Name: Adaptación de la hibridación de captura de las proteínas asociadas a cromatina para proteómica a células de mamíferos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Aprende a identificar proteínas que interactúan con ADN en loci específicos mediante hibridación de captura de cromatina en células de mamíferos. Este método no requiere manipulación genética ni anticuerpos previos.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de NIH P50HG004952 y R01GM109099 a MO.

1. captura de diseño de oligonucleótidos
<ol><li>
Diseño de un panel de oligonucleótidos que se utilizará durante la captura de la hibridación de la región de destino/s.
	<ol>
<li>Objetivo es diseñar oligonucleótidos de 4 – 8 por región de destino, pero como mínimo, diseño de oligonucleótidos por lo menos uno a cada extremo de la región de destino.</li>
		<li>Si la secuencia de destino es larga (> 500 pares de bases), diseño de los oligonucleótidos como propagación hacia fuera como sea posible para asegurar el enriquecimiento efectivo de la cromatina en toda la región de destino todo. Nota: Hemos observado una captura óptima con oligonucleótidos de 4 – 8. Aunque este proceso puede trabajar bien con oligonucleótidos más, no es infrecuente observar una disminución en los rendimientos de enriquecimiento cuando se utilizan muchos oligonucleótidos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diseño de oligonucleótidos con temperatura de fusión similar y asegúrese de que no formar horquillas fuertes ni tienen fuertes interacciones (tomando en cuenta que las hibridaciones se llevará a cabo en 42 ᵒC). Nota: Si la elución de un punto de apoyo es elegida (4.12.3), una secuencia base 8 externo adicional debe agregarse a los oligonucleótidos y requerirá oligonucleótidos complementarios 'release' a la hora de la elución17. Varias herramientas de software comercial se pueden utilizar para seleccionar y analizar los oligonucleótidos. 25 mers han demostrado buenos resultados, pero dependiendo del tamaño del genoma y la secuencia, captura de oligonucleótidos pueden contener en algún lugar entre 20 – 80 bases. Por lo general, captura de oligonucleótidos tienen una temperatura de fusión cerca de 62 ᵒC, pero que puede cambiar dependiendo de su longitud. Temperatura de fusión constante o longitud del oligonucleótido a lo largo de la mezcla de captura puede ayudar a evitar sesgos no deseados en enriquecimiento.</li>
	<li>Diseño de los oligonucleótidos de captura con una molécula de biotina (preferentemente separado por un separador de la secuencia de captura) en el extremo 3'.</li>
</ol>2. cultivo celular
<ol><li>
Crecen las células linfoblastoides humanas (por ejemplo GM12878 se muestra aquí) u otras líneas celulares en Medio RPMI 1640 suplementado con 2 mM L-glutamina, penicilina-estreptomicina de 1% y 5% de suero bovino fetal (FBS), ᵒC 37 y 5% CO2.
	<ol>
<li>Inicial de semillas congeladas en alícuotas (2 – 5 x 105 células) en un matraz T-25 con 6 mL de Medio RPMI 1640 en 2.1.</li>
		<li>Controle la densidad celular y viabilidad.<ol>
<li>Tomar a un representante alícuotas de células y tinción con un colorante apropiado como trypan blue.</li>
			<li>Medir la densidad de células usando un hemocitómetro o un contador de células automatizado.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Antes de que la célula llega a densidad de 1 x 106 células/mL, las células de la vuelta abajo a 100 x g por 5 min y transferir las células a un matraz T-75 con 25 mL de Medio RPMI 1640 en 2.1. Crecen las células hasta que la densidad celular acerca a 1 x 106 células/mL.</li>
		<li>Transferir las células a un matraz T-150 en 38 mL de Medio RPMI 1640 (2.1) y aumentan las células de dos días adicionales. Nota: Las células linfoblastoides crecen en suspensión. Lineamientos generales para el cultivo de células linfoblastoides recomiendan densidades de células a mantenerse entre 0.2 – 1 x 106 células/mL. Debido a la gran cantidad de material requerido en esta tecnología, el presente Protocolo es escrito deliberadamente para crecer las células a una densidad de células más allá de lo que comúnmente se utiliza. Protocolos de crecimiento de la célula pueden ser revisados y adaptados por el lector según los tipos de células para ser utilizado.</li>
		<li>Las células de la vuelta abajo a 100 x g por 5 min, resuspender las células en 10 mL de Medio RPMI 1640 (2.1) y vierta la suspensión en una botella de rodillo de2 850 cm que contenga 500 mL de medios de comunicación. Incubar las células en las mismas condiciones que antes pero en este momento empiezas a usar rotación constante (~0.5 rpm).</li>
		<li>Controlar el crecimiento celular y cambiar los medios de comunicación cuando sea necesario (normalmente cada 3-4 días). Que las células crecen hasta una densidad tan cerca como sea posible a 2 x 106 células/mL (1 x 109 células en total).</li>
		<li>Al llega a la cuenta de célula deseada, cosechar las células haciendo girar las células abajo a 100 x g durante 5 min y resuspender las células en 36 mL de Medio RPMI 1640 (2.1). Transferir la suspensión de células a un tubo cónico de 50 mL. Tomar pequeñas partes alícuotas para el conteo de células y la extracción de ADN.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reticulación mediante la adición de 1 mL de formaldehído al 37% para llegar a una concentración final de 1%. PRECAUCIÓN: El formaldehído es un carcinógeno y debe manejarse en una campana de humos.<ol>
<li>Incubar las células con rotación (~ 30-60 rpm) durante 10 min a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Calmar la reacción de reticulación por añadir 2 mL de una solución de glicina de 2,5 M, para una concentración final de 125 mM.</li>
		<li>Incubar las células con rotación (~ 30-60 rpm) por 5 min a TA. sedimenten las células por centrifugación a 100 x g durante 5 min y se lavan las células dos veces con PBS 1 x frío de hielo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Continuar siguiente paso o Resuspender el precipitado en 5 mL de tampón de lisis celular (5 mM Hepes, 85 mM KCl, 0,5% Igepal, inhibidores de la proteasa (PI)) y rápido-congele la suspensión gota a gota en nitrógeno líquido. Almacenar las muestras a-80 ᵒC. Nota: Preparar > 25 mL de tampón de lisis celular sin Igepal y PI y agregar los reactivos recién cuando esté listo para usar. Evite el almacenamiento a largo plazo de tampón de lisis de la célula una vez que se han añadido Igepal y PI. Tienda celular tampón de lisis a 4 ᵒC hasta 3 meses. Igepal es un detergente no iónico, no desnaturalizantes. NP-40 puede utilizarse potencialmente como una alternativa a Igepal pero no hemos utilizado lo en este contexto como NP-40 no se recomienda cuando las muestras se analizan finalmente por espectrometría de masas para caracterizar las proteínas de unión del ADN.</li>
</ol>3. lisis y corte
<ol><li>Preparar > 15 mL de tampón de lisis de núcleos (10 mM EDTA, 50 mM de Tris pH 8.0, 1% SDS, PI). Nota: Agregar PI fresco, sólo a las cantidades a utilizar. Evite el almacenamiento a largo plazo de tampón de lisis de núcleos una vez que se ha añadido la PI. Tampón de lisis de núcleos puede almacenarse a temperatura ambiente hasta por 1 mes.</li>
	<li>Resuspender el precipitado en 20 mL de tampón de lisis celular (contiene Igepal y PI). Permita que los pellets descongelar el hielo y mezclar bien descongelado. Deje las muestras por un adicional 10 min en hielo. Centrifugar las células a 400 x g a 4 ᵒC durante 5 minutos.</li>
	<li>Deseche el sobrenadante y resuspender las células en 6 mL de tampón de lisis de núcleos con PI (volumen puede incrementarse si las células no forman una suspensión).</li>
	<li>
En preparación para la sonicación, dividir la muestra uniformemente en el ~ 6-8 tubos de microcentrífuga (600 a 1.000 μl para cada tubo).
	<ol>
<li>Coloque las muestras en hielo o en un rack frío y someter a ultrasonidos la muestra utilizando un sonicador con una micropunta. Uso de amplitud de 65% con explosiones constante de 5 x 20 s, permitiendo que la suspensión se enfríe durante por lo menos 40 s entre pulsos. Nota: Si aumenta de volumen > 10 mL por muestra, un cristal de la célula de enfriamiento puede utilizarse en su lugar. Más y más ráfagas serían necesarios entonces. Sonicators son muy diferentes. Las condiciones que tenga que ser optimizado por el lector. Otras alternativas de la sonicación se pueden utilizar también.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugar las células a 12.000 x g durante 10 min a 4 ᵒC, transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y deseche los pellets.</li>
	<li>Estiman recuperación total utilizando el método fluorométrico.</li>
	<li>Continuar al siguiente paso o complemento-congelar y almacenar la muestra a-80 ᵒC.</li>
	<li>Opcional: Tomar una alícuota, retroceso reticulaciones por incubación durante la noche en el 67 ᵒC en 0,3 M de NaCl. Limpiar ADN y ejecutarlo en el equipo Bioanalyzer para determinar longitudes de fragmento. La mayor parte de los fragmentos debe ser entre 500 y 1.000 PB. Nota: Está bien parada en este punto y almacenar las muestras a-80 ᵒC.</li>
</ol>4. hibridación captura
<ol><li>Preparar 500 mL de tampón de hibridación (Hyb) 2 (200 mM MES, 2 M de NaCl, 40 mM EDTA 0,02% Tween-20) y 500 mL de tampón de lavado (200 mM NaCl, 0.2% SDS, 50 mM Tris pH 8). Almacene el Hyb y tampones de lavado 4 ᵒC y temperatura ambiente, respectivamente, por hasta 3 meses. Utilizar la mitad de los 2 buffer de x Hyb para preparar un 1 x de tampón de hibridación. También guarde a 4 ᵒC hasta 3 meses. Nota: El volumen total de la captura de hibridación será dos veces el volumen de la muestra resultante en el paso anterior (como se ha descrito hasta ahora, el volumen de muestra sería alrededor de 6 mL y por lo tanto el volumen total de la hibridación sería 12 mL).</li>
	<li>Dejar de lado los granos igual al 5% del volumen de captura total de la hibridación (600 μL en este caso). Un imán apropiado y adecuado es necesario para trabajar con las cuentas en los siguientes pasos.</li>
	<li>Lavar los granos tres veces con 1 x Hyb Buffer usando dos veces el volumen de los granos (1200 μL). Resuspender los granos en 1.200 μL de 2 x Hyb Buffer. Colocar los tubos en el imán, hasta que la solución se aclare y retirar el tampón.</li>
	<li>Realizar pre-claro reacciones en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL con un máximo de 700 μl de muestra por tubo. Añadir suficientes granos (5%) y 2 x Hyb Buffer para diluir el Hyb buffer 1 x (10 tubos con 600 μl de muestra y 120 μl de granos lavados resuspendió en 2 x Hyb Buffer 480 μl de 2 x Hyb Buffer). Incubar 10 min a 31 ᵒC con final sobre rotación final (~ 30-60 rpm).</li>
	<li>Colocar los tubos en un imán, hasta que los granos son inmovilizados y transferir las muestras a tubos nuevos. Deseche los granos. Nota: Desde este punto hacia adelante, se recomiendan tubos de enlace de baja.</li>
	<li>Suspender las captura de oligonucleótidos a una solución de trabajo de 10 pmol/μl y añada 4 μL de esta solución en cada tubo. Nota: Diferentes regiones pueden actuar como control uno para el otro, pero se recomienda incluir un oligonucleótido de captura con su secuencia codificada para servir como un control negativo verdadero.</li>
	<li>Incubar los tubos durante 40 min a 42 ᵒC con final sobre rotación final (~ 30-60 rpm).</li>
	<li>Durante la incubación, apartar los granos necesitados (0,3 μl/pmol de oligonucleótidos de captura). Lavar los granos tres veces como se describe en el paso 4.3, pero resuspender las células en 1 x Hyb Buffer.</li>
	<li>Agregue los granos lavados a la muestra e incubar las muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente con el extremo sobre rotación final (~ 30-60 rpm). Colocar los tubos en el imán y eliminar el sobrenadante una vez que los granos han sido inmovilizados.</li>
	<li>
Lavar los granos
	<ol>
<li>Añadir 1,2 mL de tampón de lavado e incubar la muestra durante 5 minutos con final sobre rotación final (~ 30-60 rpm) en tubos RT. lugar en el imán y espere un par de minutos hasta que la solución se despeja. Extraiga el tampón y repita este paso.</li>
		<li>Añadir 1,2 mL de tampón de lavado e incubar durante 1 h con final sobre rotación final (~ 30-60 rpm) en RT. colocar los tubos en el imán y esperar un par de min de solución limpia. Extraiga el tampón y repita este paso reduciendo el tiempo de incubación a 30 min del segundo tiempo.</li>
		<li>Añadir 200 μL de tampón de lavado e incubar durante 15 minutos con final sobre rotación final (~ 30-60 rpm) en 31 ᵒC. Colocar los tubos en el imán y esperar un par de min de solución limpia. Retirar el tampón.</li>
		<li>Añadir 200 μL de PBS e incubar por 5 min con final sobre rotación final (~ 30-60 rpm) en RT. colocar los tubos en el imán y esperar un par de min de solución limpia. Extraiga el tampón y repita este paso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Elución simple
	<ol>
<li>Agregar 40 μl de agua grado molecular a los granos e incubar a 94 ᵒC durante 5 minutos.</li>
		<li>Colocar los tubos en el imán y esperar un par de minutos hasta que se aclare la solución.</li>
		<li>Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Deseche los granos.</li>
		<li>Proceder al análisis proteómico o almacenar la muestra a-80 ᵒC. Nota: Este tipo de elución funciona bien para el posterior análisis de qPCR y algunas mediciones de proteómica, pero en otros casos dos enfoques alternativos que se describen a continuación eluatos de rendimiento "limpiador".</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Elución de DNasa.
	<ol>
<li>Agregar 40 μl de 1 x Buffer de DNasa y 2 U de la ADNsa a cada tubo.</li>
		<li>Incubar los tubos durante 15 min a 37 ᵒC.</li>
		<li>Colocar los tubos en un imán y esperar un par de minutos hasta que se aclare la solución.</li>
		<li>Retire las muestras eluídas de los granos y colocar las muestras en un tubo nuevo de enlace de baja.</li>
		<li>Incubar el tubo a 94 ᵒC por 7 min inactivar la enzima y proceder a los análisis proteómicos. Nota: Concentraciones más bajas de la ADNsa pueden utilizarse si se observa interferencia con los análisis proteómicos. No será posible calcular los captura de los enriquecimientos por qPCR si este método de elución se usa ya que el tratamiento de DNasa destruye totalmente el material de ADN en la muestra.</li>
		<li>Proceder al análisis proteómico o almacenar la muestra a-80 ᵒC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Elución de punto de apoyo17. Nota: Este método no se recomienda para oligonucleótidos más largo (> 40 bases). Este método requiere las captura de oligonucleótidos contener un 8 bases adicionales que no se superponen con la secuencia genómica y oligonucleótidos complementarios liberación con el fin de desplazar el objetivo de las captura de oligonucleótidos.<ol>
<li>Diluir 2 nanomoles de oligonucleótidos de liberación en 40 μl de tampón SSC.</li>
		<li>Incubar por 20 min a TA.</li>
		<li>Colocar los tubos en un imán y esperar un par de minutos hasta que se aclare la solución.</li>
		<li>Retire la solución de los abalorios.</li>
		<li>Proceder al análisis proteómico o almacenar la muestra a-80 ᵒC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. evaluación de captura de rendimiento por qPCR con las cartillas para el objetivo captura de región de interés
<ol><li>Utilizar un software apropiado o herramienta en línea para el diseño de primers y sondas para la región de destino. Nota: En este experimento, la región del promotor del DUSP3 y DUSP5 fueron atacados. Los cebadores y sondas son las siguientes. DUSP3: cartilla 1 - GTG TTT AGG TTC GAT CCT CC, cartilla 2 - CGG AAT GTC TGC CTT CG, punta de prueba etiquetada FAM - TCC ATG CCC GAA TTG TGA CGT CGG; DUSP5: cartilla 1 - TGA GAA AGC CCT GAT GTG TC, cartilla 2 - GCC TTC AGA AAC CCC AAA AG, sonda marca FAM TGC ATT etiqueta AGC AGC CAG ATG AGG TT.</li>
	<li>Tomar una alícuota de eluido (no más de 10 μl) y diluir 1:10 con grado molecular H2O.</li>
	<li>Extraer el ADN de una de las alícuotas tomadas en el paso 2.1.7 y utilizar esa muestra de ADN para realizar una curva estándar haciendo cinco serie 1:10 diluciones en molecular grado H2O.</li>
	<li>Preparar una mezcla maestra de qPCR (gran variedad de alternativas comerciales), añadir cebadores y sondas y dispense la cantidad adecuada (15 μl si ejecuta una reacción de 20 μl) en cada pocillo.</li>
	<li>Añadir 5 μl de cualquiera: a) diluye la muestra, b) la curva estándar o grado c) molecular H2O (para servir como ningún control de la plantilla) a cada pocillo.</li>
	<li>La placa de sello y centrifugar a 100 x g durante 1 minuto.</li>
	<li>En un sistema qPCR con los siguientes parámetros: 5 min a 95 ᵒC seguido por 40 ciclos de 95 ᵒC de 20 s, ᵒC 59 20 s y 72 ᵒC de 25 s.</li>
	<li>Utilice la curva estándar para evaluar rendimientos y captura revuelto para evaluar la especificidad de la captura.</li>
</ol>

<ol><li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2013).</li>
<li>Galas, D. J., Schmitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNAse+footprinting%3A+a+simple+method+for+the+detection+of+protein-DNA+binding+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity.</a> Nucleic Acids Res. 5 (9), 3157-3170 (1978).</li>
<li>Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+formaldehyde-assisted+isolation+of+regulatory+elements+%28FAIRE%29+to+isolate+active+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Using formaldehyde-assisted isolation of regulatory elements (FAIRE) to isolate active regulatory DNA.</a> Nat. Protoc. 7 (2), 256-267 (2012).</li>
<li>Dai, Y., Kennedy-Darling, J., Shortreed, M. R., Scalf, M., Gasch, A. P., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+Sequence-Specific+Capture+of+Chromatin+and+Mass+Spectrometric+Discovery+of+Associated+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiplexed Sequence-Specific Capture of Chromatin and Mass Spectrometric Discovery of Associated Proteins.</a> Anal. Chem. 89 (15), 7841-7846 (2017).</li>
<li>Guillen-Ahlers, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HyCCAPP+as+a+tool+to+characterize+promoter+DNA-protein+interactions+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">HyCCAPP as a tool to characterize promoter DNA-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genomics. 107 (6), (2016).</li>
<li>Kennedy-Darling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Chromatin-Associated+Proteins+via+Sequence-Specific+Capture+and+Mass+Spectrometric+Protein+Identification+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Discovery of Chromatin-Associated Proteins via Sequence-Specific Capture and Mass Spectrometric Protein Identification in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Proteome Res. 13 (8), 3810-3825 (2014).</li>
<li>Guillen-Ahlers, H., Shortreed, M. R. R., Smith, L. M. M., Olivier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+methods+for+the+analysis+of+chromatin-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Advanced methods for the analysis of chromatin-associated proteins.</a> Physiol Genomics. 46 (13), 441-447 (2014).</li>
<li>Lambert, J. -P., Fillingham, J., Siahbazi, M., Greenblatt, J., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+budding+yeast+chromatin-associated+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Defining the budding yeast chromatin-associated interactome.</a> Mol Syst Biol. 6, 448(2010).</li>
<li>Soldi, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Proteomic+Investigation+of+Chromatin+Functional+Domains+Reveals+Novel+Synergisms+among+Distinct+Heterochromatin+Components%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The Proteomic Investigation of Chromatin Functional Domains Reveals Novel Synergisms among Distinct Heterochromatin Components.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (3), 764-780 (2013).</li>
<li>Wang, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+proteins+captured+by+ChIP-mass+spectrometry+are+linked+to+dosage+compensation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin proteins captured by ChIP-mass spectrometry are linked to dosage compensation in Drosophila.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (2), 202-209 (2013).</li>
<li>Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChAP-MS%3A+A+Method+for+Identification+of+Proteins+and+Histone+Posttranslational+Modifications+at+a+Single+Genomic+Locus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">ChAP-MS: A Method for Identification of Proteins and Histone Posttranslational Modifications at a Single Genomic Locus.</a> Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).</li>
<li>Fujita, T., Fujii, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23942116">Efficient isolation of specific genomic regions and identification of associated immunoprecipitation ( eChIP ) using CRISPR.</a> Biochem. Bioph. Res. Co. 439 (1), 132-136 (2013).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Situ+Capture+of+Chromatin+Interactions+by+Biotinylated+dCas9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9.</a> Cell. 170 (5), 1028-1043 (2017).</li>
<li>Myers, S. A., Wright, J., Zhang, F., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://biorxiv.org/content/early/2017/07/04/159517.abstract">CRISPR/Cas9-APEX-mediated proximity labeling enables discovery of proteins associated with a predefined genomic locus in living cells.</a> bioRxiv. , (2017).</li>
<li>Déjardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Proteins+Associated+with+Specific+Genomic+Loci%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci.</a> Cell. 136 (1), 175-186 (2009).</li>
<li>Buxton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+Protein-DNA+Interactions+in+Human+Alphoid+Chromatin+via+Hybridization+Capture+and+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Elucidating Protein-DNA Interactions in Human Alphoid Chromatin via Hybridization Capture and Mass Spectrometry.</a> J. Proteome Res. 16 (9), 3433-3442 (2017).</li>
<li>Kennedy-Darling, J., Holden, M. T., Shortreed, M. R., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+programmable+release+of+captured+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Multiplexed programmable release of captured DNA.</a> Chembiochem. 15 (16), 2353-2356 (2014).</li>
<li>Fujita, T., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+specific+genomic+regions+and+identification+of+associated+molecules+by+engineered+DNA-binding+molecule-mediated+chromatin+immunoprecipitation+%28enChIP%29+using+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Chromatin+Protoc.+Third+Ed%22%5BJournal%5D)">Isolation of specific genomic regions and identification of associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR.</a> Chromatin Protoc. Third Ed. , 43-52 (2015).</li>
<li>Lambert, J. -P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Proteomics+Approach+for+the+Discovery+of+Chromatin-associated+Protein+Networks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A Novel Proteomics Approach for the Discovery of Chromatin-associated Protein Networks.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (4), 870-882 (2009).</li>
</ol>

Hay no hay conflictos de interés que revelar.

El método de HyCCAPP descrito aquí tiene muchas características únicas que lo convierten en un enfoque de gran alcance para descubrir el ADN-las interacciones que de lo contrario seguiría siendo difícil de alcanzar. La naturaleza del proceso da HyCCAPP la flexibilidad para trabajar en diferentes organismos y regiones del genoma. Es un método, sin embargo, que tiene varias limitaciones a tener en cuenta.
HyCCAPP es un método que evita las modificaciones celulares que potencialmente puede ser ap...

Durante la última década, ha visto una mejora dramática en tecnologías de secuenciación, permitiendo el estudio de una amplia gama de los genomas en gran número de muestras y con una resolución asombrosa. El consorcio de la enciclopedia de elementos de ADN (ENCODE), un esfuerzo multi-institucional a gran escala dirigido por el nacional Instituto de investigación de genoma humano de los institutos nacionales de salud, ha proporcionado ideas sobre cómo los factores de transcripción y se unen a otras proteínas reguladoras e interactúan con el genoma. El esfuerzo inicial caracteriza interacciones DNA proteína, según lo determinado por la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para más de 100 conocidos de proteínas DNA-que atan1. Métodos alternativos como el DNase footprinting2 formaldehído asistida aislamiento de elementos reguladores (FAIRE)3 también han sido utilizados para localizar regiones específicas del genoma interactuando con proteínas, pero con la limitación obvia de que Estas aproximaciones experimentales no identifican las proteínas obran recíprocamente. A pesar de los grandes esfuerzos en los últimos años, no ha emergido ninguna tecnología que permite eficazmente la caracterización completa de las interacciones proteína-ADN en cromatina y la identificación y cuantificación de proteínas asociadas a cromatina.
Para abordar esta necesidad, hemos desarrollado un nuevo enfoque que hemos denominadas como Hybridization Capture of Chromatin-Associated proteínas de Proteómica (HyCCAPP). Desarrollado inicialmente en levadura4,5,6, lo aísla reticulado cromatina las regiones de interés (con proteínas dependientes) mediante captura hibridación específica de secuencia. Después de aislamiento de los complejos de proteína ADN, métodos como la espectrometría de masas pueden utilizarse para caracterizar el conjunto de proteínas a la secuencia de interés. Así, HyCCAPP puede considerarse como un enfoque imparcial para descubrir la novela interacciones DNA proteína, en el sentido de que no se basa en anticuerpos y es totalmente agnóstico sobre las proteínas que se pueden encontrar. Hay otros enfoques capaces de descubrir la novela interacción con DNA proteínas7, pero dependen más de viruta-como métodos8,9,10, plásmido inserciones11,12, 13,14, o regiones con alta copia número15. En cambio, HyCCAPP puede ser aplicado a las regiones múltiples y solo copia y no requiere ninguna información previa acerca de las proteínas en la región. Además, mientras que algunos de los métodos mencionados arriba han características valiosas, en particular evitando la necesidad para reacciones de entrecruzamiento de ADN-proteína, la característica única de HyCCAPP es que puede aplicarse a regiones solo copia sin modificar las células y sin ninguna conocimiento previo acerca de supuestas proteínas o anticuerpos disponibles.
En este punto, predominante se ha aplicado al análisis de varias regiones genómicas en levadura4,5,6HyCCAPP y recientemente se utilizó para analizar las interacciones proteína-ADN en ADN satélite alfa, una región de repetición en el genoma humano16. Como parte de nuestra labor, hemos adaptado el enfoque de captura hibridación inicialmente desarrollado para que la cromatina de la levadura ser aplicable al análisis de las células humanas y aquí presentamos un protocolo modificado que permite la captura selectiva de destino de la solo-copia regiones en el genoma humano con eficiencias similares a nuestros estudios iniciales en la levadura. Este nuevo protocolo optimizado permite la adaptación y utilización de la tecnología para interrogar las interacciones proteína-DNA en el genoma humano, mediante espectrometría de masas u otros enfoques analíticos.
Es importante destacar que el método HyCCAPP está diseñado para el análisis de regiones de objetivo específico y no es conveniente para el análisis del genoma. La tecnología es especialmente útil cuando se trata de regiones para las cuales hay escasa información sobre las proteínas obran recíprocamente, o cuando se desea un análisis profundo más amplio de proteínas obran recíprocamente en un locus específico del genoma. HyCCAPP pretende descubrir proteínas DNA-que atan pero no caracterizar con precisión los sitios de unión de proteínas específicas en la DNA genomic. En su implementación actual, la metodología no proporciona información sobre las secuencias de DNA que atan o motivos para proteínas individuales. Por lo tanto, muy bien complementa las tecnologías existentes como la feria y puede permitir la identificación de nuevas proteínas en regiones genómicas identificado por un análisis inicial de la feria.

<table><tbody><tr><td>Herramienta PrimerQuest</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OligoAnalyzer 3.1</td><td>IDT</td><td></td><td>Analyze captura oligonucleótidos</td></tr><tr><td>PairFold</td><td>UBC</td><td></td><td>Analyze interactions</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medios</td><td>Thermo Fisher</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Thermo Fisher</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Countess contador de células automatizado</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>850 cm2 botella con rodillo&nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>680058</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de rodillos</td><td>Wheaton</td><td>22-288-525</td><td></td></tr><tr><td>37 % formaldehído&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3021</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de la proteasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4380</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Branson sonificador digital SFX 150</td><td>Emerson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 fluorímetro</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR kit de ensayo</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent DNA 1000</td><td>kit Agilent</td><td>5067-1504</td><td></td></tr><tr><td>MES sal sódica</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3885</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 5M</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imán DynaMag-2</td><td>Thermo Fisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Imán DynaMag-15</td><td>Thermo Fisher</td><td>12301D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads M-280 atreptavidina</td><td>Thermo Fisher</td><td>60210</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de ligamiento bajo</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>Horno de hibridación</td><td>SciGene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agitador de tubo y rotador</td><td>Thermo Fisher</td><td>415110Q</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I (sin RNasa)</td><td>New England BioLabs</td><td>M0303</td><td></td></tr><tr><td>SSC buffer 20&times; concentrado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6639</td><td></td></tr></tbody></table>

adaptación de la hibridación de captura de las proteínas asociadas a cromatina para proteómica a células de mamíferos

Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

La captura de la hibridación de las proteínas asociadas a cromatina para tecnología de la proteómica (HyCCAPP) fue inicialmente desarrollada para descubrir nuevas interacciones ADN-proteína en levaduras. Permite el análisis de una región de objetivo de interés sin necesidad de conocimientos previos sobre las proteínas probablemente vinculado a la región de destino. Esto, en teoría, permite HyCCAPP a utilizarse para analizar cualquier región genómica de interés, y proporciona suficiente flexibilidad para trabajar en sistemas de células diferentes. Este método no es para el estudio de sitios de Unión conocido de factores de transcripción, una tarea más adecuado para la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y viruta-como métodos. La fuerza de HyCCAPP reside en su capacidad de explorar regiones de ADN que es limitado o ningún conocimiento sobre las proteínas limitado a él. También puede ser un método conveniente para evitar sesgos (presente en la viruta-como métodos) introducidos por el enriquecimiento de la base de proteínas de la cromatina mediante anticuerpos. Potencialmente, HyCCAPP puede ser una poderosa herramienta para descubrir interacciones DNA proteína verdaderamente novedosas. Hasta la fecha, la tecnología ha sido aplicada principalmente a las células de levadura o a secuencias de la repetición copia alta en células de mamíferos. Para convertirse en la herramienta que tenemos la visión, enfoques HyCCAPP deban ser optimizada para capturar eficientemente loci de la solo-copia en células de mamíferos. Presentamos la adaptación de la levadura inicial HyCCAPP captura de protocolo a líneas celulares humanas y muestran que las regiones de la cromatina de la solo-copia pueden ser eficientemente aisladas con este protocolo modificado.

Debido a la necesidad de grandes cantidades de entrada de la cromatina para HyCCAPP tener éxito, las células crecen a niveles relativamente altos de confluencia. Tripán coloración azul se utiliza para confirmar que las tasas de muerte celular son moderadas (&lt; 10%). En experimentos de única copia, contenido de cromatina antes de la hibridación captura tiene que ser en la gama femtomolar, que generalmente requiere al menos 109 células como material de partida. Antes experiment...

Se trata de un método para identificar nuevas proteínas DNA-que obran recíprocamente en lugares geométricos específicos, basándose en la captura de la secuencia específica de cromatina reticular para análisis proteómicos posteriormente. No se requiere ningún conocimiento previo sobre posibles proteínas, ni modificaciones de la célula. Inicialmente desarrollado para la levadura, la tecnología ahora se ha adaptado para células de mamífero.

Adaptación de la hibridación de captura de las proteínas asociadas a cromatina para proteómica a células de mamíferos

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en nuestra comprensión de la regulación del genoma, como cómo las variantes de secuencia asociadas a enfermedades en regiones no codificantes afectan la expresión y la regulación génica al alterar la unión a proteínas, y puede ayudar a identificar esas proteínas. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere ningún tipo de manipulación genética de células o tejidos, ni anticuerpos, ni conocimientos previos de las proteínas de unión al ADN que puedan interactuar con el ADN en ese locus. La demostración de este procedimiento correrá a cargo de Danu Perumalla, un técnico de mi laboratorio.Después de diseñar oligonucleótidos de acuerdo con el protocolo de texto, coloque la placa de 2 a 5 veces 10 a la 5ª células linfoblastoides, u otras líneas celulares, en un matraz T25 con 6 mililitros de medio RPMI 1640, suplementado con 1% de estreptococo en pluma, 2 mil o más de L-glutamina y 5% de FBS. Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Use un hemocitómetro o un contador de células automatizado para medir la densidad de células.Antes de que las celdas alcancen 1 por 10 a las 6 celdas por mililitro,

adaptation-hybridization-capture-chromatin-associated-proteins-for

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Los compuestos de captura se trifuncional pequeñas moléculas para reducir la complejidad del proteoma de funcionamiento reversible de moléculas pequeñas, la interacción de proteínas seguido por foto-reticulación y la purificación. Aquí se utiliza un compuesto de captura...

Perfiles de metiltransferasas y Otros S-Adenosil- L-Homocisteína proteínas que se unen mediante espectrometría de masas de captura compuesto (MCP)

Los avances en la espectrometría de masas han permitido el análisis de alto rendimiento de la expresión de proteínas y la modificación en un huésped de tejidos. En combinación con el fraccionamiento subcelular y modelos de enfermedad, espectrometría de masa cuantitativa y bioinformática puede revelar nuevas propiedades en los sistemas biológicos. El método descrito en la presente memoria analiza asociadas a la cromatina proteínas en el contexto de las enfermedades del corazón y es fácilmente...

Análisis cuantitativo de proteomas cromatina en la enfermedad

Al combinar nativa y reticular inmunoprecipitación de cromatina con una elevada resolución Espectrometría de Masas, enfoque ChroP permite diseccionar la arquitectura proteómico compuesta de modificaciones de las histonas, variantes y proteínas no histonic sinergizantes en cromatina dominios funcionalmente distintos.

El Enfoque ChroP Combina chip y la espectrometría de masas para diseccionar Locus específicos proteómicos Paisajes de la cromatina

Experimentos de inmunoprecipitación SILAC representan un poderoso medio para descubrir nueva proteína: proteína interacciones. Al permitir la cuantificación relativa precisa de la abundancia de proteínas tanto en el control y las muestras de ensayo, verdaderos interacciones se puede distinguir fácilmente de los contaminantes experimentales, y las interacciones de baja afinidad conservada a través del uso de condiciones de tampón menos estrictos.

Identificación de proteínas compañeros de interacción en células de mamífero utilizando SILAC-inmunoprecipitación cuantitativos Proteómica

Aquí se describe protocolos para romper las células de mamíferos por molienda en estado sólido a una temperatura criogénica, producir un extracto celular a partir del polvo de células resultante, y aislar los complejos de proteínas de interés por captura de afinidad sobre perlas paramagnéticas a escala micrométrica de anticuerpos acoplados.

Complejo de proteínas de captura por afinidad a partir de células de mamífero Cryomilled

Extracción de la sal secuencial de las proteínas de la cromatina obligada es una herramienta útil para la determinación de las propiedades de enlace de los complejos grandes. Este método puede ser empleado para evaluar la función de individuales subunidades o dominios en la total afinidad de una proteína compleja a la cromatina.

Extracciones secuenciales de sal para el análisis de la cromatina a granel enlace propiedades de cromatina, complejos de modificar

Aquí se describe un protocolo para la inmunoprecipitación de cromatina eficiente (ChIP), seguido por secuenciación de ADN de alto rendimiento (ChIP-seq) de tejido adiposo marrón (BAT) aislado de un ratón. Este protocolo es conveniente para el mapeo de modificaciones de las histonas e investigar localización de genoma no histona proteínas de interés en vivo.

Inmunoprecipitación de cromatina del tejido adiposo marrón murino

La inmunoprecipitación por cromatina (ChIP) es una poderosa herramienta para comprender los mecanismos moleculares de la regulación genética. Sin embargo, el método implica dificultades para obtener fragmentación de cromatina reproducible mediante cizallamiento mecánico. Aquí, proporcionamos un protocolo mejorado para un ensayo ChIP usando digestión enzimática.

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina utilizando nucleasas microcócticas en células de mamíferos

La determinación precisa de las ubicaciones de unión a proteínas en todo el genoma es importante para entender la regulación genética. Aquí describimos un método de mapeo genómico que trata el ADN inmunoprecipitado con cromatina con digestión exonucleasa (ChIP-exo) seguido de secuenciación de alto rendimiento. Este método detecta interacciones proteína-ADN con resolución cartográfica de par base cercano y alta relación señal-ruido en las neuronas de mamíferos.

Mapeo de alta resolución de interacciones proteína-ADN en neuronas derivadas de células madre del ratón utilizando inmunoprecipitación de cromatina-exonucleasa (ChIP-Exo)

Este protocolo se centra en la preparación de cromatina a partir de tejidos congelados a presión y es adecuado para la inmunoprecipitación de cromatina reticulada (X-ChIP) seguida de un análisis cuantitativo de PCR (X-ChIP-qPCR) o enfoques de secuenciación de próxima generación (X-ChIP-seq).

Extracción de cromatina del tejido hepático quimérico congelado para el análisis de inmunoprecipitación de la cromatina

Aquí presentamos un protocolo para automatizar el análisis de modificación posttraduccional de histonas unicelulares utilizando una estrategia de marcaje isotópico de dos plexos y la digestión con ArgC. Este flujo de trabajo permite un perfil cuantitativo, reproducible y de alta sensibilidad de la heterogeneidad de la cromatina y las respuestas epigenéticas a resolución de célula única.

Preparación automatizada de muestras para el análisis multiplexado de modificaciones posttraduccionales de histonas unicelulares (sc-hPTM2)

Aprende a identificar proteínas que interactúan con ADN en loci específicos mediante hibridación de captura de cromatina en células de mamíferos. Este método no requiere manipulación genética ni anticuerpos previos.

Adaptación de la hibridación de captura de las proteínas asociadas a cromatina para proteómica a células de mamíferos

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