Name: Perfiles de sincronización de replicación de ADN utilizando el pez cebra como un sistema de modelo en Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Aprende a generar mapas de sincronización de replicación de ADN en embriones de pez cebra en diferentes etapas del desarrollo. Este método permite estudiar cambios en la cromatina y su impacto en la iniciación de la replicación.

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Este trabajo fue apoyado por Instituto Nacional de General médica Ciencias de los institutos nacionales de salud a través de becas 5P20GM103636-02 (incluyendo soporte de base de citometría de flujo) y 1R01GM121703, así como los premios desde el centro de Oklahoma para la células madre adultas Investigación.

Todos los animales se manejaron en estricta conformidad con los protocolos aprobados por la Comisión de uso y de Oklahoma Medical Research Foundation institucional Animal Care.
1. configuración del pez cebra adulto para criar
<ol><li>Utilice a una cohorte grande de pez cebra macho y hembra adulto de una sola cepa de cría. Hay pequeñas diferencias en la composición genética del pez cebra de incluso una sola cepa, una cohorte grande para asegurar que los resultados son representativos de la variabilidad genética de la población y no restringida a un pequeño subconjunto de la población.</li>
	<li>La noche antes de que los embriones se recogerán, lugar docenas de adultos de crianza en tanques de cría, usar números aproximadamente iguales de machos y hembras. Según el experimento, utilice uno de las siguientes estrategias de crianza.<ol>
<li>Estrategia 1 de cría: unos peces cebra macho y hembra en tanques de cría individual, separar los machos de las hembras con un divisor. Si se utiliza este enfoque, configurar muchos tanques de cría diferentes y piscina los embriones de cada uno para que la variabilidad biológica es representativa de la población.</li>
		<li>Estrategia 2 de cría: combinar decenas de pez cebra macho y hembra en un tanque de cría grandes. Utilizar esta estrategia como hay un número suficientemente grande de embriones, es razonable asumir que vinieron de una variedad de fundadores y son por lo tanto genéticamente representativa de la población.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. tiempo de apareamientos - recogida, clasificación y embriones de pez cebra para los experimentos de la vivienda
<ol><li>Realizar cruzamientos programado, comenzando tan pronto como la luz de los ciclos en la mañana. Deseche cualquier embriones generados durante la noche.</li>
	<li>Permitir los peces para reproducirse en aguas poco profundas (3-5 cm) por un período de 10 minutos, con un falso fondo para embriones escapar a través de.</li>
	<li>Después de 10 min, recoger embriones por verter a través de un colador y enjuagar en una placa de 10 cm con una botella de lavado. Piscina todos los embriones recogidos en el mismo punto del tiempo, la marca con el tiempo de recolección y lugar inmediatamente en una incubadora a 28,5 ° C.</li>
	<li>Cientos de embriones se pueden esperar de un solo par de apareamiento en un día. Permitir que adultos criar en min 10 ciclos hasta que el número de embriones obtenidos es inferior a veinte.</li>
	<li>Aproximadamente 1 a 1,5 h después de la recolección, embriones de la especie para eliminar embriones muertos y no fecundados. Para ordenar los embriones, quite de la incubadora y observar bajo un microscopio de disección.<ol>
<li>Cuenta los embriones y lugar a una densidad de 100 embriones por placa de 10 cm.</li>
		<li>Agregar medio fresco de E3 (5 mM de NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM de MgSO4) y devolver los embriones a la incubadora de 28,5 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Dechorionate, deyolk y se fijan embriones de pez cebra
Nota: Esta sección del protocolo está diseñada para los embriones antes de la fertilización post de 48 h (hpf). No es necesario quitar las chorions de embriones en etapas posteriores del desarrollo (después de 48 hpf), como a menudo naturalmente se caen. No es necesario deyolk o eliminar el chorions de los peces más viejos los 5 días post fertilización (dpf).
<ol><li>Cuando los embriones alcanzan la edad de desarrollo deseado, verificar la etapa apropiada de desarrollo morfológico al microscopio ligero según "Etapas de embrionario desarrollo del pez cebra"17.</li>
	<li>Transferencia de embriones etapas hasta 1500 a un tubo cónico de 15 mL y lavar varias veces con E3.<ol>
<li>Añadir 1 mL de E3 y 20 μl de la solución de pronasa (30 mg/mL) para cada 100 embriones y agitar suavemente. Hasta 1500 embriones pueden dechorionated en un solo tubo con 15 mL de E3.</li>
		<li>Ponga el tubo de costado y arreglar embriones en una capa uniforme para asegurar la máxima superficie a cociente del volumen. Frote suavemente el tubo cada 2-3 min hasta chorions todos han caído de los embriones. El tiempo total dechorionation variará dependiendo de la actividad de pronasa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eliminar el sobrenadante y suavemente enjuague embriones 3 veces con 10 mL de E3. Coloque los embriones en el hielo para el resto de esta sección del protocolo.</li>
	<li>E3 de quitar y lavar los embriones con tampón de deyolking helado recién preparado (0,5 x solución de Ginzburg pescado Ringer sin calcio: 55 mM NaCl, 1,8 mM KCl, 1.25 mM NaHCO3).<ol>
<li>Añadir 1 mL de tampón de deyolking helada hasta 500 embriones.</li>
		<li>Utilizando P1000, suavemente pipeta embriones arriba y abajo 5 - 10 veces a interrumpir el saco de yema de huevo.</li>
		<li>Transferir 1 mL a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL y centrifugar a 4 ° C y 500 x g durante 5 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eliminar el sobrenadante y lavar pellet con 1 mL de helado de 1 x PBS (tamponada fosfato salino, pH 7.0) para eliminar la solución de Ringer. Centrifugar a 4 ° C y 500 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Cuidadosamente Quite el sobrenadante y resuspender las células en 1 mL de PBS 1 x. Coloque el tubo en hielo.</li>
	<li>Añadir 3 mL de helado etanol (EtOH) a un tubo cónico de 15 mL. Tubo de vórtice de EtOH suavemente en posición low.<ol>
<li>Usando una P1000, lentamente (1 gota por segundo) por goteo pez cebra embrión suspensión celular en EtOH al Vortex suavemente.</li>
		<li>Agregar un total de 1 mL de la suspensión de células de embrión, para una solución de fijación final de 75% EtOH.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después 1 mL de células suspensión ha sido añadido, suavemente tubo de remolino de la mezcla y a-20 ° C durante al menos 1 h. Se recomienda colocar los tubos en su parte para garantizar la máxima superficie a cociente del volumen y reducir el número de embriones y células que pegan. Almacenar las células del embrión a-20 ° C durante 2-3 semanas.</li>
</ol>4. tinción de DNA y FACS clasificación de embriones
Nota: Esta sección del protocolo está diseñada para los embriones en 1 PD.
<ol><li>Eliminar células de embrión de EtOH-fijo de-20 ° C y centrifugar a 4 ° C 1500 x g durante 5 minutos.<ol>
<li>Coloque el tubo en hielo y cuidadosamente eliminar sobrenadante. Usando una P1000, resuspender suavemente las células en 1 mL de recién preparado frío PBS-BSA (1 x PBS, seroalbúmina bovina al 1%).</li>
		<li>Centrifugar las células a 4 ° C y 1500 x g durante 5 minutos y coloque en hielo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eliminar sobrenadante y resuspender las células en yoduro de propidio (PI) solución (50 μg/mL PI, 100 μg/mL Rnasa A, PBS, pH 7.0), la coloración utilizando 200 μL para cada 1000 embriones.<ol>
<li>Permitir a las células para incubar en la solución de PI por 30 min en hielo, mezclar suavemente cada 5 min.</li>
		<li>Coloque un colador de célula de nylon de 40 μm en un tubo cónico de 50 mL en hielo. Pipetee suavemente las células para mezclar y filtrar a través de la malla. Nota: Si tubos múltiples embriones desde el mismo punto fueron recopilados en el artículo 3 del Protocolo, se combinan estos embriones en este momento para que todos ellos se ordenan juntos.</li>
		<li>Suavemente con el plano en el extremo de un émbolo interno, interrumpir cualquier grupos restantes de las células de la malla.</li>
		<li>Enjuague las células a través del filtro con 500 μl de PBS-BSA frío para cada 1000 embriones.</li>
		<li>Coloque una malla de 40 μm en un tubo cónico de 15 mL en hielo y filtre la suspensión de la célula del tubo cónico de 50 mL una segunda vez en el tubo de 15 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizando una celda correspondiente instrumento de ordenación, establezca la excitación láser detección 561 nm y emisión a 610/20 para detectar yoduro de propidio.<ol>
<li>Tubo de mezcla 15 mL de células brevemente por el vórtex y coloque en instrumento a 4 ° C.</li>
		<li>Tasa de ejecución las células a un flujo lento, idealmente de 1.0 mL/min, con el fin de obtener un perfil de ciclo celular limpio y evitar mezclar G1 o G2/M las células con la S fase población.</li>
		<li>En primer lugar, la puerta de la FSC-A x SSC-(área de dispersión hacia delante por la zona de dispersión lateral) para eliminar desechos (figura 1A). Nota: Las células de los embriones pueden variar tamaños dependiendo del tipo de etapa y de la célula. El filtro de densidad neutra (ND) puede necesitar ser cambiado entre 1.0 y 1.5 dependiendo del tamaño de las células presentes. Un área grande para recoger la mayoría de las células y eliminar los desechos de la puerta.</li>
		<li>Segunda, puerta para SSC-área (SSC-A) de área de PI (PI-A), para eliminar desechos y células dobletes (figura 1B).</li>
		<li>En tercer lugar, la puerta para SSC-A por SSC-W (ancho) para eliminar cualquier resto dobletes de la célula (figura 1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mostrar las poblaciones cerradas en un histograma con numero de celular (cuenta) en el área de yoduro de eje y de propidio (PI-A) en el eje x. 24 embriones de hpf, esto debe dar un perfil estereotipado ciclo celular como en la figura 1.<ol>
<li>Para clasificar la población de fase S, encuentra la puerta del lado derecho del pico G1 a la izquierda de la cima del G2, incluyendo sólo una cantidad mínima de la G1 y G2. 24 embriones de hpf, esto típicamente abarcará unos 10-15% de la población cerrada (ver figura 1).</li>
		<li>Para clasificar la población de G1, fijar la puerta en el lado izquierdo del pico G1, no para pasar la parte superior del pico. Ajustar el ancho de la puerta de G1 tan estrecha como sea posible (ver figura 1).</li>
		<li>Nuevo puerta el G1 y S fase poblaciones para asegurar la correcta inicial bloquea (Figura 1E).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ordenar las poblaciones de fase G1 y S en tubos cónicos de 15 mL con 3 mL de PBS-BSA. El objetivo debe ser obtener entre 500.000 y 1 millón o más de células clasificadas por fracción (fase G1 y S).</li>
	<li>Vez finalizada la clasificación, centrifugar los tubos a 1500 x g y 4 ° C durante 10 minutos. Nota: El precipitado de células pequeña será difícil de ver y es importante evitar distorsionarlo, use preferentemente un rotor oscilante de cubo sobre un rotor de ángulo fijo.</li>
	<li>Cuidadosamente Quite el sobrenadante y resuspender el pellet con 1 mL de PBS 1 x. Transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL y centrifugar a 6.000 x g y 4 ° C durante 5 minutos.</li>
	<li>Quitar todo el líquido del tubo y congelar pellet seco a-20 ° C. Guardar el sedimento a-20 ° C durante 2-3 semanas.</li>
</ol>5. extracción de ADN, RNasa tratamiento y purificación de DNA
<ol><li>Quitar el sedimento celulares del-20 ° C y en hielo.<ol>
<li>Añadir 400 μL de tampón de SDS (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.5% SDS) de pellets y resuspender.</li>
		<li>Añadir proteinasa K a una concentración final de 0,2 mg/mL y mezclar con un vórtex brevemente.</li>
		<li>Incubar las muestras a 56 ° C por 2 h, vortex cada 15 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de 2 h, realizar extracción de fenol-cloroformo al añadir 400 μL de fenol-cloroformo (25:24:1 Alcohol fenol: cloroformo: isoamílico, saturado con 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA).<ol>
<li>Vortex para 20 muestra s y centrifugar a 16.000 x g durante 5 min separar las fases.</li>
		<li>Retire con cuidado la fase acuosa superior (400 μL) y transfiéralo a un tubo de 1,5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar EtOH precipitación mediante la adición de 40 μl de acetato de sodio de 3 M (pH 5,2), 2 μl de glucógeno y 1 mL de EtOH.<ol>
<li>Vortex para mezclar bien y colocar a-20 ° C durante la noche para precipitar el ADN. Muestra también puede precipitar a-80 ° C o en hielo seco durante 1 hora.</li>
		<li>Muestra de centrifugar a 4 ° C y 16.000 x g por 30 min a pellet de DNA.</li>
		<li>Descartar sobrenadante y lavar pellet con 1 mL 70% EtOH. Centrifugar a 4 ° C y 16.000 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Deseche el pellet flotante y secado al aire a temperatura ambiente durante 2-3 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Disolver los pellets en 96 μl de agua esterilizado y añadir 4 μL de Rnasa A (2 mg/mL).<ol>
<li>Mezclar bien todo con un vórtex e incubar a 37 ° C durante 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Realizar extracción de fenol-cloroformo añadiendo 100 μl de fenol-cloroformo y procedimiento en pasos 5.2.1 - 5.2.2.</li>
	<li>Realizar EtOH precipitación agregando 10 μl de acetato de sodio de 3 M y 1 glucógeno μl 250 μl de EtOH y siguiendo el procedimiento de pasos 5.3.1 - 5.3.5.</li>
	<li>Resuspender el precipitado en 60 μL de buffer TE (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA (pH8.0)) y determinar la concentración de ADN usando un método basado en la fluorescencia cuantitativo. Tienda ADN a-20 ° C. Nota: Es importante cuantificar el ADN utilizando tintes de enlace de ADN basado en la fluorescencia, o por otros medios más fiables que los métodos basados en el espectrómetro de UV.</li>
</ol>6. preparación de las bibliotecas de DNA y secuencia de la generación siguiente
Nota: Una muestra de referencia número G1 copia para cada fuente biológica es necesaria para cada ejecución de la secuencia (es decir, WT, mutantes, transgénicos, células, etcetera). Comparar todas las muestras de fase S de la misma fuente biológica en la misma secuencia a la misma referencia de G1. Funcionamiento biológico al menos dos réplicas de cada muestra para asegurar la consistencia entre las muestras.
<ol><li>Diluir 1 μg de ADN en un volumen final de 50 μl y transfiéralo a un tubo especializado de sonicación.</li>
	<li>Esquileo de ADN genómico de un objetivo de 250-300 bp en un ultrasonicador enfocada, según las especificaciones del fabricante y protocolo.</li>
	<li>Verificar la calidad y el tamaño de la DNA genomic esquilada usando una máquina de electroforesis automatizada, según las especificaciones del fabricante y protocolo. Asegurar que hay un gran pico de 250-300 bp para la DNA genomic esquilado.</li>
	<li>Preparar las bibliotecas de la secuencia usando un kit de preparación de biblioteca de DNA con oligos multiplex para secuenciación en plataforma Illumina, según protocolo del fabricante.</li>
	<li>Verificar la calidad de la preparación de la biblioteca utilizando electroforesis automatizada máquina, según protocolo del fabricante. Asegurar que hay un gran pico de ~ 400-450 bp, y hay picos mínimos de dímeros de primer (80-85 bp) y dímeros de adaptador (~ 120 bp).</li>
	<li>Cuantificar las bibliotecas usando un kit de cuantificación de biblioteca de ADN para secuenciación de ADN de próxima generación, según protocolo del fabricante.</li>
	<li>Diluir 15 μl de biblioteca a una concentración de 5 nM y se combinan multiplexado bibliotecas según sea necesario para lograr la deseada únicamente asignación Lee cuentas por muestra. Nota: El número de la única asignación de lecturas por muestra determinará la resolución. Uso tan sólo 5 millones asignados Lee evaluar la sincronización de replicación para el genoma del pez cebra. Se recomienda comenzar con 10 millones de lecturas.</li>
	<li>Realizar secuencia de la DNA de emparejado-final 100 bp todo el genoma de las muestras en una plataforma de secuenciación de última generación, según las instrucciones del fabricante.</li>
</ol>7. Análisis de los datos de la secuencia
Nota: Las instrucciones de esta sección están diseñadas como una guía para el análisis. Utilizar métodos adicionales para la alineación de la secuencia, filtrado, procesamiento, etcetera. Esta sección del protocolo tratará con el método de análisis en este trabajo. Si se utilizan métodos adicionales, ajustar los parámetros y funciones para esos fines. Los siguientes comandos se ingresan en Ubutnu o Mac terminal, con los correspondientes paquetes instalados.
<ol><li>Obtener las versiones más recientes del genoma del pez cebra (danRer10, a partir de cuando fue escrito este protocolo) del browser del genoma UCSC utilizando los siguientes comandos: wget ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10.fa.gz<ol>
<li>Descomprima el archivo fa.gz con el siguiente comando: gunzip danRer10.fa.gz</li>
		<li>Alinear datos de secuenciación genoma usando BWA-mem utilizando los siguientes comandos: BWA mem -t 8 danRer10.fa read_1.fastq read_2.fastq > output.sam</li>
	</ol>
</li>
	<li>Convertir archivo .sam en archivo de .bam mediante samtools con el siguiente comando: samtools ve -bS input.sam > output.bam<ol>
<li>Ordenar los archivos de secuencias alineadas con samtools con el siguiente comando: samtools clasificar output.bam > output_sorted.bam</li>
		<li>Índice del archivo de .bam con samtools con el siguiente comando: samtools índice output.bam</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mark PCR duplica con Picard utilizando los siguientes comandos: Java-Xmx2g-jar picard.jar MarkDuplicates \ Input=Input.BAM OUTPUT=output.BAM REMOVE_DUPLICATES = false METRICS_FILE=output_metrics.txt</li>
	<li>Generar archivos de texto (.txt) de lecturas para cada cromosoma usando el siguiente comando: para i en {1.25}; hacer CHROM = "chr" $i; echo $CHROM; samtools ve input.bam $CHROM | Cut -f 2,4,5,7,8,9 > readsChr$ {i} .txt; hecho Nota: Las columnas en el archivo .txt que son bandera, ubicación, mapQ, par chr, par localización y tamaño del fragmento, respectivamente.</li>
	<li>Leer archivos .txt en Matlab (o cualquier otro software similar) utilizando la función textscan.<ol>
<li>Filtrar mapas baja calidad Lee estableciendo un umbral mapQ de 30.</li>
		<li>Quitar Lee con banderas para alineación no primaria, duplicados PCR o asignación de par a un cromosoma diferente.</li>
		<li>Filtrar cualquier Lee con su pareja más allá de un umbral de distancia de 2000 bp.</li>
		<li>Evaluar estadísticas de Lee resultante para determinar número de leerlas estadísticas, cobertura, insertar tamaño y calidad (figura 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinar leer cobertura en 100 ventanas de bp fijada para cada muestra contando el número de lecturas en intervalos de 100 bp a lo largo de cada cromosoma.<ol>
<li>Calcular que la mediana Lee cuenta para todas las ventanas.</li>
		<li>Filtrar las regiones de alta cobertura mediante la eliminación de windows mayores que 5 desviaciones estándar de la mediana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Definir regiones para su análisis en las muestras de referencia de G1 por encontrar segmentos a lo largo de cada cromosoma con 200 lecturas con ventanas correderas.<ol>
<li>Determinar la profundidad de lectura en cada muestra de fase S contando el número de lecturas de fase S en las ventanas de lectura 200 cuenta definidos para la referencia de G1 que lo acompaña.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Suavizar los datos en bruto utilizando la función csaps en el software, con un factor de interpolación (p) de 10-16.</li>
	<li>Normalizar datos alisados a puntaje z con media 0 y desviación estándar de 1.</li>
</ol>

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<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Pez cebra proporcionan un sistema de modelo nuevo y único en vivo para el estudio de sincronización de replicación de ADN. Cuando se realizan cruzamientos programados como detallado en este protocolo experimental, miles de embriones pueden ser colectados en un solo día para experimentos. Estos embriones se desarrollan sincrónicamente precisamente tiempo y claramente caracterizado etapas de desarrollo. Pez cebra puede ser fácil y precisa puesta en escena por morfología mediante un estereomicroscopio, como embrion...

Para que las células dividir con éxito, debe en primer lugar con precisión y fielmente replican su genoma completo. Duplicación del genoma ocurre en un patrón reproducible, conocido como ADN replicación sincronización programa1. Sincronización de replicación del ADN se correlaciona con la organización de la cromatina, las marcas epigenéticas y gene expression2,3. Cambios en la sincronización de replicación se producen en todo el desarrollo y son programas relacionados significativamente conexos transcripcional y alteraciones en la cromatina marcas y organización4,5. Además, sincronización de replicación se correlaciona con frecuencias mutacionales, y cambios en el momento se observan en varios tipos de cáncer6,7,8. A pesar de estas observaciones, los mecanismos y determinantes de la regulación y establecimiento de tiempos de replicación son todavía en gran parte desconocidos y el papel desempeña en el desarrollo y la enfermedad es indeterminada. Además, hasta hace poco la replicación del genoma sincronización los cambios que ocurren a lo largo del desarrollo de vertebrados sólo se examinó en modelos de cultivo celular.
Pez cebra, Danio rerio, son adecuados para el estudio de replicación sincronización en vivo durante el desarrollo, como un solo par de acoplamiento puede producir cientos de embriones que se desarrollan rápidamente con muchas similitudes al desarrollo mamífero9, 10. Además, a lo largo del desarrollo del pez cebra, hay cambios en el ciclo celular, organización de la cromatina y programas transcripcionales que comparten relaciones de sincronización de replicación de ADN11. Pez cebra también son un excelente modelo genético, ya que son particularmente susceptibles a la manipulación por transgénesis, mutagénesis y mutaciones dirigidas y pantallas genéticas han identificado muchos genes necesarios para el desarrollo de vertebrados12. Por lo tanto, pez cebra puede utilizarse para identificar genes implicados en el mantenimiento y establecimiento de tiempos de replicación y observar los efectos de la desregulación de sincronización de replicación en el desarrollo de vertebrados. Líneas transgénicas pueden utilizarse también para evaluar la sincronización de replicación de tipos de células individuales aisladas en diferentes puntos de tiempo del desarrollo o en condiciones de enfermedad. Lo importante, hay varios modelos de pez cebra de la enfermedad humana que puede utilizarse para investigar la función de sincronización de replicación en enfermedad formación y progresión9,13,14.
Recientemente, se obtuvieron los perfiles de sincronización de replicación primera de pez cebra, estableciendo como sistema modelo para estudiar la replicación sincronización en vivo15. Para lograr esto, se obtuvieron células de embriones de pez cebra en varias etapas de desarrollo y en un tipo de células aisladas de pez cebra adulto. Las células fueron después ordenadas por FACS (clasificación celular activado por fluorescencia) basado en el contenido de DNA para aislar a poblaciones de fase G1 y S. Usando la muestra G1 como un control de número de copia, copia número variaciones en las poblaciones de fase S eran determinadas y deducir replicación relativo tiempo16. Cambios en la sincronización de replicación entonces se pueden comparar directamente entre diferentes muestras de desarrollo y tipos de la célula y esto fue utilizada para determinar cambios en la sincronización de replicación que se producen en vivo a lo largo del desarrollo de vertebrados. Este método ofrece varias ventajas sobre otros métodos genómicos, principalmente que no requiere de etiquetado con análogos de la timidina o inmunoprecipitación de ADN4,6.
Aquí está detallada de los protocolos de sincronización de replicación de ADN perfil genoma en alta resolución en el pez cebra. Estos protocolos se han utilizado para determinar las relaciones con las características genómicas y epigenéticas en el genoma del pez cebra, así como cambios en estas relaciones que se producen en todo el desarrollo de perfiles. Estos protocolos se adaptan fácilmente para estudiar cambios en la sincronización de replicación en cepas mutantes de pez cebra y en modelos de la enfermedad. Además, estos métodos proporcionan una base que puede ser ampliada a estudiar sincronización de replicación en tipos celulares específicos, primero clasificar los tipos de la célula individual del pez cebra. El pez cebra puede servir como un excelente en vivo sistema modelo para estudiar el tiempo de replicación y finalmente revelar las funciones biológicas de este importante rasgo de la epigenética.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>EMD Millipore</td><td>MMX00701</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>10165921001</td><td>solución de proteasa</td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (EtOH)</td><td>KOPTEC</td><td>V1016</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>Yoduro de propidio (PI)</td><td>Invitrogen</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9844</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-24950</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>fenol:Cloroformo</td><td>Sigma</td><td>P3803-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>J.T.Baker</td><td>3470</td><td></td></tr><tr><td>Glucógeno</td><td>Ambion</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>RNasa A</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Quanit-iT</td><td>Invitrogen</td><td>Q33130</td><td>Reactivos para la cuantificación de ADN basada en fluorescencia</td></tr><tr><td>Covaris AFA microTUBE</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>tubo especializado para la sonicación</td></tr><tr><td>Covaris E220 Sonicator</td><td>Covaris</td><td>E220</td><td>ultrasonido focalizado</td></tr><tr><td>Agilent 4200 Tapestation</td><td>Agilent</td><td>G2991AA</td><td>máquina de electroforesis automatizada</td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td>Reactivos para máquina de electroforesis automatizada</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra Kit de preparación de bibliotecas de ADN para Illumina</td><td>NEB</td><td>Cat#E7370L</td><td>Kit de preparación de bibliotecas de ADN</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos Kit para Illumina (Juego de cebadores de índice 1)</td><td>NEB</td><td>Cat#E7335S</td><td>Oligonucleótidos multiplex para el kit</td></tr> <tr><td>de preparación de bibliotecas de ADNNEBNext Multiplex Oligos Kit para Illumina (Index Primers Set 2)</td><td>NEB</td><td>Cat#E7500S</td><td>Oligos multiplex adicionales para el kit de preparación de bibliotecas de ADN</td></tr><tr><td>NEBNext Library Quant Kit para Illumina</td><td>NEB</td><td>E7630L</td><td>kit de cuantificación para la preparación de bibliotecas</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP abalorios</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>perlas magnéticas</td></tr><tr><td>Illumina HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td>SY&ndash; 401 y ndash; 2501</td><td>plataforma de secuenciación de ADN de próxima generación</td></tr><tr><td>40 &micro; m Falcon Filtro de celdas de nylon</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>VWR Placa de Petri Desechable 100 x 25 mm</td><td>VWR</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 6,0 mL para Nichiryo Modelo 8100</td><td>VWR</td><td>89078-446</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Posi-Click, 1,7 mL, color natural</td><td>Denville Scientific</td><td>C2170 (1001002)</td><td>Libre de dnasa/rnasa</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Botellas de lavado</td><td>VWR</td><td>16650-022</td><td>Polietileno de baja densidad,</td></tr><tr><td>colador</td> de boca ancha <td>VWR</td><td>470092-440</td><td>6,9 cm, malla</td></tr><tr><td>fina Tanque de corsado Tanque de cría</td><td>ZHCT100</td><td>acuanear</td><td></td></tr><tr><td>iSpawn</td><td>Techniplast</td><td>N/A tanque</td> de <td>cría grande</td></tr><tr><td>FACSAria II</td><td>BD biosciences</td><td>N/A</td><td>máquina clasificadora de células</td></tr><tr><td>Wild M5a estereomicroscopio</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>N/A</td><td>microscopio de disección</td></tr><tr><td>Qubit 3 Fluorómetro Thermo</td><td>Scientific</td><td>Q33216</td><td>método cuantitativo basado en fluorescencia para determinar la concentración de ADN</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>versión 2017a</td><td></td></tr><tr><td>Matlab Statistics Toolbox</td><td>Mathworks</td><td>versión 11.1</td><td></td></tr><tr><td>Matlab Curve Fitting Toolbox</td><td>Mathworks</td><td>versión 3.5.5</td><td></td></tr></tbody></table>

perfiles de sincronización de replicación de adn utilizando el pez cebra como un sistema de modelo en vivo

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Sincronización de replicación de ADN es una característica celular importante, exhibiendo las relaciones significativas con tasas de mutación de ADN, la transcripción y la estructura de la cromatina. Cambios en la sincronización de replicación se producen durante el desarrollo y en el cáncer, pero la sincronización de replicación de papel desempeña en el desarrollo y la enfermedad no se conoce. Pez cebra recientemente se establecieron como un sistema de modelo en vivo para el estudio de tiempo de replicación. Aquí está detallada de los protocolos mediante el pez cebra para determinar tiempo de replicación de ADN. Después de clasificar las células de embriones y pez cebra adulto, alta resolución genoma ADN replicación sincronización los patrones pueden construirse mediante la determinación de cambios en el número de copias de ADN a través del análisis de datos de secuenciación de próxima generación. El sistema de modelo de pez cebra permite la evaluación de los cambios de sincronización de replicación que se presentan en vivo en todo el desarrollo y también puede utilizarse para evaluar los cambios en tipos de células individuales, modelos de la enfermedad o las líneas mutantes. Estos métodos le permitirá investigar los mecanismos y determinantes de la replicación sincronización establecimiento y mantenimiento durante el desarrollo de los estudios, la sincronización de replicación de papel desempeña en mutaciones y tumorigenesis y los efectos de perturbar sincronización de replicación en el desarrollo y la enfermedad.

Usando datos de sincronización de replicación publicado, perfiles de sincronización de replicación representativos y las medidas de control de calidad disponen de15. Los primeros pasos del proceso implican alinear los datos de la secuencia el genoma, cálculo de longitud leer y estadísticas de cobertura del genoma y filtrado de baja calidad, desapareado, y Lee duplicado de PCR. Estadísticas de lectura de una muestra de la secuencia típica de pez cebra se muestran en...

Pez cebra han utilizado recientemente como un sistema de modelo en vivo para el estudio de tiempo de replicación del ADN durante el desarrollo. Aquí está detallada de los protocolos para el uso de embriones de pez cebra para sincronización de replicación de perfil. Este protocolo puede ser fácilmente adaptado para el estudio de la sincronización de replicación en mutantes, tipos de células individuales, modelos de la enfermedad y otras especies.

Perfiles de sincronización de replicación de ADN utilizando el pez cebra como un sistema de modelo en Vivo

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

El objetivo general de este procedimiento es generar mapas de tiempo de replicación del ADN del genoma completo de embriones de pez cebra en diferentes etapas de desarrollo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos del ciclo celular y la biología de la cromatina, como cómo los cambios en la cromatina que se producen durante el desarrollo embrionario pueden afectar el inicio de las horquillas de replicación del ADN. La principal ventaja de esta técnica es que mapea los cambios de replicación que ocurren in vivo en etapas definidas del desarrollo embrionario.Aunque este método puede proporcionar información sobre cómo cambia la replicación del ADN durante el desarrollo del pez cebra, también se puede aplicar a otros sistemas u organismos modelo, como tunicados, ranas y moscas. En general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque se necesita algo de práctica para generar suspensiones unicelulares a partir de embriones de pez cebra. La noche antes de que se recolecten los embriones, coloque docenas de adultos reproductores en tanques de cría, utilizando aproximadamente el mismo número de machos y hembras.Dependiendo del experimento,

profiling-dna-replication-timing-using-zebrafish-as-an-vivo-model

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Pez cebra representan un modelo vertebrado poderosa que ha sido infrautilizado para estudios metabólicos. Aquí se describe una forma rápida para medir...

Análisis del perfil metabólico de embriones de pez cebra

A continuación, presentamos un enfoque sistemático para desarrollar fisiológicamente relevante, sensible y...

En Vivo Modelado del Genoma Humano Morbid usando Danio rerio

PCR combinada con el análisis de fusión de alta resolución (HRMA) se demuestra como un método rápido y eficiente para determinar el genotipo de pez cebra.

Rápido y Eficiente de pez cebra Genotipado Utilizando PCR con análisis del derretimiento de alta resolución

El pez cebra es un poderoso sistema modelo para la biología del desarrollo y la investigación de enfermedades humanas debido a su similitud genética con los vertebrados superiores. Este protocolo describe una metodología para crear embriones haploides de pez cebra que se pueden utilizar para estrategias de detección directa para identificar mutaciones recesivas en genes esenciales para la embriogénesis temprana.

La producción de embriones de pez cebra mediante haploide<em&gt; In Vitro</em&gt; Fertilización

Los niveles de proteína en células y tejidos son a menudo estrechamente regulada por el equilibrio de la producción y eliminación de proteínas. Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP), la cinética de eliminación de proteínas pueden ser medidos experimentalmente in vivo.

Medición de la estabilidad de proteínas en la sala de embriones de pez cebra Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP)

La mitosis es crítica para todo organismo vivo y los defectos a menudo conducen al cáncer y trastornos del desarrollo. Utilizando este protocolo de imagen y el pez cebra como sistema modelo, los investigadores pueden visualizar la mitosis en un organismo vertebrado vivo y la multitud de defectos que surgen cuando los procesos mitóticos son defectuosos.

La observación de la división mitótica y dinámica en un embrión de pez cebra en vivo

Pez cebra se han utilizado como organismos modelo genética fiable en la investigación biomédica, especialmente con el advenimiento de las tecnologías de edición de gene. Cuando se esperan fenotipos larvales, identificación de extracción y genotipo de ADN puede ser difícil. Aquí, describimos un procedimiento eficiente de genotipado para larvas de pez cebra, por cola de recorte, tan pronto como 72 h post fertilización.

Extracción de ADN de alto rendimiento y genotipificación de 3dpf larvas de pez cebra por recorte de aleta

Las propagaciones de superficies nucleares son una herramienta indispensable para estudiar los eventos cromosómicos durante la meiosis. Aquí demostramos un método para preparar y visualizar cromosomas meióticos durante la profase I a partir de espermacitos de peces brabra.

Preparación de las propagaciones del cromosoma meiótico a partir de espermacitos de peces cebra

La regeneración del músculo esquelético es impulsada por las células madre musculares residentes en el tejido, que se ven afectadas en muchas enfermedades musculares, como la distrofia muscular, y esto resulta en la incapacidad del músculo para regenerarse. Aquí, describimos un protocolo que permite el examen de la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular.

Examinando la regeneración muscular en modelos de pez cebra de enfermedad muscular

Este artículo describe un protocolo para el monitoreo espaciotemporal rápido y eficiente de la metilación de citosina normal y aberrante dentro de embriones intactos de pez cebra.

Monitorización espaciotemporal rápida y eficiente de la metilación normal y aberrante de la citosina en embriones intactos de pez cebra

Las rasopatías son síndromes genéticos multisistémicos causados por la hiperactivación de la vía RAS-MAPK. Las variantes potencialmente patógenas que están a la espera de validación surgen continuamente, mientras que la escasa evidencia preclínica limita el tratamiento. Aquí, describimos nuestro protocolo in vivo para probar y validar los niveles de activación de ERK asociados a RASopatía y su modulación farmacológica durante la embriogénesis mediante imágenes FRET en vivo en pez cebra...

Un protocolo eficiente para evaluar la modulación de la actividad de ERK en modelos tempranos de síndrome de Noonan de pez cebra mediante microscopía FRET en vivo e inmunofluorescencia

Aprende a generar mapas de sincronización de replicación de ADN en embriones de pez cebra en diferentes etapas del desarrollo. Este método permite estudiar cambios en la cromatina y su impacto en la iniciación de la replicación.

Perfiles de sincronización de replicación de ADN utilizando el pez cebra como un sistema de modelo en Vivo

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