Optimización de un análisis de la expresión Multiplex basados en ARN usando Material de archivo de cáncer de mama

Este método está optimizado con éxito para clasificar a las pacientes con cáncer de mama en grupos terapéuticos conocidos y no conocidos. La alta sensibilidad de este ensayo identifica muestras heterogéneas que pueden estudiarse más a fondo mediante microdisección láser. La principal ventaja del ensayo multiplex basado en ARN es la reproducibilidad de los resultados utilizando hematoxilina y material de archivo teñido con formalina fijado en parafina que permite salidas de alta resolución y validación de biomarcadores.

Prepare el tejido como se describe en el protocolo de texto. Para comenzar la disección, establezca los límites del portaobjetos y calibre el movimiento de la platina del microscopio. Ahora escanee los portaobjetos de membrana manchados con el objetivo 4X.

Seleccione y rodee las áreas objetivo para la microdisección en el portaobjetos de membrana. Lleve un registro del área total. Se necesitan al menos 42 milímetros cuadrados para un análisis adecuado del ARN posterior.

A continuación, inicie el corte por láser con los parámetros definidos. A continuación, utilice el mecanismo de elevación de la tapa para recuperar la sección diseccionada y colocar la sección en la tapa del difusor de un tubo etiquetado unido a un apéndice mecánico. Si la sección diseccionada no se recupera en la tapa, repita la disección del área objetivo.

La precisión de la microdisección es un paso crítico y siempre se debe asegurarse de que el área microdiseccionada presente en el capuchón coincida con la imagen marcada y escaneada. Recoja tantas secciones de tejido como desee, cada una en un tubo separado, luego proceda con el lisado de las muestras de tejido. Para la lisis, aplique 2,4 microlitros de solución homogeneizante pre milímetro cuadrado de área de tejido en cada muestra, luego agite las muestras durante 10 segundos a la velocidad máxima.

A continuación, centrifugar las muestras durante cinco segundos a 2.500 g. A continuación, transfiera las muestras a tubos de 1,5 mililitros si es necesario, y colóquelas en un bloque calefactor agitador a 65 grados centígrados. Agítalos a 600 rpm durante 12 a 18 horas.

A continuación, centrifugar los lisados a 21.000 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Recoja cuidadosamente el sobrenadante transparente en un tubo nuevo etiquetado. Evite transferir fragmentos de tejido.

Los sobrenadantes se pueden almacenar a menos 80 grados centígrados. Después de preparar todos los reactivos para el ensayo basado en hibridación, cargue hasta 90 pocillos de una placa de separación magnética de 96 pocillos con homogeneizado de tejido de 25 microlitros. Cargue 25 microlitros de muestras de control en tres pocillos designados y cargue una solución homogeneizadora de 25 microlitros en tres pocillos como blancos.

A continuación, selle la placa de separación magnética con un sello de presión de plástico transparente y coloque la placa en una incubadora a 54 grados centígrados durante 18 a 22 horas con agitación. Al día siguiente, monte y bloquee la placa en una arandela de placa magnética de mano, luego retire el sello de presión y espere un minuto para que las cuentas magnéticas se asienten. Ahora realiza un lavado.

Drene el plato sobre un fregadero y use un papel de seda para secarlo suavemente, luego cargue todos los pocillos con 100 microlitros de tampón de lavado 1X y espere 15 segundos. Repite este proceso tres veces para completar el paso de lavado. Después de eliminar el último lavado, vuelva a cargar los pocillos con 50 microlitros del reactivo del preamplificador, luego selle la placa con un sellador de placas de aluminio y agite la placa a 800 rpm durante un minuto a temperatura ambiente.

Luego continúe agitando el plato a 50 grados centígrados durante una hora. Una vez completado, realice otro paso de lavado. A continuación, vuelva a cargar los pocillos con 50 microlitros del reactivo amplificador, selle la placa con un sello de placa de aluminio y repita la incubación agitada de un minuto a temperatura ambiente seguida de una hora a 50 grados centígrados, seguida de otro paso de lavado.

Ahora agite la sonda de etiquetas durante 10 segundos a máxima velocidad y luego agregue 50 microlitros de sonda de etiquetas a cada pocillo. A continuación, vuelva a sellar la placa y repita la incubación agitada como antes, seguida de otro paso de lavado. A continuación, cargue los pocillos con 50 microlitros de ficoeritrina Streptavidin recién mezclada, luego realice una incubación agitada a temperatura ambiente a 600 rpm, seguida de un paso de lavado con tampón de lavado Streptavidin.

Después de completar el paso de lavado, cargue cada pocillo con 100 microlitros de tampón de lavado Streptavidin y selle la placa con un sello de placa de aluminio, luego agite la placa a 800 rpm a temperatura ambiente durante tres minutos. Durante el último paso de incubación, ponga en marcha el analizador de perlas magnéticas y asegúrese de que el instrumento esté calibrado y de que se hayan realizado los protocolos de validación. En el software, agregue un nuevo análisis seleccionando Crear lote utilizando un protocolo existente en la pestaña Lotes.

A continuación, en el diseño de placa, designe los pocillos como desconocidos o en blanco y proporcione una etiqueta para cada uno en el panel Muestra. Ahora retire el sello de aluminio de la placa de reacción, expulse la bandeja del cargador de placas y cargue la placa en el analizador. A continuación, haga clic en Retract, luego en Run Batch para iniciar el analizador.

Después de la lectura, expulse la placa y limpie el analizador de perlas magnéticas según lo recomendado por el fabricante. Para el análisis, vaya a la pestaña Resultados del lote. Seleccione el archivo de análisis respectivo y use la opción de exportarlo como un archivo csv, luego cree promedios y puntajes brutos utilizando un software de hoja de cálculo.

Asegúrese de que los controles muestren las señales esperadas. Normalice los datos brutos de muestra y analice la distribución de datos utilizando una plataforma de ciencia de datos o utilizando algoritmos definidos para ejecutar un análisis de componentes principales. El rendimiento del lector de perlas multiplex y del ensayo es crítico, y la ejecución de diluciones en serie de muestras de control bien anotadas antes de las valiosas muestras de pacientes garantiza resultados correctos.

En Atributos, seleccione el subconjunto de datos genéticos normalizados y una variable nominal, como un subtipo de cáncer de mama. Aplique un algoritmo de clasificación entrenado y validado para caracterizar muestras desconocidas. El método descrito se ha aplicado para la medición simultánea de 40 transcripciones en material FFPE teñido con H&E, microdisecado y altamente degradado.

Con este método, es posible mostrar una caracterización precisa del estado del receptor y la expresión diferencial del marcador mesenquimal FN1 al comparar el tumor y el tejido de control emparejado en los diversos subtipos de receptores positivos y negativos. La heterogeneidad dentro de los tumores se puede caracterizar utilizando este método. Un tumor ER positivo exhibe una expresión diferencial espacial de FN1 dentro de áreas que muestran una morfología tumoral y una actividad mitótica distintas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir múltiples genes directamente a partir de lisados de tejidos después de la hibridación del ARN objetivo en perlas, amplificación de señales y cuantificación. La sensibilidad del ensayo permite el uso de material microdiseccionado con láser. Al intentar este procedimiento, es importante recordar calibrar el equipo antes de cada ensayo y determinar el rango de sensibilidad utilizando material de control de calidad antes de analizar muestras preciosas de pacientes.

El flujo de trabajo de los ensayos se adapta fácilmente a los laboratorios clínicos. El perfil de ARN de hasta 90 muestras se puede realizar en 12 horas durante dos días. Medir el estado de los receptores del cáncer de mama en un laboratorio de patología lleva mucho tiempo y requiere patólogos experimentados.

El uso de este ensayo digitalizado basado en perlas multiplex cuantifica la expresión de ARN con precisión. El análisis de biomarcadores fraccionados en biopsias en un diagnóstico primario es una presentación del tumor. El uso de esta metodología con un panel de biomarcadores más amplio y también la utilización de secciones completas identifica muestras heterogéneas.

El desarrollo de ensayos utilizando esta metodología es versátil y requiere una baja entrada de muestra. Las muestras incluyen muestras clínicas anotadas importantes para la validación de biomarcadores y también biopsias líquidas que son importantes para la vigilancia del paciente y el diagnóstico temprano.