Determinar si el ADN teñido con un Cianina tinte puede ser digerido con enzimas de restricción

El objetivo general de este experimento es digerir moléculas de ADN marcadas con fluorescencia con enzimas de restricción sensibles a la metilación y no a la metilación y determinar la tasa de digestión del experimento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la química o la biología, como la genómica. La ventaja de este método es que un científico puede digerir el ADN previamente teñido con una enzima para determinar si el ADN es completo después de la finalización de un experimento diferente.

El demostrador del procedimiento estará a cargo de Drew Thompson, un estudiante de pregrado de mi laboratorio. Para hacer un gel de agarosa al 0,7%, pese 1,4 gramos de agarosa a alta temperatura gelificante en un matraz Erlenmeyer. A continuación, añada 200 mililitros de 1x tampón TAE y coloque un vaso de precipitados invertido encima del matraz.

Caliente la solución en una placa caliente hasta que comiencen a formarse burbujas en el fondo del matraz y floten hacia la parte superior. Retire la solución de la placa calefactora y déjela enfriar hasta que el matraz pueda tocarse con la mano desnuda. Luego vierta el gel en un molde de gel de 24,5 centímetros por 21,8 centímetros con un peine de gel para crear pocillos.

Use una punta de pipeta para reventar las burbujas cerca del peine o en la superficie del gel y deje que el gel se solidifique durante al menos 15 minutos. Para teñir el ADN lambda a seis concentraciones diferentes de colorantes, comience usando 1x TE para preparar 300 microlitros de 100 nanogramos por microlitro de ADN lambda. Almacene la solución a cuatro grados centígrados.

Mientras prepara una muestra para cada una de las siguientes concentraciones de colorante para cada banda esperada en un digestión de restricción, tiña de 75 a 100 nanogramos de ADN lambda no metilado. Incubar las muestras a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, para determinar si una enzima de restricción puede digerir el ADN teñido, agregue 20 unidades de enzima de restricción, tres microlitros del tampón apropiado con la mayor eficiencia de corte y agua destilada filtrada y en autoclave para una reacción de 30 microlitros.

Coloque las reacciones en un baño de agua con la actividad enzimática óptima e incube durante dos a cuatro horas. A continuación, detenga las reacciones añadiendo dos microlitros de EDTA 0,5 molar pH 8,0. Retire los lados del molde de gel previamente preparado y coloque el gel en la caja de electroforesis de gel.

Vierta 2,5 litros de 1x tampón TAE en la caja. Luego, retire con cuidado el peine de gel del gel para que los pocillos sean accesibles. Pipetee las reacciones de la enzima de restricción en una película de plástico y, para cada solución de reacción, agregue un microlitro de tinte de carga 6x por cinco a seis microlitros de solución de ADN.

A continuación, pipetee las reacciones en los pocillos. Mezcle un microlitro de una escalera de kilobase, nueve microlitros de 1x TE y dos microlitros de tinte de carga 6x. A continuación, cargue la solución en los pozos que flanquean las otras soluciones.

Cubra la caja de gel con un papel o tela azul oscuro o negro, luego conecte la caja de gel a una fuente de alimentación. Configure la fuente de alimentación a 30 voltios y hágala funcionar durante la noche. Apague las luces mientras el gel está funcionando para evitar la fotodivisión del ADN marcado.

A la mañana siguiente, transfiera el gel de la bandeja a un recipiente con 45 microlitros de bromuro de etidio y un litro de tampón TAE 1x. Guarde el recipiente a temperatura ambiente en la oscuridad o cúbralo con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. Deje que el gel permanezca durante al menos 45 minutos a temperatura ambiente.

Para obtener imágenes del gel, coloque el gel encima de un transiluminador de luz azul, que emite una salida de luz máxima de entre 400 y 500 nanómetros. Tome fotografías con una cámara conectada a la estación. Determine la tasa de digestión del experimento de acuerdo con el protocolo de texto.

La eficiencia enzimática se determina dividiendo el número total de bandas esperadas por el número de bandas visibles. Además, para determinar el tamaño aproximado de las bandas, se requiere un control para saber dónde se esperan las moléculas de ADN nativo en comparación con el ADN teñido. La movilidad de las bandas en los carriles tres y cuatro ha disminuido, lo que hace que las bandas se desplacen más cerca de los pozos.

En estos carriles, la cantidad de tinte no afecta notablemente a la movilidad, por lo que las bandas coinciden con el control. Los carriles cinco y seis muestran más bandas que el control, lo que indica una digestión parcial, lo que sugiere que los tintes afectaron la escisión en los sitios de reconocimiento. En este experimento, se ven todas las bandas esperadas para todas las concentraciones de colorante, por lo que los dados no interfirieron con la digestión del ADN.

Para ver cómo cambiaba la movilidad a medida que aumentaba la concentración del tinte YOYO-1, se insertaron asteriscos de colores junto a cada banda. Por ejemplo, las bandas de 3,5 kilobases tienen asteriscos rojos junto a ellas en cada concentración de YOYO-1. Las bandas inesperadas en los carriles cinco y seis no tienen un asterisco al lado de las bandas.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar cubrir el gel con una hoja de papel oscuro y completar el funcionamiento del gel en una habitación oscura. Además, asegúrese de usar tubos oscuros para sus reacciones. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo digerir moléculas de ADN teñidas con fluorescencia con enzimas de restricción y determinar la tasa de digestión de la reacción.

No olvide que trabajar con bromuro de etidio puede ser extremadamente peligroso, por lo que se deben tomar precauciones como el uso de guantes y gafas de seguridad mientras se realiza el procedimiento. Además, asegúrese de usar gafas de seguridad adecuadas cuando use un transiluminador.