrítica neuronal en Drosophila. Este protocolo evalúa el impacto del gen SOX5 en el desarrollo neuronal y su relación con enfermedades neurodegenerativas.

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Nos gustaría agradecer a William A. Eimer por proyección de imagen de asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por fondo el cura de Alzheimer [R.E.T], el Instituto Nacional de salud [R01AG014713 y R01MH60009 en la R.E.T; R03AR063271 y R15EB019704 a A.L. y la Fundación Nacional de ciencia [NSF1455613 a A.L.].

1. experimental Preparación
<ol><li>Preparar los reactivos siguientes: fosfato de Dulbecco tamponada con solución salina (PBS); Triton X-100; 0.2% SAFT (PBS + 0,2% Tritón X-100); 32% paraformaldehido (PFA), diluido en 4% antes de su uso; base de elastómero de silicona y agente de curado; medio de montaje Antifade (por ejemplo, prolongar la oro); y esmalte de uñas.</li>
	<li>Preparar los siguientes equipos: microscopio de disección, dos afiladas pinzas y un par de tijeras para microdisección, un número de pernos para microdisección, una placa de Petri para la fabricación de la placa de disección, portaobjetos y cubreobjetos, microscopio confocal y un computadora con software ImageJ de Fiji.</li>
</ol>2. larvas colección
<ol><li>Compañero de UAS-Sox102F-ARNi moscas con UAS-GFP, ppk-GAL4 o moscas de tipo salvaje de1118 W, respectivamente. Cultura vuela en condiciones estándar a 25 ° C.</li>
	<li>En ~ 5-6 días, recoger las larvas de tercer estadio de UAS-Sox102F-RNAi / ppk-GAL4, UAS-GFP o UAS-GFP y ppk-GAL4 / + control cuidadosamente con pinzas para la disección.</li>
</ol>3. disección de larvas
Nota: Todos los procedimientos en esta sección son operados bajo un microscopio de microdisección. La magnificación depende de los investigadores. Trate de ajustar a la vista de vista óptima. Se recomiendan ~ 4-6 aumentos.
<ol><li>Coloque una larva en un disección plato de elastómero de silicona base y un cultivo de tejidos de Petri.</li>
	<li>Fijar el gancho de la boca de la larva para permitir que el lado dorsal hacia, y luego prender la cola de la larva. Coloque el lado dorsal en el medio tanto como sea posible para exponer la línea media, que será el marcador de abren-para arriba.</li>
	<li>Añadir 200 μL de PBS a la larva para mantener la humedad del cuerpo.</li>
	<li>Hacer un corte con tijeras a lo largo de la línea media dorsal entre el dos traquear, de caudal a rostral. Hacer un pequeño corte en cada una de las cuatro esquinas del cuerpo de la larva.</li>
	<li>Coloque un alfiler en cada una de las cuatro esquinas del cuerpo, por lo que el cuerpo quede plano.</li>
	<li>Fijar a la pared del cuerpo de la larva en el 4% PFA 25 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavado en SAFT 5 minutos repetir dos veces más.</li>
	<li>Quite los pernos del tejido. Luego transferir el tejido en un portaobjetos de vidrio, tapa con medio de montaje antifade y montar con un cubreobjetos. Secar durante 1 hora al aire y sellar los bordes con esmalte de uñas.</li>
</ol>4. procesamiento de imágenes
Nota: La imágenes fueron tomadas con un sistema de microscopio confocal invertido. El usuario puede fotografiar la muestra utilizando un objetivo de 20 X (recomendado).
<ol><li>Capturar imágenes de la serie Z. Abra el cuadro de diálogo "Capturar serie Z" en el software del microscopio confocal. Determinar el rango para la captura de las imágenes de la serie Z.<ol>
<li>Haga clic en el botón "Arriba y abajo". Determinar la parte superior e inferior posición y los valores para la entrada "fondo:" y "Top:" cajas. Establecer el "paso" en el cuadro de diálogo "Capturar serie Z" como 0,5 μm. Haga clic en el botón "Ejecutar ahora" para adquirir las imágenes de la serie Z.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Guardar las imágenes obtenidas como ficheros *.tiff o *.nd2.</li>
	<li>Almacenar las diapositivas en un soporte oscuro a 4 ° C después de la proyección de imagen.</li>
</ol>5. dendrita evaluación
Nota: La proteína GFP fue co-overexpressed en UAS-GFP y ppk-GAL4 vuela en las neuronas de da para análisis de imagen de la fluorescencia de GFP. La longitud, ramificación y estructura de las neuronas da en las larvas de tercer estadio fueron cuantificados. Parámetros de análisis incluyen la longitud de las dendritas (μm), superficie (μm2), número total de ramas y la estructura de ramificación (%). La figura 1 muestra los parámetros de análisis en detalle.
<ol><li>
Longitud de las dendritas Nota: La longitud de las dendritas es la suma de todas las dendritas en plugin del rastreador.<ol>
<li>Configurar y ejecutar software de Fiji ImageJ (https://fiji.sc/)20 . Luego dividir imágenes en canales separados, si hay varios canales de imágenes. Nota: La imagen en este protocolo solamente tiene un canal de GFP.</li>
		<li>Ejecutar "imagen | Pilas | Proyecto Z"para obtener una proyección de Z; aparecerá una nueva ventana con el nombre de 'Proyección de Z.' Haga clic en "máxima intensidad" para el tipo de proyección y organizar números entre rebanada de inicio y parada de slice dependiendo en las preferencias individuales. Haga clic en "Aceptar". Una imagen de proyección Z aparece presentando claramente la proyección de la dendrita.</li>
		<li>Seguimiento de las neuritas.<ol>
<li>Seleccione "Plugins | Segmentación | Simple Neurites Tracer"en la ventana a las dendritas. Encuentra el soma de la neurona y haga clic en un punto en una dendrita desde el cuerpo celular y otro punto en la punta de esta dendrita. Nota: El programa Conecte los dos puntos con una línea azul.</li>
			<li>Pulse "Y" en la ventana del plugin si el camino está claro; el camino de la dendrita se remonta hasta los extremos de la ruta seleccionada en las imágenes visibles. Haga clic en "ruta completa" en la ventana del plugin mismo; se completa el segmento (figura 2). Nota: Algunas dendritas terminaron lejos de los puntos de partida, en el que el camino se dividió en segmentos más pequeños. Los segmentos se combinaron para proporcionar una ruta completa para el palpador.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Después de un camino, regresar a un nuevo punto donde las ramas son. El nuevo camino puede construirse la caja de la ventana de "Todos los caminos" se muestran los valores de longitud de todos los caminos (figura 3). Guarde el archivo de seguimiento y continuar con los rastros sin terminar como se muestra en la figura 2.</li>
		<li>Exportar los datos de longitud de la dendrita pulsando, "archivo | Exportar como *.cvs"en la ventana de 'Plugin'. Luego suma todas las longitudes de trayectoria y exportar los datos a un software de hoja de cálculo/análisis de datos. (Figura 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Superficie de las neuronas de da
	<ol>
<li>Seleccione la herramienta de dibujo a mano alzada en la ventana de 'Fiji ImageJ'. Trazar el camino y luego conecte los extremos. En el menú de 'Analizar', seleccione "Set medidas | Área". Haga clic en "medida" en el menú de 'Analizar'. El resultado aparece en un nuevo cuadro con el valor para el área seleccionada (figura 4). Copiar el software de análisis de datos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Total número de ramas y la estructura de ramificación de las neuronas de da
	<ol>
<li>Calcular el número total de ramas mediante la apertura de "Análisis" y luego "Render | Analizar rutas Skeletonized"en la ventana del plugin de seguimiento (figura 5). Nota: La estructura del eje es la suma de los niveles de las ramas. La ruta fue definida entre el cuerpo celular y las puntas de la dendrita, y una ruta de acceso puede incluir múltiples ramas, como la herramienta principal es las dendritas desde el cuerpo celular de la neurona. Los cenadores del secundarios son ramas de la primaria y así sucesivamente con los cenadores terciario, cuaternario y quinario. La estructura de la dendrita ramificación se separa según los niveles de las ramas. Por ejemplo, el % primario es el número de ramas divididas por el número total de ramificación y así sucesivamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>MacNeil, M. A., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+diversity+among+amacrine+cells%3A+implications+for+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Extreme diversity among amacrine cells: implications for function.</a> Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).</li>
<li>Losonczy, A., Makara, J. K., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+dendritic+plasticity+and+input+feature+storage+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized dendritic plasticity and input feature storage in neurons.</a> Nature. 452 (7186), 436-441 (2008).</li>
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<li>Jaworski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+microtubules+regulate+dendritic+spine+morphology+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity.</a> Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).</li>
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<li>Baloyannis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+pathology+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Dendritic pathology in Alzheimer's disease.</a> J Neurol Sci. 283 (1-2), 153-157 (2009).</li>
<li>Masliah, E., Terry, R. D., Alford, M., DeTeresa, R., Hansen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+and+subcortical+patterns+of+synaptophysinlike+immunoreactivity+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cortical and subcortical patterns of synaptophysinlike immunoreactivity in Alzheimer's disease.</a> Am J Pathol. 138 (1), 235-246 (1991).</li>
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<li>Jinushi-Nakao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knot%2FCollier+and+cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).</li>
<li>Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+multidendritic+neuron+differentiation+in+Drosophila%3A+the+role+of+Collier%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier.</a> Dev Biol. 315 (1), 232-242 (2008).</li>
<li>Copf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+gene+dosage+in+controlling+dendritic+arbor+formation+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Importance of gene dosage in controlling dendritic arbor formation during development.</a> Eur J Neurosci. 42 (6), 2234-2249 (2015).</li>
<li>Rosso, S. B., Inestrosa, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNT+signaling+in+neuronal+maturation+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">WNT signaling in neuronal maturation and synaptogenesis.</a> Front Cell Neurosci. 7, 103(2013).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las dendritas que inervan la epidermis son las regiones de entrada de las neuronas y sus morfologías determinan cómo la información es recibida y procesada por neuronas individuales. Morfología de dendrita de desarrollo refleja la modulación genética de la organización de la dendrita. La Drosophila larvas da neurona del sistema nervioso periférico es un importante modelo para el estudio de desarrollo de la dendrita debido: 1) la similitud funcional con mamíferos11,<sup class="x...

Las dendritas, que son las proyecciones ramificadas de la neurona, cubren el campo que abarca entradas sensoriales y sinápticas de la neurona de otras neuronas1,2. Las dendritas son un componente importante de la formación de sinapsis y juegan un papel crítico en la integración de entradas sinápticas, así como propagar el estímulo electroquímico en una neurona. Arborización dendrítica (da) es un proceso por el cual las neuronas forman nuevos árboles dendríticos y ramas para crear nuevas sinapsis. El desarrollo y la morfología de la da, como rama densidad y patrones de agrupación, resultan de procesos biológicos de múltiples pasos y están altamente correlacionados con la función neuronal. El objetivo de este protocolo es proporcionar un método para el análisis cuantitativo de la complejidad de arborización neuronal dendritric en Drosophila.
La complejidad de las dendritas determina los tipos sinápticos, conectividad y entradas de las neuronas de la pareja. Patrones de ramificación y la densidad de las dendritas están involucrados en el procesamiento de las señales que convergen en el campo dendrítico3,4. Las dendritas tienen la flexibilidad para el ajuste en el desarrollo. Por ejemplo, señalización sináptica tiene un efecto en la organización de la dendrita en las neuronas somatosensoriales durante la fase de desarrollo y en el sistema nervioso maduro5. El establecimiento de la conectividad neuronal se basa en la morfogénesis y maduración de las dendritas. Malformación de las dendritas se asocia con deterioro de la función neuronal. Los estudios han demostrado que la anormalidad de la morfogénesis de la neurona da podría contribuir a las etiologías múltiples enfermedades neurodegenerative, incluyendo enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Huntington (EH), y enfermedad de Lou Gehrig / Esclerosis lateral amiotrófica (ELA)6,7,8. Alteraciones sinápticas aparecen en la etapa temprana de la EA, en concierto con la decadencia y la debilitación de la neurona función7,8. Sin embargo, los detalles de cómo patología dendrita contribuye a la patogénesis de estas enfermedades neurodegenerativas sigue siendo elusiva.
El desarrollo de las dendritas está regulado por los genes que codifican una compleja red de reguladores, como la familia Wnt de proteínas9,10, factores de transcripción y ligandos de receptores de superficie celular11,12 . Drosophila da las neuronas consisten en cuatro clases (clase I, II III, IV), de que clase IV da neuronas tienen los patrones de ramificación más complejos y han sido utilizadas como un potente sistema experimental para la mejor comprensión morfogénesis13, 14. Durante la morfogénesis temprana, sobreexpresión o ARNi silenciamiento de genes en neuronas de clase IV da como resultado cambios en los patrones de ramificación y poda de dendrita13. Es importante desarrollar un método práctico para el análisis cuantitativo de la arborización dendrítica neuronal.
Previamente hemos demostrado que silenciar el ortólogo de Drosophila de SOX5, Sox102F, condujo a más cortas dendritas de las neuronas de da y menor complejidad en clase IV da neuronas15. Aquí, presentamos el procedimiento de análisis cuantitativo para la complejidad de la arborización dendrítica neuronal (NDAC) en Drosophila. Este protocolo, adaptado de la metodología anterior descrita, proporciona un método breve para analizar el desarrollo de las neuronas sensoriales da. Ilustra la imagen robusta de etiquetado y de las neuronas da en el tercer estadio larval de cuerpo de pared16,17,18,19. Es un protocolo de valioso para los investigadores que deseen investigar la NDAC y diferencias del desarrollo en vivo.

<table><tbody><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Gibco Life Sciences</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>15714-S</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 base de elastómero de silicona y agente de curado</td><td>Dow Corning Corportation</td><td>3097366-0516; 3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte de uñas&nbsp;</td><td>CVS</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti-E</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Falcon</td><td></td> Pinzas 353001 <td></td></tr><tr><td></td><td>Dumont</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras&nbsp;</td><td>Roboz Instrumento Quirúrgico Co</td><td>RS-5611</td><td></td></tr><tr><td>Alfileres de insectos&nbsp;</td><td>Roboz Surgical Instrument Co</td><td>RS-6082-25</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio y cubreobjetos</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-188-52</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis cuantitativo de la complejidad de la arborización dendrítica neuronal en drosophila

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Las dendritas son las proyecciones ramificadas de la neurona, y morfología dendrítica refleja organización sináptica durante el desarrollo del sistema nervioso. Arborización dendrítica neuronal (da) de larvas de Drosophila es un modelo ideal para el estudio de morfogénesis de las dendritas neuronales y funciones de los genes en el desarrollo del sistema nervioso. Hay cuatro clases de neuronas da. Clase IV es el más complejo con un patrón de ramificación que cubre casi toda la zona de la pared del cuerpo larval. Anteriormente hemos caracterizado el efecto de silenciar el ortólogo de Drosophila de SOX5 en clase de complejidad de la arborización dendrítica neuronal del IV (NDAC) utilizando cuatro parámetros: la longitud de las dendritas, la superficie de la cobertura de la dendrita, el número total de ramas y la estructura de ramificación. Este protocolo presenta el flujo de trabajo de análisis cuantitativo NDAC, consisten en larvas disección, microscopia confocal y procedimientos de análisis de imagen usando el software ImageJ. Más penetración en el desarrollo neuronal de da y sus mecanismos subyacentes mejorará la comprensión de la función neuronal y proporcionar pistas sobre las causas fundamentales de neurológico y trastornos del neurodesarrollo.

Las dendritas de las neuronas de da fueron etiquetadas por co-overexpressing GFP (GFP UAS; ppk-GAL4) en el soma neural da y cenadores dendríticos para análisis de imagen de la fluorescencia de GFP. La morfología de las dendritas de la neurona da era reflejada por un microscopio confocal invertido (figura 2).
Las dendritas de las neuronas da se trazaron utilizando el software ImageJ de Fiji. El archi...

Este protocolo se centra en el análisis cuantitativo de la complejidad de la arborización dendrítica neuronal (NDAC) en Drosophila, que puede ser utilizado para estudios de morfogénesis dendríticas.

Análisis cuantitativo de la complejidad de la arborización dendrítica Neuronal en Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

El objetivo general de este procedimiento es observar el impacto del gen SOX5 en la complejidad de las neuronas de arborización dendrítica durante el desarrollo neuronal en Drosophila. Este método puede ayudar a estudiar la morfogénesis de las neurodendritas, y la función génica en el desarrollo del sistema nervioso, para entender mejor los genes de la enfermedad neurodegenerativa. En última instancia, esta técnica proporciona un análisis cuantitativo de la complejidad de las dendritas, que se puede utilizar en muchos tipos diferentes de neuro-dendritas.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el mecanismo genético de la enfermedad neuro-degenerativa, porque la mutación tiene la clave para entender la función génica. Configuración de cruces de UAS-GFP;ppk-GAL4 con las moscas de tensión UAS-Sox102F-RNAi o controles W118. Cultivar las moscas en condiciones estándar a 25 grados centígrados.En unos cinco a seis días, utilice fórceps para recoger cuidadosamente las larvas de la tercera estrella para la disección. Coloque una larva en un plato de disección hecho de base de elastómero de silicio, y un plato petri de cultivo de tejido. A continuación, coloque el plato debajo del microscopio de disección.Ahora fija la cola de la larva para exponer la línea media. A continuación, fijar la boca de larva se engancha para que el lado dorsal de la larva está hacia arriba. Ahora agregue 200 microlitros de PBS al plato para sumergir la larva en solución.A continuación, cortar la cola y la boca de larva con pequeñas incisiones. Luego corta la larva a lo largo de la línea media dorsal y entre las dos tráqueas, pasando de caudal a rostral. A continuación, coloque un alfiler en cada una de las cuatro esquinas del cuerpo para que el cuerpo se acueste plana.Ahora fija la pared corporal de la larva en un cuatro por ciento de PFA durante 25 minutos a temperatura ambiente. Luego lave la larva con PBS tres veces durante cinco minutos por lavado. Después de los lavados, retire los pasadores y transfiera el tejido a un portaobjetos de vidrio.A continuación, sumerja el tejido en un medio de montaje antifada y móntelo con un resbalón de cubierta. Deje que el tejido montado se seque al aire durante una hora antes de sellar en el resbalón de la cubierta con esmalte de uñas. Almacene estos portaobjetos en la oscuridad a cuatro grados centígrados.Captura imágenes de la serie z con un microscopio confocal usando un objetivo 20X. En primer lugar, establezca el rango de los pasos z para incluir todas las neuronas DA en la pared del cuerpo de la larva, y establezca el tamaño del paso en medio micrómetro. A continuación, almacene las imágenes como archivos TIF o ND2 para su procesamiento.A continuación, evalúe el número y la morfología de las dendritas en las neuronas del DA. Comience con la evaluación de sus longitudes. En primer lugar, en Fiji ImageJ, divida las imágenes en canales separados si es necesario.Solo es necesario evaluar el canal GFP. A continuación, haga una proyección z. En la nueva ventana, seleccione intensidad máxima para el tipo de proyección y elija los sectores de inicio y detención.A continuación, haga clic en Aceptar para producir una imagen de proyección z con proyecciones claras de dendrita. Ahora trace las neuritas usando la herramienta plug-in. Primero, ve al soma de la neurona de interés y haz clic donde una dendrita emerge del cuerpo celular.A continuación, haga clic en la punta de esta dendrita. Si la línea azul que conecta los dos puntos recorre la longitud del neurito, presione Y para sí. A continuación, si esta línea se ajusta a la ruta completa del neurito, haga clic en ruta completa.Si la línea no se ajusta al trazado, haga clic en puntos más a lo largo de este neurito para doblar el trazado en varios segmentos de línea que se ajusten a la longitud del neurito. A continuación, haga clic en ruta completa y continúe marcando la ruta para el siguiente neurito. Después de completar todas las rutas de seguimiento, seleccione la opción Análisis, Medir rutas para exportar las rutas a un archivo CSV.Utilice estos datos para calcular y el valor medio de las longitudes de ruta para el análisis. A continuación, calcule el área superficial de la neurona. En primer lugar, seleccione la herramienta de dibujo a mano libre en la ventana De Fiji ImageJ.A continuación, conecte los puntos finales de la neurona de interés. A continuación, seleccione la opción Medir en la ventana Analizar. El resultado aparece en un nuevo cuadro con el valor del área seleccionada.Copie este valor en el software de análisis de datos. Por último, calcule el número total de ramas utilizando el complemento Analizar rutas esquelizadas. Las dendritas de las neuronas DA fueron etiquetadas por coexpresar la GFP en sus árboles de soma y dendrita para el análisis de imágenes de florescencia de GFP.La morfología de las dendritas fue imán usando un microscopio confocal invertido. Las dendritas de las neuronas del da y el aire común fueron rastreadas como se describe. El archivo se utilizó para estimar la longitud de la dendrita.El silenciamiento de Sox102F en las neuronas DA en la tercera larva instar condujo a una reducción significativa en el número total de dendritas con aproximadamente la mitad de la longitud de la rama y con una estructura más simple, mostrando sólo la mitad del número de ramas. Lógicamente, esto llevó a la reducción de la superficie del eje. Este protocolo proporciona un método rápido para evaluar el desarrollo de las neuronas sensoriales DA.Al intentar este procedimiento, asegúrese de tomar un gran número de imágenes de cada grupo de neuronas DA para obtener una buena cobertura. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el análisis de dendrita para responder preguntas adicionales sobre el desarrollo de dendrita. Desde su desarrollo, esta técnica ha ayudado a los investigadores en el campo de las neurociencias a hacer inferencias en enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer utilizando sistemas modelo.

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Investigación

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Neurociencia

Numerosos estudios recientes han identificado mutaciones en las proteínas sinápticas asociadas a patologías cerebrales. Primaria neuronas corticales cultivadas ofrecen una gran flexibilidad en el examen de los efectos de estas proteínas asociadas a la enfermedad en la morfología y motilidad de la espina dendrítica.

Análisis de la morfología espina dendrítica en las neuronas del SNC cultivadas

Arborización dendrítica de las neuronas sensoriales de...

Análisis morfológico de Drosophila Larvas dendritas neurona sensorial periférica y axones Con mosaicos genéticos

Fuente: Ting, C., et al., Análisis de la morfología dendrítica en columnas y capas. J. Vis. Exp. (2017)Este video demuestra el procedimiento de preparación de un cerebro de Drosophila, capturando pilas de imágenes horizontales y frontales de dendritas medulares marcadas con GFP bajo un microscopio confocal y creando una reconstrucción 3D para analizar su morfología en capas y columnas.

Análisis de la morfología dendrítica en capas y columnas de Drosophila Medulla

Describimos dos métodos para la visualización y cuantificación de la arborización dendrítica en el hipocampo de modelos de ratón: imágenes en tiempo real y de profundidad de campo extendida. Mientras que el primer método permite un sofisticado trazado topográfico y la cuantificación de la extensión de la ramificación, el segundo permite una visualización rápida del árbol dendrítico.

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Eliminación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tejido muscular de larvas Filetes para el análisis de inmunofluorescencia de las neuronas sensoriales y las células epidérmicas

Aquí mostramos cómo cuantificar el número y la distribución espacial de las zonas activas sinápticas en los fotorreceptores de Drosophila melanogaster, resaltada con un marcador molecular codificada genéticamente, y su modulación después de la exposición prolongada a la luz.

Analizando Synaptic Modulación de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Los fotorreceptores después de la exposición prolongada a la luz

Se crearon dos algoritmos de análisis de imagen, "Drosophila NMJ morfometría" y "Drosophila NMJ Bouton morfometría", para cuantificar automáticamente nueve características morfológicas de la unión neuromuscular Drosophila (NMJ).

Dos algoritmos para de alto rendimiento y multi-paramétrico Cuantificación de<em&gt; Drosophila</em&gt; La unión neuromuscular Morfología

Aquí, se muestra cómo analizar enrutamiento dendríticas de las neuronas medulares de Drosophila en columnas y capas. El flujo de trabajo incluye una visualización dual técnica de imagen para mejorar la calidad de imagen y herramientas computacionales para el seguimiento, el registro de los cenadores dendríticas en la matriz de la columna de referencia y para el análisis de las estructuras dendríticas en el espacio 3D.

Analizando dendríticas morfología en las columnas y capas

Aquí presentamos un protocolo de Golgi-Cox en detalle extenso. Este método fiable de tinción de tejidos permite una evaluación de alta calidad de la citoarquitectura en el hipocampo, ya lo largo de todo el cerebro, con un mínimo de resolución de problemas.

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Imágenes en vivo de lapso de tiempo y cuantificación de la dinámica de ramas dendríticas rápidas en el desarrollo de neuronas drosophila

Aprende a analizar cuantitativamente la complejidad de la arborización dendrítica neuronal en Drosophila. Este protocolo evalúa el impacto del gen SOX5 en el desarrollo neuronal y su relación con enfermedades neurodegenerativas.

Análisis cuantitativo de la complejidad de la arborización dendrítica Neuronal en Drosophila

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