Adaptación de la hibridación de captura de las proteínas asociadas a cromatina para proteómica a células de mamíferos

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en nuestra comprensión de la regulación del genoma, como cómo las variantes de secuencia asociadas a enfermedades en regiones no codificantes afectan la expresión y la regulación génica al alterar la unión a proteínas, y puede ayudar a identificar esas proteínas. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere ningún tipo de manipulación genética de células o tejidos, ni anticuerpos, ni conocimientos previos de las proteínas de unión al ADN que puedan interactuar con el ADN en ese locus. La demostración de este procedimiento correrá a cargo de Danu Perumalla, un técnico de mi laboratorio.

Después de diseñar oligonucleótidos de acuerdo con el protocolo de texto, coloque la placa de 2 a 5 veces 10 a la 5ª células linfoblastoides, u otras líneas celulares, en un matraz T25 con 6 mililitros de medio RPMI 1640, suplementado con 1% de estreptococo en pluma, 2 mil o más de L-glutamina y 5% de FBS. Incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Use un hemocitómetro o un contador de células automatizado para medir la densidad de células.

Antes de que las celdas alcancen 1 por 10 a las 6 celdas por mililitro, gírelas a 100 veces G durante cinco minutos y transfiérelas a un matraz T75 con 25 mililitros del medio RPMI 1640 preparado anteriormente en este video. Cultive las células hasta que alcancen una densidad celular de 1 por 10 a las 6 células por mililitro, luego transfiera las células a un matraz T150 en 38 mililitros del mismo medio, y cultive durante dos días adicionales. A continuación, gire las celdas a 100 veces G durante cinco minutos y vuelva a suspenderlas en 10 mililitros de medio RPMI 1640.

Luego vierta la suspensión en una botella de rodillo de 1850 centímetros cuadrados que contenga 500 mililitros de medio e incube las células en las mismas condiciones que antes, excepto con rotación constante. Una vez que se alcance el recuento de células deseado, centrifugar el cultivo a 100 veces G durante cinco minutos y volver a suspender las células en 36 mililitros de medio RPMI 1640. A continuación, transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 50 mililitros y retire las pequeñas alícuotas para el recuento celular y la extracción de ADN.

Para reticular las células, agregue 1 mililitro de formaldehído al 37% para alcanzar una concentración final del 1%Luego incube las células a 10 a 30 RPM a temperatura ambiente durante 10 minutos. Apague la reacción de reticulación agregando 2 mililitros de una solución de glicina 2.5 molar para una concentración final de 125 milimolares. A continuación, incubar las células con rotación durante cinco minutos.

Después de peletizar las células por centrifugación, use PBS 1X helado para lavar las celdas dos veces. Continúe con la lisis y el cizallamiento de las células, o vuelva a suspender el pellet en 5 mililitros de tampón de lisis celular y congele la suspensión gota a gota en nitrógeno líquido. A continuación, almacene las muestras a menos 80 grados centígrados.

Para llevar a cabo la lisis y el cizallamiento, vuelva a suspender el pellet en 20 mililitros de tampón de lisis celular. Centrifugar las células a 400 veces G, a 4 grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 6 mililitros de tampón de lisis de núcleos con inhibidores de la proteasa.

En preparación para la sonicación, divida la muestra uniformemente en seis u ocho tubos Microfuge. Coloque las muestras en hielo o en una rejilla fría, y utilice un sonicador con una micropunta para sonicarlas al 65% de amplitud con cinco ráfagas constantes de 20 segundos, permitiendo que la suspensión se enfríe durante al menos 40 segundos entre pulsos. Centrifugar las células a 12.000 veces G y 4 grados Celsius durante 10 minutos, luego transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y deseche los gránulos.

Después de estimar la recuperación total mediante fluorometría, congele las muestras. Después de la preparación de tampones de hibridación y lavado de acuerdo con el protocolo de texto, use 1, 200 microlitros de tampón de hibridación 1X para lavar 600 microlitros de perlas tres veces. A continuación, utilice 1.200 microlitros de tampón de hibridación 2X para volver a suspender las perlas.

En tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros, agregue 600 microlitros de muestra, 120 microlitros de perlas lavadas suspendidas en tampón de hibridación 2X y 480 microlitros de tampón de hibridación 2X. Incubar los tubos a 31 grados centígrados y de 30 a 60 RPM durante 10 minutos. A continuación, coloque los tubos en un imán, hasta que las perlas queden inmovilizadas, y transfiera las muestras a nuevos tubos antes de desechar las perlas.

Vuelva a suspender los oligonucleótidos de captura a una solución de trabajo de 10 picomoles por microlitro y agregue 4 microlitros de esta solución a cada tubo. Incubar los tubos a 42 grados centígrados en 30 a 60 RPM durante 40 minutos. Durante la incubación, deje a un lado las perlas necesarias, lave las perlas tres veces como antes, pero esta vez use tampón de hibridación 1X para volver a suspenderlas.

Agregue las perlas lavadas a los tubos e incube las muestras a 30 a 60 RPM a temperatura ambiente durante 30 minutos. Coloque los tubos en el imán y retire el sobrenadante una vez que las cuentas se hayan inmovilizado. Después de lavar las perlas, eluya la muestra agregando 40 microlitros de agua de grado molecular e incube los tubos a 94 grados Celsius durante cinco minutos.

Coloque los tubos en el imán y espere un par de minutos hasta que la solución se aclare, luego transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y deseche las perlas. Almacene la muestra a menos 80 grados centígrados o proceda al análisis proteómico de acuerdo con el protocolo de texto. Para evaluar el rendimiento de captura, utilice agua de grado molecular para diluir una alícuota del eluido, de uno a diez.

Después de extraer el ADN de una alícuota tomada anteriormente en el video, use la muestra de ADN y el agua de grado molecular para preparar una curva estándar, con cinco diluciones en serie de uno a diez. Prepare una mezcla maestra de qPCR añadiendo cebadores y sondas, y dispense la cantidad adecuada en cada pocillo de la reacción. A cada pocillo, agregue 5 microlitros de la muestra diluida, la curva estándar o agua de grado molecular para que no sirva como control de plantilla.

Selle el plato y gírelo a 100 veces G durante un minuto. A continuación, ejecute las muestras en un sistema qPCR utilizando los parámetros que se encuentran en el protocolo de texto. Por último, utilice la curva estándar para evaluar los rendimientos y la captura codificada para evaluar la especificidad de la captura.

Aquí se muestran capturas de hibridación utilizando una titulación de oligonucleótidos. El número de oligonucleótidos aumenta gradualmente, mientras que la concentración total se mantiene constante. Este experimento ayuda a determinar cuántos oligonucleótidos diferentes se necesitan para alcanzar eficiencias óptimas de hibridación.

También revela cualquier interacción de hibridación perjudicial obvia entre un conjunto particular de oligonucleótidos, y si hay oligonucleótidos con poca especificidad, lo que resulta en un fondo alto. Una gran proporción de fragmentos en la cromatina reticulada no serán susceptibles de captura por hibridación. Si la captura de hibridación se ejecuta con éxito, un experimento de captura posterior del mismo material de cromatina, utilizando un conjunto diferente de oligonucleótidos de captura, dará como resultado rendimientos comparables a los del uso de cromatina fresca.

Sin embargo, en un segundo experimento de captura utilizando los oligonucleótidos originales y la cromatina sobrante del primer experimento, el rendimiento disminuirá aproximadamente un 90% si la mayor parte del material susceptible de hibridación se ha capturado en el primer experimento. Esta figura muestra la captura de hibridación de diferentes regiones cromosómicas diana, con cada región sirviendo como un control negativo para la otra. Una secuencia codificada también sirve como un verdadero control negativo.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos días, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar probar primero los oligonucleótidos de captura, para asegurarse de que la región deseada sea susceptible de captura por hibridación. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la inmunoprecipitación de cromatina, para responder preguntas adicionales, como en qué otro lugar del genoma se unen las proteínas que interactúan con el ADN identificadas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar HyCCAPP para enriquecer las regiones genómicas de interés con el propósito de la identificación de novo de las interacciones de proteínas locales.