Perfiles de sincronización de replicación de ADN utilizando el pez cebra como un sistema de modelo en Vivo

El objetivo general de este procedimiento es generar mapas de tiempo de replicación del ADN del genoma completo de embriones de pez cebra en diferentes etapas de desarrollo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos del ciclo celular y la biología de la cromatina, como cómo los cambios en la cromatina que se producen durante el desarrollo embrionario pueden afectar el inicio de las horquillas de replicación del ADN. La principal ventaja de esta técnica es que mapea los cambios de replicación que ocurren in vivo en etapas definidas del desarrollo embrionario.

Aunque este método puede proporcionar información sobre cómo cambia la replicación del ADN durante el desarrollo del pez cebra, también se puede aplicar a otros sistemas u organismos modelo, como tunicados, ranas y moscas. En general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque se necesita algo de práctica para generar suspensiones unicelulares a partir de embriones de pez cebra. La noche antes de que se recolecten los embriones, coloque docenas de adultos reproductores en tanques de cría, utilizando aproximadamente el mismo número de machos y hembras.

Dependiendo del experimento, utilice una de las siguientes estrategias de cría. Para la primera estrategia de cría, coloque algunos peces cebra machos y hembras en tanques de reproducción individuales y use un divisor para separar los machos de las hembras. Si se utiliza este enfoque, se deben establecer muchos tanques de cría diferentes y agrupar los embriones de cada uno para garantizar que la variabilidad biológica sea representativa de la población.

Para la estrategia de cría número dos, combine docenas de peces cebra machos y hembras en un tanque de cría grande. Utilice esta estrategia siempre que haya un número suficientemente grande de embriones. Es razonable suponer que provienen de una variedad de fundadores y, por lo tanto, son genéticamente representativos de la población.

Para realizar apareamientos cronometrados, comience tan pronto como comiencen los ciclos de luz por la mañana. Permita que los peces se reproduzcan en aguas poco profundas durante un período de 10 minutos, con un fondo falso para que los embriones escapen. Después de 10 minutos, recoja los embriones vertiéndolos a través de un colador y usando una botella de lavado para enjuagarlos en un plato de 10 centímetros.

Agrupe todos los embriones recolectados en el mismo punto de tiempo, márquelos con la hora de recolección e incorpórelos inmediatamente en una incubadora a 28.5 grados centígrados. Para garantizar que se recolecten los embriones en desarrollo sincrónico, es fundamental que se recolecten lotes de embriones cada 10 minutos. Esto es especialmente importante con las primeras etapas del desarrollo embrionario.

Se pueden esperar cientos de embriones de una sola pareja de apareamiento en un día. Permita que los adultos se reproduzcan en ciclos de 10 minutos hasta que el número de embriones obtenidos sea inferior a 20. Aproximadamente de una a 1.5 horas después de la recolección, para clasificar los embriones, sacarlos de la incubadora, observarlos bajo un microscopio de disección y clasificarlos para eliminar los huevos muertos y no fertilizados.

Cuente los embriones y colóquelos a una densidad de 100 embriones por placa de 10 centímetros. Agregue medio E3 fresco y devuelva los embriones a la incubadora a 28,5 grados centígrados. Cuando los embriones alcancen la etapa de desarrollo deseada, verifique la etapa morfológicamente bajo un microscopio óptico de acuerdo con las Etapas de Desarrollo Embrionario del Pez Cebra.

Si los embriones tienen 48 hpf o menos, transfiera hasta 1500 embriones en etapas a un tubo cónico de 15 mililitros y use E3 para lavarlos varias veces. Por cada 100 embriones, agregue un mililitro de E3 y 20 microlitros de solución Pronase y agite suavemente. Se pueden descorionar hasta 1500 embriones en un solo tubo con 15 mililitros de E3. Coloque el tubo de lado y coloque los embriones en una capa uniforme para garantizar la máxima relación superficie-volumen.

Agite suavemente el tubo cada dos o tres minutos hasta que todos los coriones se hayan desprendido de los embriones. El tiempo total de decorionación variará en función de la actividad Pronase. Retire el sobrenadante y, con 10 mililitros de E3, enjuague suavemente los embriones tres veces.

Después de colocar los embriones en hielo y eliminar el E3 restante, use un mililitro de tampón deyolking recién preparado y helado por cada 500 embriones para lavar la muestra. A continuación, con un P1000, pipetea suavemente los embriones hacia arriba y hacia abajo de cinco a 10 veces para romper el saco vitelino. A continuación, transfiera un mililitro a un tubo de microfuga de 1,5 mililitros y centrifugue la muestra a cuatro grados centígrados y 500 veces la gravedad durante cinco minutos.

Las muestras deben pipetearse lo suficientemente vigorosamente como para crear una suspensión unicelular sin lisar las células. Este paso requerirá algo de práctica. Retire el sobrenadante y use un mililitro de 1x PBS helado para lavar el pellet y eliminar la solución del Ringer.

A continuación, vuelva a centrifugar la muestra. Retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un mililitro de 1x PBS. Luego, coloque el tubo sobre hielo.

Agregue tres mililitros de etanol helado a un tubo cónico de 15 mililitros y agite suavemente el tubo de EtOH en una configuración baja. Usando un P1000, gotee lentamente la suspensión de células embrionarias de pez cebra en el EtOH mientras continúa en el vórtice. Añadir un total de un mililitro de la suspensión de células embrionarias, para obtener una solución de fijación final de 75% de EtOH.

Después de haber agregado un mililitro de suspensión celular, agite suavemente el tubo para mezclar y colóquelo de lado a menos 20 grados centígrados durante al menos una hora, o guarde la suspensión en el congelador durante dos o tres semanas. Para teñir el ADN embrionario, después de eliminar las células embrionarias fijadas con EtOH a 20 grados centígrados negativos, centrifugar el tubo a 1500 veces la gravedad y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Coloque el tubo en hielo y retire con cuidado el sobrenadante.

Luego, usando un P1000, resuspenda suavemente las células en un mililitro de PBS-BSA frío recién preparado. Centrifugar las células a 1500 veces la gravedad y cuatro grados centígrados durante cinco minutos, y colocar la muestra en hielo. A continuación, se retira el sobrenadante y, por cada 1.000 embriones, se añaden 200 microlitros de solución de tinción de yoduro de propidio y se vuelven a suspender las células.

Deje que las células se incuben en la solución PI durante 30 minutos en hielo, mezclando suavemente cada cinco minutos. Coloque un colador de células de nailon de 40 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo. A continuación, pipetee suavemente las células para mezclar y filtrar la solución celular a través de la malla.

Con el extremo interior plano de un émbolo de jeringa, rompa suavemente los grupos restantes de células en la malla. Por cada 1.000 embriones, use 500 microlitros de PBS-BSA frío para enjuagar las células a través del filtro. Coloque una malla de 40 micrómetros sobre un tubo cónico de 15 mililitros sobre hielo y filtre la suspensión celular del tubo cónico de 50 mililitros por segunda vez en el tubo de 15 mililitros.

Finalmente, usando un instrumento de clasificación de células apropiado, configure la excitación del láser a 561 nanómetros y la detección de emisiones a 610 sobre 20 para detectar el yoduro de propidio. Ordene las celdas y realice análisis adicionales de acuerdo con el protocolo de texto. Para determinar la calidad del mapeo de lectura, primero se deben alinear los datos de secuenciación con el genoma, utilizando estadísticas de los valores de mapQ.

Además, las estadísticas de longitud de lectura calculadas se representan como un histograma de la distribución de los tamaños de inserción para todas las lecturas de secuenciación. Este experimento en particular resultó en una mediana de 170 pb. Este gráfico de barras ilustra las estadísticas de lectura para el total de lecturas asignadas, las lecturas que contienen un indicador de baja calidad, las lecturas con pares que se asignan a un cromosoma diferente, las lecturas con un par más allá del umbral de distancia y los duplicados de PCR.

Aquí se enumeran los números representativos del total de lecturas asignadas, no asignadas y no emparejadas, la cobertura y la resolución de lectura para una secuencia típica de una muestra de pez cebra. Después del filtrado, los recuentos de lecturas se determinan en ventanas de tamaño variable y los datos se suavizan y normalizan. Aquí se muestran los perfiles típicos de tiempo de replicación suavizados y normalizados de un cromosoma de pez cebra representativo para réplicas biológicas.

Los perfiles de las réplicas biológicas y experimentales deben ser muy similares y también mostrar una alta correlación a lo largo de la longitud del cromosoma. Los perfiles también deben mostrar una alta correlación entre los valores de tiempo a lo largo del genoma. El mapa de colores representa el coeficiente de correlación de Pearson.

Al intentar este procedimiento, es muy importante recordar que debe asegurarse de que se recolecten los embriones en desarrollo sincrónico. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como las inyecciones de morfolino o la mutagénesis de CRISPR-Cas9, para responder a preguntas adicionales, como ¿cuáles son los mecanismos por los que la replicación del ADN se coordina con otros procesos de desarrollo? Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo recolectar células en etapas específicas del ciclo celular a partir de embriones de pez cebra en desarrollo sincrónico.

La recolección de estas muestras es fundamental para generar mapas de tiempo de replicación del ADN del genoma completo.