Name: Determinar si el ADN teñido con un Cianina tinte puede ser digerido con enzimas de restricción (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Aprende a digerir ADN marcado con tintes fluorescentes usando enzimas de restricción sensibles y no sensibles a metilación. Este método permite evaluar la integridad del ADN en estudios de genómica y biología molecular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Esta investigación fue financiada por el Instituto Nacional para el General médico Ciencia (NIGMS) (5605100122001), un componente de los institutos nacionales de salud (NIH), así como la Universidad de Nebraska en Kearney (UNK) verano estudiante investigación programa (SSRP) y UNK Beca de pregrado (URF).

1. preparación de colorantes, Buffers y Gel de la agarosa
<ol><li>
Preparar las siguientes soluciones para la tinción de ADN o la digestión de ADN teñido.
	<ol>
<li>Preparar 1 x TE (Tris-HCl y etilendiaminotetracético ácido; Tampón EDTA) con 10 mM Tris-HCl y 1 mM EDTA en un cilindro graduado o un matraz aforado. Almacenar a temperatura ambiente (18-25 ° C).</li>
		<li>Hacer alícuotas de cada tinte: TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, 1 BOBO, TOTO 3, YOYO-3, POPO-3, BOBO-3 (tabla 1). Pipetear 4 μL de colorante de 1 mM en un ámbar oscuro o negro tubo de 1,5 mL y añadir 36 μl de TE 1 x, mezclar con la pipeta; Esta concentración hace que una solución de tinte de 100 μm (total 40 μL). Completar este paso para cada colorante. Almacenar a 4 ° C. Nota: Evite exponer el tinte a la luz para evitar fotoblanqueo o degradación del colorante.</li>
		<li>Preparar el tampón 1 usando 10 mM Bis-Tris-propano-HCl 10 mM MgCl2y 100 μg/mL albúmina sérica bovina (BSA). Preparar el tampón 2 utilizando 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl 10 mM MgCl2y 100 μg/mL de BSA. Preparar el tampón 3 utilizando 50 mM acetato de potasio, 20 mM Tris acetato, acetato de magnesio de 10 m m y 100 μg/mL BSA. Cada enzima requiere uno de estos búferes específicos para funcionar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparar las siguientes soluciones para la electroforesis del gel.
	<ol>
<li>Hacer 6 x carga del tinte azul, mediante la combinación de bromofenol 0.25% 0.25% xileno cyanol, 15% Ficoll en dH2O. almacén a temperatura ambiente.</li>
		<li>Para hacer una agarosa 0.7% gel, pesar 0,07 g de agarosa de temperatura (HGT) gelificación alta en un matraz Erlenmeyer, añadir 100 mL de buffer de x TAE 1 y coloque un vaso invertido sobre el matraz.<ol>
<li>Calentar la solución en una placa caliente hasta que las burbujas empiezan a formar en la parte inferior del matraz y flotador en la parte superior.</li>
			<li>Retirar la solución de la placa caliente, deje que la solución se enfríe hasta que el frasco puede ser tocado con la mano desnuda y luego Vierta el gel en un molde de gel de 24,5 x 21,8 cm con un peine de gel para crear pozos.</li>
			<li>Elimine las burbujas cerca del peine o en la superficie del gel por estallido con una punta de pipeta y permita que el gel se solidifique durante al menos 15 minutos. Esta puede almacenarse en un refrigerador (4 ° C) envuelto en plástico durante 1 semana prevenir el secado del gel o contaminación. Para obtener más información sobre cómo ejecutar un gel consulte Lee et al. 33 . Nota: Use un peine de gel con 30 pozos individuales. Cada uno debe ser 4,5 mm de ancho con una profundidad de 2 mm. La altura del pozo dependerá de la cantidad de gel en la caja.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparar 1 buffer x TAE (Tris - acetato - EDTA) utilizando 40 mM Tris-HCl, ácido acético de 20 mM y 1 mM EDTA. Almacenar a temperatura ambiente (18-25 ° C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparación de DNA manchada
<ol><li>
Lambda DNA (300-800 ng) con alícuotas diferentes de tintes de la mancha. Cada tinte (tabla 1) tendrá seis diferentes concentraciones probadas, para un total de 48 reacciones por enzima de la restricción. El siguiente proceso describe un conjunto para arriba para la 1 reacción (figura 1).
	<ol>
<li>Diluir lambda DNA usando TE de x 1 a 100 ng / μl. almacenar a 4 ° C. Hacer una solución con un volumen total de 300 μl.</li>
		<li>Mancha de lambda unmethylated DNA. Para cada banda de la recopilación, estimación de 75-100 ng/banda. Añadir cantidades apropiadas de colorantes para producir concentraciones de 1,9 μm μm 3,8, 19,4 μm, 32.2 μm, μm 48.3, 63.5 μm / 100 ng de ADN.</li>
		<li>Incubar durante una noche (15 h - 18 h) a 4 ° C.</li>
		<li>Dejar uno reacción de la mancha para actuar como un control25. Nota: Use unmethylated DNA por la reacción de digestión. Enzimas sensibles metilación no cortar regiones metiladas en el ADN y le dará un aspecto de una digestión incompleta.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. preparación del ensayo enzimático de la restricción
<ol><li>
Resumen de teñido DNA con una enzima de restricción para determinar si esa enzima puede digerir DNA prestained (figura 1).
	<ol>
<li>Al día siguiente, añadir 20 U del enzima de restricción, 3 μl del tampón apropiado (tabla 2) y agua destilado, esterilizado y filtrado para un total de 30 μl. Para cada reacción de la enzima, elegir el tampón con la más alta eficiencia de corte, que se puede encontrar en la web del fabricante.</li>
		<li>Lugar las reacciones en un baño de agua a la temperatura de la actividad enzimática óptima, listado en la tabla 2 para las 6 enzimas utilizadas en Maschmann et al., para 2-4 h (tabla 2)25.</li>
		<li>Detener la reacción agregando 2 μl de pH de EDTA de 0.5 M 8.0.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Electroeluting tinción de DNA en un Gel de agarosa
<ol><li>Desmoldar los lados 24,5 x 21,8 cm gel (paso 1.2.2) y coloque el gel en la caja de la electroforesis de gel. Vierta 2,5 L de tampón de x TAE 1 en el cuadro. Retire cuidadosamente el peine del gel del gel, por lo que los pozos son accesibles33.</li>
	<li>Pipetear las reacciones de la enzima de la restricción en una película de plástico y combinar cada reacción con 6 x carga del tinte. Para cada solución de reacción, añadir 1 μl de 6 x carga colorante por 5 a 6 μl de solución de ADN (1 x). Luego pipetear las reacciones (que contiene el tinte de la carga, < 18 μL) en los pocillos.</li>
	<li>Mezclar 1 μl de escalera de 1 kb, 9 μl de TE 1 x y 2 μl de 6 x carga del tinte. Cargar la solución en los pozos que flanquean las otras soluciones.</li>
	<li>Cubrir el gel caja con tela o papel negro o azul oscuro. Conecte la caja del gel a una fuente de alimentación la fuente de alimentación a 30 V y ejecutar toda la noche (15-20 h). Apague las luces cuando el gel esté funcionando, para evitar fotorrotura de la DNA etiquetada.</li>
	<li>A la mañana siguiente apague la fuente de alimentación. Tomar el gel usando la bandeja y transferir a un envase con 45 bromuro de etidio μl y 1 L de tampón de x TAE 1. Almacenar el envase a temperatura ambiente en la oscuridad o cubierta en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. Mancha de gel que por menos de 45 min a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: Utilizar bromuro de etidio con guantes y gafas de seguridad. Al limpiar el contenedor con solución de bromuro de etidio y tirar el gel, consulte sus pautas de disposición de los Estados para determinar cómo tratar con bromuro de etidio utilizado; Además, otras manchas pueden utilizarse en lugar de bromuro de etidio.</li>
</ol>5. la proyección de imagen del Gel de agarosa
<ol><li>Coloque el gel sobre un transiluminador de luz azul, que emite la máxima potencia de luz entre 400-500 nm. Tomar fotos con la cámara acoplada a la estación. PRECAUCIÓN: Asegúrese de que utilice la cubierta para el iluminador y ponerse gafas de protección antes de encender la fuente de luz. Nota: Este paso puede también completarse usando cualquier fuente de luz UV o el explorador de gel estándar.</li>
	<li>Ver las fotos de ImageJ arrastrando el archivo a la barra de estado de ImageJ y aparecerá la imagen.</li>
	<li>Determinar la tasa de digestión para el experimento comparando las bandas en el gel con el patrón esperado en silico gel. Para determinar la tasa de digestión, el número de bandas experimentales se divide por el número esperado de DNA bandas24,25. Si el patrón de bandas ADN digerido experimental tiene el patrón esperado, la tasa de digestión es 1. Si el patrón tiene fragmentos más de lo esperado, la tasa de digestión es mayor que 1. Si el patrón tiene menos fragmentos de lo esperado, la tasa de digestión es menor que uno.</li>
</ol>

<ol><li>Teague, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+human+genome+structure+by+single-molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-resolution human genome structure by single-molecule analysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).</li>
<li>Ananiev, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+discerns+genome+wide+DNA+methylation+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles.</a> BMC Mol Biol. 9, 68(2008).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+rice+genome+sequence+by+optical+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Validation of rice genome sequence by optical mapping.</a> BMC Genomics. 8, 278(2007).</li>
<li>Reslewic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+shotgun+optical+mapping+of+Rhodospirillum+rubrum%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodospirillum rubrum.</a> Appl Environ Microbiol. 71 (9), 5511-5522 (2005).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-genome+shotgun+optical+mapping+of+Rhodobacter+sphaeroides+strain+2.4.1+and+its+use+for+whole-genome+shotgun+sequence+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodobacter sphaeroides strain 2.4.1 and its use for whole-genome shotgun sequence assembly.</a> Genome Res. 13 (9), 2142-2151 (2003).</li>
<li>Gupta, A., Kounovsky-Shafer, K. L., Ravindran, P., Schwartz, D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10404-015-1685-y">Optical mapping and nanocoding approaches to whole-genome analysis.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 20 (44), 1-14 (2016).</li>
<li>Kounovsky-Shafer, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presentation+of+large+DNA+molecules+for+analysis+as+nanoconfined+dumbbells%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Presentation of large DNA molecules for analysis as nanoconfined dumbbells.</a> Macromolecules. 46 (20), 8356-8368 (2013).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+confinement%3A+DNA+stretch+approaching+full+contour+length%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length.</a> Lab Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).</li>
<li>Yu, H., Jo, K., Kounovsky, K. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+propulsion%3A+chemical+sensing+and+chemotaxis+of+DNA+driven+by+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Molecular propulsion: chemical sensing and chemotaxis of DNA driven by RNA polymerase.</a> J Am Chem Soc. 131 (16), 5722-5723 (2009).</li>
<li>Lam, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+mapping+on+nanochannel+arrays+for+structural+variation+analysis+and+sequence+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome mapping on nanochannel arrays for structural variation analysis and sequence assembly.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 771-776 (2012).</li>
<li>Cao, H., Tegenfeldt, J. O., Austin, R. H., Chou, S. Y. <a target="_blank" href="https://austingroup.princeton.edu/publications/gradient-nanostructures-interfacing-microfluidics-and-nanofluidics">Gradient nanostructures for interfacing microfluidics and nanofluidics.</a> Applied Physics Letters. 81 (16), 3058-3060 (2002).</li>
<li>Gupta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+reveals+widespread+structural+variation+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis reveals widespread structural variation in multiple myeloma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (25), 7689-7694 (2015).</li>
<li>Wu, C. W., Schramm, T. M., Zhou, S., Schwartz, D. C., Talaat, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+mapping+of+the+Mycobacterium+avium+subspecies+paratuberculosis+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Optical mapping of the Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis genome.</a> BMC Genomics. 10, 25(2009).</li>
<li>Jo, K., Schramm, T. M., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-molecule+barcoding+system+using+nanoslits+for+DNA+analysis+%3A+nanocoding%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis : nanocoding.</a> Methods Mol Biol. 544, 29-42 (2009).</li>
<li>Jo, K., Chen, Y. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elongation+and+migration+of+single+DNA+molecules+in+microchannels+using+oscillatory+shear+flows%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Elongation and migration of single DNA molecules in microchannels using oscillatory shear flows.</a> Lab Chip. 9 (16), 2348-2355 (2009).</li>
<li>Jo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-molecule+barcoding+system+using+nanoslits+for+DNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (8), 2673-2678 (2007).</li>
<li>Reccius, C. H., Mannion, J. T., Cross, J. D., Craighead, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compression+and+free+expansion+of+single+DNA+molecules+in+nanochannels%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Compression and free expansion of single DNA molecules in nanochannels.</a> Phys Rev Lett. 95 (26), 268101(2005).</li>
<li>Staerk, D., Hamed, A. A., Pedersen, E. B., Jacobsen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisintercalation+of+homodimeric+thiazole+orange+dyes+in+DNA%3A+effect+of+modifying+the+linker%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug+Chem%22%5BJournal%5D)">Bisintercalation of homodimeric thiazole orange dyes in DNA: effect of modifying the linker.</a> Bioconjug Chem. 8 (6), 869-877 (1997).</li>
<li>Spielmann, H. P., Wemmer, D. E., Jacobsen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structure+of+a+DNA+complex+with+the+fluorescent+bis-intercalator+TOTO+determined+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Solution structure of a DNA complex with the fluorescent bis-intercalator TOTO determined by NMR spectroscopy.</a> Biochemistry. 34, 8542-8553 (1995).</li>
<li>Carlsson, C., Jonsson, M., Akerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+bands+in+DNA+gel+electrophoresis+caused+by+bis-intercalating+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes.</a> Nucleic Acids Res. 23 (13), 2413-2420 (1995).</li>
<li>Kundukad, B., Yan, J., Doyle, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+YOYO-1+on+the+mechanical+properties+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Effect of YOYO-1 on the mechanical properties of DNA.</a> Soft Matter. 10 (48), 9721-9728 (2014).</li>
<li>Technologies, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTechnologies%2C+L+%22The+Molecular+Probes+Handbook%3A+A+guide+to+Fluorescent+Probes+and+Labeling+Technologies%22">The Molecular Probes Handbook: A guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies</a>. , 11th, (2010).</li>
<li>Riehn, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+mapping+in+nanofluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Restriction mapping in nanofluidic devices.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (29), 10012-10016 (2005).</li>
<li>Meng, X., Cai, W., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+restriction+endonuclease+activity+by+DNA+binding+fluorochromes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Struct+Dyn%22%5BJournal%5D)">Inhibition of restriction endonuclease activity by DNA binding fluorochromes.</a> J Biomol Struct Dyn. 13 (6), 945-951 (1996).</li>
<li>Maschmann, A., Kounovsky-Shafer, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+restriction+enzyme+activity+when+cutting+DNA+labeled+with+the+TOTO+Dye+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleosides+Nucleotides+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Determination of restriction enzyme activity when cutting DNA labeled with the TOTO Dye family.</a> Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. , 1-12 (2017).</li>
<li>Biebricker, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+DNA+intercalators+on+DNA+and+DNA-processing+enzymes+elucidated+through+force-dependent+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The impact of DNA intercalators on DNA and DNA-processing enzymes elucidated through force-dependent binding kinetics.</a> Nature Communications. 6, 7304(2015).</li>
<li>Gunther, K., Mertig, M., Seidel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+and+structural+properties+of+YOYO-1+complexed+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanical and structural properties of YOYO-1 complexed DNA.</a> Nucleic Acids Res. 38 (19), 6526-6532 (2010).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clone-free%2C+single+molecule+map+of+the+domestic+cow+%28Bos+taurus%29+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A clone-free, single molecule map of the domestic cow (Bos taurus) genome.</a> BMC Genomics. 16, 644(2015).</li>
<li>Ray, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+structural+alterations+in+solid+tumor+oligodendroglioma+by+single+molecule+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Discovery of structural alterations in solid tumor oligodendroglioma by single molecule analysis.</a> BMC Genomics. 14, 505(2013).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+model+medicinal+mushroom+Ganoderma+lucidum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum.</a> Nat Commun. 3, 913(2012).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+molecule+scaffold+for+the+maize+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A single molecule scaffold for the maize genome.</a> PLoS Genet. 5 (11), e1000711(2009).</li>
<li>Sischka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+kinetics+between+DNA+and+DNA+binding+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and kinetics between DNA and DNA binding ligands.</a> Biophys J. 88 (1), 404-411 (2005).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
<li>Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigations+on+DNA+intercalation+and+surface+binding+by+SYBR+Green+I%2C+its+structure+determination+and+methodological+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications.</a> Nucleic Acids Res. 32 (12), e103(2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Para digerir el ADN etiquetado fluorescente (figura 1), se requieren una serie de pasos. En primer lugar, ADN se tiñe con un fluorocromo durante la noche. ADN puede incubarse con dímeros de Cianina por un período más corto de tiempo; sin embargo, Carlsson et al encontraron que ADN creado bandas doble para cada tamaño de ADN debido a la tinción incompleta20. Para remediar esto, el ADN puede mancharse durante la noche para evitar que bandas dob...

La serie TOTO (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, 1 BOBO, TOTO 3, YOYO-3, POPO-3 y BOBO-3; Tabla 1) se utiliza en una amplia variedad de experimentos donde la visualización de ADN es necesario1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. la familia de dímeros de Cianina es ampliamente utilizada debido a su alta afinidad por las moléculas de ADN18,19,20, rendimiento cuántico y sensibilidad. Colorantes de Cianina dímero tienen gran selectividad para la DNA trenzada doble y cuando se intercalan un aumento de 100 a 1000 veces mayor de fluorescencia21. Tintes de pyridinium (YOYO-1, TOTO-1, 3 YOYO y TOTO-3) tienen una menor longitud de onda emisión de su quinolium del tinte (BOBO-1, 1 POPO, BOBO-3 y POPO 3) contrapartes (tabla 1)22. También, la producción de quántum de dímeros de Cianina intercalada en el ADN es alta (0.2 - 0.6)22. Sin embargo, utilizando una enzima para determinar el perfil de metilación de ADN molécula2 o estiramiento23 de una molécula de ADN ya teñida con colorante fluorescente requiere de un método para determinar qué enzimas digieren DNA manchada. Cualquier tipo de colorante que se intercala en el ADN o cualquier enzima que da un patrón discernible del sustrato de ADN se puede utilizar para este método.
Meng et al. en primer lugar determina la tasa de digestión de prestained ADN mediante electroforesis en gel utilizando una variedad de diferentes tintes24. Maschmann et al. profundizó en más profunda para ver a la familia TOTO de tintes. Ambos determinan la tasa de digestión de DNA manchada para ver si ADN teñida con un colorante determinado podría ser digerido con una enzima de la restricción de25. Otros métodos de estudian efectos vinculantes de tintes intercalados con el ADN usando pinzas ópticas26 o27de NMR. Cualquiera de los métodos requiere de equipo especializado; Considerando que este método permite el equipo que más laboratorios de biología molecular para determinar si un tinte interfiere con una enzima de la restricción digestión.
Además, en otros métodos para medir la longitud de una molécula dada, mapeo óptico ha alargado sin manchas las moléculas de ADN sobre una superficie y digiere ADN para determinar la extensión y tamaño de los fragmentos. Intercalación de tinte se ha demostrado para aumentar la longitud del contorno de las moléculas de ADN fluorescente manchadas y dependiendo del colorante utilizado, los contorno son diferentes21. Este método ha sido utilizado en una variedad de genomas1,3,4,6,13,28,29,30, 31. sin embargo, si las moléculas previamente teñidas, dependiendo del tinte y la enzima, la enzima puede no poder cortar ADN teñida con un colorante determinado. Por lo tanto, este método determina si ADN teñida con un colorante determinado puede ser digerido con una enzima. Además, dependiendo de la concentración de la tintura y el tinte utilizado, la movilidad de la DNA bandas en un gel migrarán más lentamente que el ADN nativo debido a la corrección parcial de la espina dorsal de la DNA para el tinte insertar entre pares de bases32 .
Sin embargo, a veces estos tintes pueden parcialmente o inhiben totalmente la acción de ciertas enzimas de restricción7,24. Esto es probablemente debido a un cambio estructural en el ADN causado por la fijación del colorante fluorescente, que puede impedir que la enzima reconoce la secuencia específica. Entender cómo estos tintes afectan enzimas de restricción puede ayudar en experimentos donde se requiere el perfil de metilación o el tramo de ADN teñido.
En nuestro método, ADN fue teñido con un fluorocromo de interés y digerido con una enzima de restricción. Luego fue electrophoresed DNA en un gel, reflejado, y se midió la tasa de digestión de la enzima de la restricción. Las enzimas de restricción fueron elegidas basándose en el patrón de corte en un gel. Superposición de bandas de ADN causadas muchas y muy pocas bandas no dio una imagen completa de la molécula de ADN. Hay un punto dulce para poder determinar el perfil de la molécula de ADN digerido; por lo tanto, dependerá de la DNA usada y la enzima. Una ventaja de este método es su simplicidad; sólo requiere equipo usado en una electroforesis de gel y digestión de restricción.

<table><tbody><tr><td>ADN lambda no metilado</td><td>NEB</td><td>N3013S</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3601</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3600</td><td></td></tr><tr><td>POPO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3580</td><td></td></tr><tr><td>BOBO-1</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>B3582</td><td></td></tr><tr><td>YOYO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Y3606</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3604</td><td></td></tr><tr><td>POPO-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3584</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>PmlI</td><td>NEB</td><td>R0532S</td><td></td></tr><tr><td>ScaI</td><td>NEB</td><td>R3122S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI&nbsp;</td><td>NEB</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R0104S</td><td></td></tr><tr><td>SmaI</td><td>NEB</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152-1</td><td>Irritante</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S316-212</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td> tóxico <td>Fisher</td><td>S25358</td><td>Tampón corrosivo e irritante</td></tr><tr><td>1</td><td>NEB</td><td>B7201S</td><td>NEB 1.1</td></tr><tr><td>Tampón 2</td><td>NEB</td><td>B7202S</td><td>NEB 2.1</td></tr><tr><td>Tampón 3</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td>NEB Cutsmart</td></tr><tr><td>Gel de agarosa de alta temperatura gelificante</td><td>Lonza</td><td>50041</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Fisher</td><td>S25118</td><td>Peligroso</td></tr><tr><td>Transiluminador de luz azul</td><td>Dark Reader</td><td>DR196</td><td>Use gafas correctas&nbsp;</td></tr><tr><td>Bromuro de etidio Fisher</td><td></td><td>15585011</td><td>cancerígeno; otras alternativas son Nancy 520, Gel rojo, etc.</td></tr><tr><td>Cámara Cannon EOS Rebel T3I Cannon</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apogee Modelo H4</td><td>Biorad</td><td>1704510</td><td></td></tr><tr><td>Power Pac Fuente de alimentación básica</td><td>Biorad</td><td>1645050&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP525-25</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Fisher Scientific</td><td>B-392</td><td></td></tr><tr><td>Xileno Cyanol</td><td>Eastmen</td><td>T1579</td><td></td></tr></tbody></table>

determinar si el adn teñido con un cianina tinte puede ser digerido con enzimas de restricción

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

Visualización del ADN para microscopía de fluorescencia utiliza una variedad de tintes tales como los colorantes de Cianina. Estos colorantes son utilizados debido a su alta afinidad y sensibilidad para el ADN. Para determinar si las moléculas de ADN son completas después de la terminación del experimento, se requiere un método para determinar si las moléculas de tinción son longitud total por digestión de DNA con enzimas de restricción. Sin embargo, DNA manchada puede inhibir las enzimas, por lo que es necesario un método para determinar qué enzimas se puede usar para el fluorocromo mancharon ADN. En este método, el ADN se tiñe con un tinte de Cianina durante la noche para permitir que el tinte y el ADN se equilibren. Siguiente, tiñe ADN es digerido con una enzima de restricción, cargan en un gel y al. Las bandas de digestión de ADN experimentales son comparadas a una digestión en silico para determinar la actividad de la enzima de la restricción. Si hay el mismo número de bandas, como era de esperar, la reacción es completa. Bandas más de lo esperado indica la digestión parcial y menos bandas indican digestión incompleta. La ventaja de este método es su simplicidad y utiliza equipos que un científico necesita de una enzima de la restricción análisis y electrophoresis del gel. Una limitación de este método es que las enzimas disponibles para la mayoría de los científicos son las enzimas comercialmente disponibles; sin embargo, podría utilizarse cualquier enzimas de restricción.

Con el fin de determinar que si un colorante intercalante afecta una enzima de restricción que digiere ADN, el orden correcto de pasos debe ser seguidos (figura 1). Una vez que el ADN es manchado y digerido con una enzima dada, una imagen del gel puede tomarse para determinar el número de fragmentos y su tamaño (figura 2). Para determinar la eficiencia de la enzima, el número total de bandas visibles esperados dividido por el núm...

Las moléculas de ADN para microscopía de fluorescencia de la tinción permite ver durante un experimento científico. En el método presentado aquí, las moléculas de ADN son previamente teñidas con colorantes fluorescentes y digeridas con metilación y enzimas de restricción sensibles no metilación.

Determinar si el ADN teñido con un Cianina tinte puede ser digerido con enzimas de restricción

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

El objetivo general de este experimento es digerir moléculas de ADN marcadas con fluorescencia con enzimas de restricción sensibles a la metilación y no a la metilación y determinar la tasa de digestión del experimento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la química o la biología, como la genómica. La ventaja de este método es que un científico puede digerir el ADN previamente teñido con una enzima para determinar si el ADN es completo después de la finalización de un experimento diferente.El demostrador del procedimiento estará a cargo de Drew Thompson, un estudiante de pregrado de mi laboratorio. Para hacer un gel de agarosa al 0,7%, pese 1,4 gramos de agarosa a alta temperatura gelificante en un matraz Erlenmeyer. A continuación, añada 200 mililitros de 1x tampón TAE y coloque un vaso de precipitados invertido encima del matraz.Caliente la solución en una placa caliente hasta que comiencen a formarse burbujas en el fondo del matraz y floten hacia la parte superior. Retire la solución de la placa calefactora y déjela enfriar hasta que el matraz pueda tocarse con la mano desnuda. Luego vierta el gel en un molde de gel de 24,5 centímetros por 21,8

determining-if-dna-stained-with-cyanine-dye-can-be-digested-with

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Esta publicación describe cómo utilizar el pescado Agilent Sistema de Identificación de Especies para identificar las especies de peces mediante la extracción de ADN y la realización de PCR y RFLP.

Basada en el ADN de especies de peces Protocolo de identificación

Los colorantes de cianina fotoestables se unen a oligonucleótidos para monitorear la hibridación por transferencia de energía.

Síntesis de ADN sondas de hibridación de longitud de onda de desplazamiento mediante fotoestable Cyanine Dyes

La identificación de interacciones físicas entre los genes y elementos reguladores es un reto, pero ha sido facilitada por los métodos de captura de conformación de cromosoma. Esta modificación al Protocolo de 4C-seq mitiga sesgo PCR minimizando la amplificación excesiva de plantillas de PCR y maximiza el mappability de Lee mediante la incorporación de un paso de síntesis de enzima de la restricción además.

Captura de alto rendimiento identificación de secuencias reguladoras de genes utilizando secuenciación de próxima generación de conformación Circular cromosoma (4C-seq)

Aquí, presentamos un protocolo para utilizar tiazol naranja para la detección de ADN en experimentos de electroforesis de gel. El uso de naranja de tiazol permite eliminación de bromuro de etidio, y se logra la detección de la fluorescencia con luz azul o UV.

Electroforesis de DNA utilizando naranja de tiazol en lugar de bromuro de etidio o tintes alternativos

El genoma está organizado en el espacio nuclear en diferentes estructuras que pueden revelarse a través de tecnologías de captura de conformación cromosómica. El método Hi-C en el núcleo proporciona una colección de interacciones de cromatina en líneas celulares de Drosophila en todo el genoma, que genera mapas de contacto que se pueden explorar a resolución de megabase a nivel de fragmento de restricción.

Hi-C en el núcleo en células de Drosophila

Utilizando ADN marcado con puntos cuánticos y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total, podemos investigar el mecanismo de reacción de las endonucleasas de restricción mientras usamos proteínas no marcadas. Esta técnica de una sola molécula permite la observación masiva y multiplexada de las interacciones individuales proteína-ADN, y los datos se pueden agrupar para generar distribuciones de tiempo de permanencia bien pobladas.

Análisis de tiempo de permanencia de una sola molécula de la escisión de ADN mediada por endonucleasas de restricción

Aquí, presentamos una adaptación de la técnica de captura de conformación cromosómica (3C) en detalle con énfasis en la participación y el aprendizaje de pregrado.

Obtener una A con las 3C: Captura de conformación cromosómica para estudiantes universitarios

Este protocolo demuestra la realización de un ensayo de una sola molécula para la visualización en vivo del desenrollado del ADN por helicasa CMG. Describe (1) la preparación de un sustrato de ADN, (2) la purificación de la helicasa CMG de Drosophila melanogaster marcada con fluorescencia, (3) la preparación de una celda de flujo microfluídica para la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) y (4) el ensayo de desenrollado de ADN de una sola molécula.

Visualización en tiempo real de una sola molécula del desenrollado del ADN mediante CMG Helicase

Se presenta un protocolo para perfiles metabólicos de muestras biológicas mediante electroforesis capilar de espectrometría de masas utilizando un diseño de interfaz de punta porosa sheathless.

Sheathless electroforesis capilar-espectrometría de masas de perfiles metabólicos de muestras biológicas

Deposición amiloidea es una seña de identidad de distintas enfermedades y afecta a muchos órganos diferentes. Este trabajo describe la aplicación de la fluorescencia oligothiophene conjugado luminiscente tinción en combinación con técnicas de microscopía de fluorescencia. Este método de coloración representa una poderosa herramienta para la detección y exploración de agregados proteicos en ajustes clínicos y científicos.

Imagen tejidos amiloides manchado con Oligothiophenes conjugado luminiscente por hiperespectral Confocal la microscopia y la proyección de imagen de toda la vida de la fluorescencia

Aprende a digerir ADN marcado con tintes fluorescentes usando enzimas de restricción sensibles y no sensibles a metilación. Este método permite evaluar la integridad del ADN en estudios de genómica y biología molecular.

Determinar si el ADN teñido con un Cianina tinte puede ser digerido con enzimas de restricción

Explorar más videos