Name: Optimización de un análisis de la expresión Multiplex basados en ARN usando Material de archivo de cáncer de mama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Aprende a optimizar un ensayo multiplex basado en ARN para clasificar cáncer de mama usando tejido de archivo fijado en formol. Este método permite analizar muestras degradadas con alta sensibilidad y reproducibilidad.

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El trabajo fue apoyado por (1) una beca de proyecto de la cáncer de mama (2014-2016) financiado por la acción de la Fundación de cáncer de mama y vivo 2013 a través de la investigación, innovación y desarrollo de confianza (RIDT) de la Universidad de Malta, (2) la Facultad de medicina Y cirugía, Universidad de Malta y (3) proyecto financiada por el Consejo de Malta para ciencia y tecnología a través de la fusión de la ley: la i+d tecnología desarrollo programa de 2016. La publicación de este manuscrito se apoya a través de la subvención de Jove-Luminex.

Aprobación ética para el uso de material de tejido de mama en este estudio se obtuvo de la Universidad investigación ética Comité (UREC) de la Universidad de Malta (Ref: 22/2012).
1. preparación de tejido
<ol><li>Mediante adecuados procedimientos H & E14, preparar referencia teñido de tejido y digitalmente, escanear diapositivas de referencia durante la microdisección.</li>
	<li>Con un micrótomo, corte secciones de tejidos de 20 μm en un baño de agua libre de ARNasa a 40 ° C. Recoger las secciones en las diapositivas de la membrana para Microdisección láser utilizando materiales y equipo limpio y descontaminado de Rnasa.</li>
	<li>Secar los portaobjetos de la membrana a 37 ° C en un incubador de secado durante la noche. La mancha utilizando el apropiado H & E procedimiento15 con soluciones de grado de biología molecular y aumentar el tiempo de tinción de hematoxilina a 6 min. Si es necesario, mancha las diapositivas de la membrana con el apropiado immunohistochemical protocolos16.</li>
</ol>2. Microdisección láser
<ol><li>Establecer los límites de la diapositiva y calibrar el movimiento de la etapa.<ol>
<li>Mover el punto de vista de láser en un área vacía de la diapositiva de la membrana. Calibrar el enfoque de láser disparando un láser dispararon aumentando intervalos de enfoque (5%) hasta que el láser comienza a perforar a través de la membrana. Drenaje y microdissect cualquier forma y afinar el foco del láser para maximizar la eficiencia del láser durante la disección del láser.</li>
		<li>Aumentar la velocidad de movimiento del escenario a un punto donde no se comprometa la eficacia de la disección de láser. Calibrar el laser en la lente del objetivo seleccionado y recalibrar si cambiar objetivos (láser velocidad de 1 – 15%), foco en el 70 – 75% y poder al 90-100% cuando se utiliza el objetivo de 4 X.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analizar los portaobjetos de tinción de membrana usando el objetivo 4 de X.</li>
	<li>Seleccionar y delimitar las zonas de microdissection de la diapositiva de la membrana. Láser diseccionar un área mínima de 42 mm2. Registro la zona disecada para determinar el volumen homogeneizante del tampón de muestra a utilizar.</li>
	<li>Utilizar el mecanismo de elevación de tapa para recuperar la sección disecada en las tapas de difusor de tubos etiquetados atado Apéndice correspondiente. Si no se recupera la sección disecada en la tapa, repita la disección del laser de la zona.</li>
</ol>3. tejido lisis
Nota: Varias soluciones y los materiales se suministran junto con kits de mencionado en la Tabla de materiales.
<ol><li>Prepare el volumen requerido de mezcla homogeneización para la lisis de la muestra mediante homogeneización solución y proteinasa K a una proporción de 60: 1.</li>
	<li>Pipetee 2.4 μL de homogeneizar la solución en cada tubo por cada 1 mm2 de área de tejido, vortex durante 10 s a velocidad máxima y centrifugar a temperatura ambiente durante 5 s a 2.500 x g.</li>
	<li>Incubar en un bloque de calentamiento a 65 ° C por 12 a 18 h con agitación a 600 rpm.</li>
	<li>Centrifugue los lisados a 21.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Usando una pipeta, cuidadosamente aspirar el sobrenadante y dispensar en un tubo etiquetado fresco. Evite aspirar los fragmentos de tejido de la membrana, esto puede reducir la calidad de los resultados.</li>
	<li>Guarde el sobrenadante en un congelador de-80 ° C.</li>
</ol>4. hibridación basada en análisis
<ol><li>Realice los siguientes preparativos.<ol>
<li>Caliente previamente la mezcla de lisis el frasco del reactivo en una incubadora a 37 ° C por 30 min y mezclar suavemente por inversión.</li>
		<li>Si los homogenados de tejido se congela, descongelar a temperatura ambiente e incubar a 37 ° C por 30 min vórtex las muestras a la velocidad máxima después de la incubación.</li>
		<li>La incubadora de agitación en 54 ° C y colocar la sonda del kit de validación de la temperatura en un pozo vacío de una placa de 96 pocillos. Después de 2 h Verifique la temperatura en el termómetro digital y ajuste la temperatura del delta de sacudir la incubadora para corregir cualquier diferencia de temperatura.</li>
		<li>Deshielo y agitar la punta de prueba sistema y bloqueo reactivo para 10 s, centrifugar a temperatura ambiente durante 5 s a 2.500 x g y mantener en hielo.</li>
		<li>Mantenga el frasco de proteinasa K en el hielo durante el uso.</li>
		<li>Someter a ultrasonidos los granos captura a 46 KHz durante 3 min., luego vortex a máxima velocidad por otros 3 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar una mezcla de grano de trabajo 25 μl por pocillo por ampliar en consecuencia los siguientes reactivos: 4.25 μl de agua libre de nucleasa, 16.65 μl de mezcla de lisis, 1.00 μl del bloqueo reactivo, 0.10 μl de proteinasa K, 0,50 μl de granos de la captura, 2.50 μl de sonda conjunto.</li>
	<li>Vórtice la mezcla de grano de trabajo durante 10 s a velocidad máxima, luego Pipetear 25 μL/pocillo a la placa de separación magnética.</li>
	<li>Pipetee 25 μl tejido homogeneizado a una placa de 96 pocillos de separación magnética y 25 μl solución para 3 pozos como los espacios en blanco de homogeneización.</li>
	<li>Sellar la placa de separación magnética con un sello de presión de plástico transparente y colocar la placa en la incubadora a 54 ± 1 ° C por 18 – 22 h agitando a 600 rpm.</li>
	<li>Preparar una solución 1 X wash buffer 24 pozos por 31,5 mL de libre de Rnasa de mezcla agua con 0,1 mL de lavado Tampón mL del componente 1 y 1,67 de componente de tampón de lavado 2.</li>
	<li>Retire la placa de la incubadora. Ajustar la temperatura de la incubadora agitación 50 ± 1 ° C.</li>
	<li>Montar la placa de separación magnética en la lavadora de la mano placa magnética y trábela en su lugar. Retire el sello de presión y espere 1 minuto para las bolas magnéticas resolver.</li>
	<li>Paso de lavado: Invierta la placa de separación magnética montada en el plato sobre el fregadero y la mancha blanca /negra suavemente sobre un papel para quitar la solución residual. Utilizando una pipeta multicanal añadir 100 μl de solución tampón de lavado 1 X en cada pozo y espera 15 s. Repita este paso para lavar la placa 3 veces.</li>
	<li>Pipetee 50 μl de reactivo previo a cada pocillo. Selle la placa con un sello de placa de aluminio y agitar la placa a 800 rpm durante 1 min a temperatura ambiente. Incubar durante 1 h a 50 ± 1 ° C agitando a 600 rpm.</li>
	<li>Repita el paso 4.9 (paso de lavado).</li>
	<li>Pipetee 50 μl del reactivo del amplificador a cada pocillo. Selle la placa con un sello de placa de aluminio y agitar la placa como en el paso 4.10.</li>
	<li>Repita el paso 4.9 (paso de lavado).</li>
	<li>Vórtice de la sonda de la etiqueta de 10 s a velocidad máxima. Añadir 50 μl de la sonda de etiqueta a cada pocillo. Tapar y agitar la placa (paso 4.10).</li>
	<li>Repita el paso 4.9 (paso de lavado).</li>
	<li>Vórtice ficoeritrina estreptavidina (SAPE) durante 10 s a velocidad máxima. Añadir 50 μl de SAPE a cada pocillo. Tapar y agitar la placa (paso 4.10).</li>
	<li>Repita paso 4.9 (paso de lavado) excepto usar el tampón de lavado SAPE en lugar del tampón de lavado.</li>
	<li>Añadir 130 μl de tampón de lavado SAPE a cada plato así y sellado con un sello de placa de aluminio. Agitar la placa a 800 rpm a temperatura ambiente durante 3 minutos.</li>
	<li>Puesta en marcha el analizador de grano magnético. Realizar la calibración y verificación, siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Establecer un protocolo en el analizador de grano magnético usando los siguientes parámetros: tamaño de la muestra: 100 μl; Puerta DD: 5.000 – 25.000; Tiempo de espera: 90 s; Región de evento/grano grano: 100; y haga clic en siguiente. Seleccione los números de cuentas respectivas en el panel y definir las regiones de grano con los genes respectivos destino indicado por el fabricante.</li>
	<li>Agregar un nuevo análisis seleccionando "crear lote utilizando un protocolo existente" desde la ficha de lotes . En el diseño de la placa designar los pozos como desconocido o en blanco, respectivamente y proporcionar una etiqueta para cada muestra en el Panel muestras .</li>
	<li>Retire el sello de placa de aluminio de la placa de 96 pocillos de reacción. Abrir la bandeja de la placa haciendo clic en el botón de expulsión , la placa de carga en el analizador de grano magnético. Haga clic en retractarse| Ejecutar por lotes para iniciar el analizador. Después de leer, expulse y retire la placa de 96 pocillos. Limpiar y cerrar el analizador de grano magnético según lo recomendado por el fabricante.</li>
</ol>5. Análisis de datos
<ol><li>En el lote| Ficha de resultados , seleccione el archivo de los análisis respectivos y haga clic en el botón exportar to.csv . The.csv abrir archivo usando un software de hoja de cálculo.</li>
	<li>Observar las cuentas de perla y omitir ningún resultado, < 40 granos/región.</li>
	<li>Promedio de los valores de los pocillos del blanco y calcular la desviación estándar (SD) y límite de detección (LOD) (espacio en blanco media + (3xSD)) por el gene de la blanco. Establecer los valores más bajo que el LOD como desapercibido. Nota: Si cualquiera de los valores de expresión normalización son detectado, mirar los datos de la muestra como inadecuada. Considerar valores de expresión más 20.000 como sobre el límite de sensibilidad superior. Los lisados de estas muestras deben diluirse y volver a analizar.</li>
	<li>Reste el promedio en blanco de los datos crudos por gene.</li>
	<li>Calcular la media geométrica de los genes de normalización seleccionados por muestra. Normalizar datos individuales de la muestra para la media geométrica respectiva.</li>
	<li>Análisis de datos en plataformas de ciencia de datos o utilizando algoritmos definidos.<ol>
<li>Importar los datos en la plataforma de la ciencia de datos haciendo clic en Agregar datos. Arrastre el archivo de datos en el Proceso de trabajo y conectar a un operador [Seleccionar atributos] , luego a un principales análisis de componentes (ACP) operador y luego al puerto de t resul.</li>
		<li>En el Atributo seleccionar operador seleccionar el subconjunto de datos de genética normalizada y una variable nominal como subtipo de cáncer de mama. Ejecutar el proceso haciendo clic en jugar. En la ficha gráficos seleccione la "dispersión de Color 3D" en el estilo de tabla y la variable nominal en el campo de Color . Evaluar la variabilidad de los datos PCA en una parcela de 3 dimensiones.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

El Invitrogen™ QuantiGene™ Plex es propiedad de Thermo Fisher Scientific.

Un análisis bDNA multiplex basados en grano fue optimizado para cuantificar la expresión génica en RNA degradado derivado de tejido de cáncer de mama FFPE y conductos de la mama normal. Optimizar el análisis, involucrados desarrollar un algoritmo para clasificar tumores de cáncer de mama en los subtipos luminales y basals utilizando 8 biomarcadores conocidos y potenciales 5 normalización de genes. Normalización de datos se realizó mediante permutaciones de los genes de normalización. La selección de los genes de normalización se basó en la mejor predicción del estado del receptor usando los genes de clasificador de Luminal Basal. Para clasificar los subtipos Luminal Basal de los tejidos FFPE, los genes de normalización seleccionados fueron Beta-actina (ACTB), gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) e hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT1).
El método puede adaptarse para el uso en otro diagnóstico y líneas de investigación tras la selección adecuada del conjunto de gene normalización. Una aplicación importante de este método en el sector de investigación es la medición de biomarcadores en material de archivo que está anotado bien con los resultados clínicos. Podría validar posibles marcadores predictivos en estudios retrospectivos, con rapidez y precisión y evitar estudios prospectivos a largo plazo en espera de datos de supervivencia global y supervivencia libre de enfermedad. Actualmente nuestro grupo está investigando el uso de la prueba para detectar receptores positivos exosomas, que requiere el desarrollo de un nuevo algoritmo que usa alternativo normalización de genes de normalización de datos. El uso de biopsias líquidas y ensayos de expresión genética sólida permitirá ensayos multiplex de alto rendimiento adaptados para el manejo de los pacientes durante el tratamiento y proporcionar un medio para seguir la eficacia del tratamiento, posibles recaídas debido a la resistencia a la terapia y la capacidad metastásica del tumor.
Este método también tiene una amplia gama de posibles aplicaciones en el diagnóstico de tumores y se adapta al actual flujo de trabajo diagnóstico. Las principales ventajas de este método en el área de diagnóstico incluyen: (1) la aplicación de ensayos de alto rendimiento, (2) excluyendo la subjetividad y resultados dudosos procedentes de medidas basadas en la imagen, (3) detección precisa de objetivos múltiples al mismo tiempo que mejorar la precisión y no minimizar el uso de preciosas muestras de pacientes y (4) requiere de instalaciones altamente especializadas y recursos humanos. El proceso de muestreo optimizada, junto con la entrada de material requerido para el ensayo multiplex basados en grano, permite más investigación de la heterogeneidad del tumor; mediante Microdisección láser para separar con precisión los focos múltiples de tejido maligno de la misma sección del paciente, es posible comparar varios genes entre ellos, así como con el tejido normal combinado (figura 4). Entrada material es vital para la aplicación de diagnóstico en las biopsias del tumor que proporcionan tejido tumoral limitada. La capacidad del ensayo para medir la expresión génica de muestras de RNA degradadas permite fácil transporte de las muestras para el análisis dentro de una institución o al servicio de los laboratorios. Además, análisis de la sección entera era también posible con H & E tinción de material (figura 1).
Para el éxito de este protocolo, es imprescindible: (1) asegurar el correcto muestreo del tumor sitio/s que son lisis para el análisis y (2) desarrollar bien optimizado y validado algoritmos de normalización de datos, para cada panel de expresión génica o el pronóstico individual o biomarcadores predictivos. El primero depende de la experiencia técnica del técnico/científico realizar el muestreo. Se recomienda tomar un núcleo adicional y preparar un microarray de tejido (TMA) en el mismo formato del ensayo multiplex grano magnético (formato de 96 pocillos). Esto proporcionará un archivo de sitios de tumor como una réplica de las muestras utilizadas para el análisis de RNA. TMAs también pueden ser evaluadas con otras técnicas de seguimiento investigación o validación de los resultados. El desarrollo de algoritmos de normalización es dependiente en el material investigado y los genes de normalización seleccionados para la normalización. Diferentes paneles de normalización de genes se seleccionan según el nivel y variabilidad de expresión en la muestra analizada y esto varía entre los tejidos de cáncer de distintos orígenes, exosomas de plasma o células tumorales circulantes. Validación del ensayo incluye muestra de procesamiento puesto que diversas preparaciones también resultará en algoritmos de normalización diferentes.
En Resumen, el uso de la tecnología bDNA en combinación con la tecnología magnética de grano y la selección del adecuado panel de genes diana, le proporcionará la ventaja de medir la expresión génica directamente en lisados de tejidos derivados de pequeñas cantidades de material de paciente, incluyendo microdissected exosomas material y circulación de las células del tumor. Además de la detección de heterogeneidad del tumor, el uso adecuado de los paneles tiene el potencial para detectar tumor derivado de exosomas para el diagnóstico temprano y detección precoz de recidivas. Puesto que no hay necesidad para un paso de amplificación de ácidos nucleicos, la amplificación de la señal usando la tecnología bDNA, combinada con el complejo basado en el grano, medidas de múltiples genes en el material de archivo clínico anotado y proporcionar un recurso para validación de biomarcadores.

Optimización de ensayos basado en RNA usando archivo formalina-fijo material parafina-encajado (FFPE) es difícil debido a la variabilidad en el tratamiento quirúrgico del tejido y la degradación del ARN causada por formol usado para tejido integridad preservación1, 2. Para superar la limitación de la realización de estudios de expresión génica precisa de material de archivo, nuestro grupo utiliza el ensayo de grano magnético multiplex de bDNA. En lugar de amplificación enzimática de una plantilla de destino, la tecnología bDNA utiliza hibridación de sondas específicas y la amplificación de un reportero señal3. Las secuencias de reconocimiento corto de las sondas de detección y captura están diseñadas para hibridar a fragmentos cortos de RNA del objetivo4. Además, el uso de homogenados de tejido como material de partida directo en este ensayo, supera la inevitable pérdida de ARN, que resulta del análisis que requiere purificación y previa extracción de RNA. Amplificación de la señal, el uso de secuencias cortas de reconocimiento y la exclusión de un paso de purificación, contribuyen a reducir variación técnica del ensayo. La tecnología ofrece la posibilidad de multiplexar el ensayo (hasta 80 blancos de RNA) y medir la expresión de un grupo de objetivos de baja material de entrada. Este protocolo describe la preparación y tinción de muestras de tejido para Microdisección láser. La coloración de las diapositivas de membrana facilitar la proyección de imagen del tumor y la arquitectura histológica para proporcionar selección exacta y perfiles de: (1) el tumor y los conductos normales en el tejido mamario y (2) clones de la célula maligna en tumores heterogéneos.
Clasificación molecular del cáncer de mama es un proceso que interroga marcadores moleculares para categorizar tumores de pacientes en tres clases moleculares, es decir, receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico luminal, humano (HER2)-subtipo enriquecido y basal. El subtipo HER2-enriquecido está bien definido, con alta expresión de HER2 receptor, debido a la amplificación del gen ERBB2, combinada con baja o ausencia de receptores de estrógeno (ER) y receptor de progesterona (PgR). El subtipo luminal es generalmente positivo para ER y el subtipo basal es en general negativo para los tres receptores (HER2, ER, PgR) y significativamente se traslapa con la mama triple negativos subtipo diagnóstico cáncer (TNBC)5,6. Otros marcadores se utilizan para determinar las características epiteliales y mesenquimales. Fibronectina (FN1) es un componente principal del compartimiento mesenquimal del tejido de mama. Mayor expresión de FN1 se acompaña de Ki67 alta coloración y muestra una firma para un tumor más invasivo7,8 y se asocia con metástasis9. Interesante, FN1 fue encontrada para estar presente en microvesículas que se origina en las células del tumor, que induce la activación de la señal mitogénica en fibroblastos receptores10. Por lo tanto, circulan microvesículas como exosomas son un marcador potencial de la detección temprana o de la metástasis y recaen11.
Selección de áreas de tumor para subclasificación transcripcional del cáncer de mama recurrente ha sido realizada por macrodissection12,13. Para superar la heterogeneidad del tejido y aumentar la sensibilidad, fiabilidad hemos combinado clásico tejido de coloración con los métodos de generación de perfiles moleculares multiplexores. Como una prueba del principio, dos clones de cáncer de mama diferentes se han definido por su firma mesenquimal epitelial y potencial metastático. El flujo de trabajo del protocolo descrito puede ser fácilmente traducido a la actual configuración clínica y utilizar selectivamente aislar y caracterizar los subtipos de tejido usando perfiles de mRNA específicos.

<table><tbody><tr><td>Microtomo</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Heamatoxylin Sigma</td><td></td><td>MHS16-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Eosina Y Aquaeous solution</td><td>Sigma</td><td>HT110216-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Suero Normal</td><td>de Conejo Monosan</td><td>MONX10963</td><td>Dilución de trabajo: 1/40</td></tr><tr><td>Conejo Biotinilado anti-ratón</td><td>Dako</td><td>E0354</td><td>Dilución de trabajo: 1/200</td></tr><tr><td>Anticuerpo ER (6F11)</td><td>Vector Laboratories</td><td>VPE614</td><td>Dilución de trabajo: 1/45</td></tr><tr><td>Anticuerpo HER2 (CB11)</td><td>Novocastra</td><td>CB11-L-CE</td><td>Dilución de trabajo: 1/325</td></tr><tr><td>Anticuerpo Ki67 (MIB-1)</td><td>Dako</td><td>M7240</td><td>Dilución de trabajo: 1/500</td></tr><tr><td>Kit de complejo de biotina Avidina</td><td>Laboratorios Vector</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ti-E Microscopio</td> <td>invertidoObjetivos Nikon</td><td>Ti-E</td><td>4x, 10x, 20x y 40x</td></tr><tr><td>Membranas de microdisección láser</td><td>Máquinas moleculares & Industrias</td><td>S0103</td><td></td></tr><tr><td>mmi CellCamera 1.4</td><td>Máquinas moleculares & Industrias</td><td>MX4285c-ACK07</td><td></td></tr><tr><td>mmi Cellcut Plus</td><td>Máquinas Moleculares & Industrias</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tapas difusoras</td><td>Máquinas moleculares & Industrias</td><td>50210</td><td></td></tr><tr><td>mmi Celltools Software v.4.01rcl</td><td>Máquinas moleculares & Industrias</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer comfort</td><td>Eppendorf</td><td>5355000038</td><td></td></tr><tr><td>bloque calefactor de 1,5 ml para Eppendorf Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>22670522</td><td></td></tr><tr><td>bloque calefactor de placa de 96 pocillos para Eppendorf Thermomixer Eppendorf</td><td></td><td>22670565</td><td></td></tr><tr><td>Labnet Vortemp 56 incubadora de agitación</td><td>Labnet</td><td>52056A-220</td><td></td></tr><tr><td>LX200 Analizador de bolas magnéticas 100/200</td><td>Luminex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de procesamiento de muestras Invitrogen QuantiGene - Tejidos FFPE ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>QS0109</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 (separación magnética)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>QP1011</td><td></td></tr><tr><td>Película de sellado Thermaseal RTS</td><td></td> Lavadora de placas magnética <td>manual Thermaseal</td> 765246 <td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>QP1011</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen QuantiGene Incubadora Kit de validación de temperatura</td><td>Affymetrix/Panomics</td><td>QS0517</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K (50&micro; g/&micro; L)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>14622</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Sets</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific Varios</td><td></td></tr><tr><td>Vórtice de Múltiples Velocidades</td><td>Kisker Biotech</td><td>MSV-3500</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Silvercrest</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNASEZAP</td><td>Sigma</td><td>R2020-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Sello de placa de aluminio de 96 pocillos</td><td>Sigma</td><td>Kit de validación de temperatura Z721549-100EA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>QS0517</td><td></td></tr><tr><td>Comunidad de RapidMiner Studio 7.1.001</td><td>Plataforma de ciencia de datos</td><td>RapidMiner</td><td></td></tr><tr><td>Horno de hibridación</td><td>Hybaid (Thermo Scientific)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

optimización de un análisis de la expresión multiplex basados en arn usando material de archivo de cáncer de mama

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Degradación de ácidos nucleicos en el tejido archival, la heterogeneidad del tumor y la falta de muestras de tejido fresco congelado puede afectar servicios de diagnóstico de cáncer en laboratorios de patología en todo el mundo. Amplificación del gene y la expresión diagnóstico pruebas utilizando material de archivo o material que requiere transporte al servicio de laboratorios, necesita una prueba más robusta y precisa, adaptada a flujos de trabajo clínicos actuales. Nuestro equipo de investigación ha optimizado el uso del ensayo de Plex de Invitrogen™ QuantiGene™ (Thermo Fisher Scientific) cuantificar RNA en material de archivo utilizando la tecnología de ADN ramificado (bDNA) en granos magnéticos de Luminex xMAP® . El análisis de expresión génica se describe en este manuscrito es un método rápido y múltiplex de novela, que puede clasificar con precisión el cáncer de mama en los diferentes subtipos moleculares, omitiendo la subjetividad de la interpretación de técnicas de imagen. Además, debido a la entrada de material requerido, tumores heterogéneos pueden ser microdissected de láser con hematoxilina y eosina (H & E) secciones manchadas. Este método tiene una amplia gama de aplicaciones incluyendo clasificación tumor con potencial diagnóstico y medición de biomarcadores en líquido biopsias, que permitirían mejor gestión paciente y control de la enfermedad. Además, la cuantificación de biomarcadores en material de archivo es útil en investigación oncológica con acceso a las bibliotecas de material clínico anotado, en el que los estudios retrospectivos pueden validar biomarcadores potenciales y su evolución clínica correlación.

El método descrito ha sido aplicado para la medición simultánea de 40 transcripciones en H &amp; E tinción (figura 1), microdissected (figura 2) altamente degradado material FFPE. Usando este método, se muestra la caracterización precisa del estado del receptor (Figura 3A), clasificación de tumores en subtipos moleculares luminal y basal17y expresión diferencial del marcador mesenquimal, FN1, al comparar el tumor y tejido de control emparejado (figura 3B), en los diversos subtipos del receptor de positivos y negativos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig1.jpg"> Figura 1: expresión génica usando H &amp; E tinción material. Correlación entre un perfil de la expresión derivado de una sección del tumor sin mancha en comparación con una sección de tumor manchadas. [Pearson correlación p-valor = 5.34E-26]. Reproducido con permiso de17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig2.jpg"> Figura 2: láser microdisección de tejidos FFPE. (A) H &amp; E tinción de diapositiva; (B) coloración Immunohistochemical para la expresión de ER; (C) la coloración de immunohistochemical HER2; (D) sección de 20 μm sin manchas en las diapositivas de membrana de Microdisección láser. La flecha amarilla indica una zona de tumor invasivo que no está demarcada claramente debido a la falta de coloración. (E) A 20 μm sección teñida con H &amp; E para la mejor delineación de áreas de interés. Flechas blancas indican camino de disección laser mientras que la flecha roja muestra el enfoque de láser durante la disección. Todas las ilustraciones fueron capturadas con 10 aumentos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig3.jpg"> Figura 3: expresión de estatus (A) del receptor y (B) mesenquimal marcador FN1, en tumor de mama en comparación con emparejado normal. Los subtipos de cáncer de mama diagnóstico clásicos se definen según el resultado de diagnóstico usando immunohistochemistry y fluorescencia en situ del hibridación (pescado) para la coloración de immunohistochemical equívoca de HER2. Se ilustra la expresión normalizada de (A) HER2 y ER, FN1 (B) medido por el ensayo de hibridación en HER2 positivo, ER positivo y casos TNBC en comparación con el paciente emparejado tejido mamario normal. La estadística de prueba de Kruskal Wallis (K-W χ2) muestra que la expresión de HER2 es significativamente (p &lt; 0.05) más alta en el tejido del tumor en comparación con los tejidos normales igualados en la cohorte de HER2 positivo y significativamente menor en la cohorte TNBC. No se encontró expresión de ER a ser significativamente mayor en el tejido del tumor en comparación con el normal emparejado en el ER positivo y cohortes TNBC. FN1 es significativamente mayor en el tejido del tumor en los subtipos HER2 y ER positivo y muestra una tendencia a ser elevados perceptiblemente en el tejido del tumor también en la cohorte TNBC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig4.jpg"> Figura 4: estudio de caso: heterogeneidad tumoral. Tumores morfológicamente distintos fueron microdissected y trataron como muestras distintas. (A) el maestro de exploración de la sección de H &amp; E. (B, C) Un 10 x y 40 x aumentos, respectivamente para cada morfología del tumor identificado. (D) coloración Immunohistochemical para ER con 10 aumentos. (E) coloración Immunohistochemical para Ki67 en 10 aumentos que muestran una actividad mitótica mayor en tumor 1. (F) normalizó los niveles de expresión del gen ESR1 en cada tumor que muestra expresión relativamente alta e igual entre los tumores como se espera de los resultados de immunohistochemical. (G) normalizó los niveles de expresión de FN1, un marcador mesenquimal, donde mayor expresión FN1 es acompañada de Ki67 alta coloración que muestran una firma para un tumor más invasivo. El inverso se observa en tumor 2, que parece ser un tumor de lenta proliferación con un potencial maligno menor representado por la expresión reducida de FN1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Degradación de ácidos nucleicos en el tejido archival, la heterogeneidad del tumor y la falta de muestras de tejido fresco congelado puede afectar servicios de diagnóstico de cáncer en laboratorios de patología en todo el mundo. Este manuscrito describe la optimización de un panel de biomarcadores utilizando un ensayo multiplex grano magnético para clasificar los cánceres de mama.

Optimización de un análisis de la expresión Multiplex basados en ARN usando Material de archivo de cáncer de mama

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Este método está optimizado con éxito para clasificar a las pacientes con cáncer de mama en grupos terapéuticos conocidos y no conocidos. La alta sensibilidad de este ensayo identifica muestras heterogéneas que pueden estudiarse más a fondo mediante microdisección láser. La principal ventaja del ensayo multiplex basado en ARN es la reproducibilidad de los resultados utilizando hematoxilina y material de archivo teñido con formalina fijado en parafina que permite salidas de alta resolución y validación de biomarcadores.Prepare el tejido como se describe en el protocolo de texto. Para comenzar la disección, establezca los límites del portaobjetos y calibre el movimiento de la platina del microscopio. Ahora escanee los portaobjetos de membrana manchados con el objetivo 4X.Seleccione y rodee las áreas objetivo para la microdisección en el portaobjetos de membrana. Lleve un registro del área total. Se necesitan al menos 42 milímetros cuadrados para un análisis adecuado del ARN posterior.A continuación, inicie el corte por láser con los parámetros definidos. A continuación, utilice el mecanismo de elevación de la tapa para recuperar la sección diseccionada y colocar la sección en la tapa del difusor de un tubo etiquetado unido a un apéndice mecánico. Si la sección diseccionada no se recupera en la tapa, repita la disección del área objetivo.La precisión de la microdisección es un paso crítico y siempre se debe asegurarse de que el área microdiseccionada presente en el capuchón coincida con la imagen marcada y escaneada. Recoja tantas secciones de tejido como desee, cada una en un tubo separado, luego proceda con el lisado de las muestras de tejido. Para la lisis, aplique 2,4 microlitros de solución homogeneizante pre milímetro cuadrado de área de tejido en cada muestra, luego agite las muestras durante 10 segundos a la velocidad máxima.A continuación, centrifugar las muestras durante cinco segundos a 2.500 g. A continuación, transfiera las muestras a tubos de 1,5 mililitros si es necesario, y colóquelas en un bloque calefactor agitador a 65 grados centígrados. Agítalos a 600 rpm durante 12 a 18 horas.A continuación, centrifugar los lisados a 21.000 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Recoja cuidadosamente el sobrenadante transparente en un tubo nuevo etiquetado. Evite transferir fragmentos de tejido.Los sobrenadantes se pueden almacenar a menos 80 grados centígrados. Después de preparar todos los reactivos para el ensayo basado en hibridación, cargue hasta 90 pocillos de una placa de separación magnética de 96 pocillos con homogeneizado de tejido de 25 microlitros. Cargue 25 microlitros de muestras de control en tres pocillos designados y cargue una solución homogeneizadora de 25 microlitros en tres pocillos como blancos.A continuación, selle la placa de separación magnética con un sello de presión de plástico transparente y coloque la placa en una incubadora a 54 grados centígrados durante 18 a 22 horas con agitación. Al día siguiente, monte y bloquee la placa en una arandela de placa magnética de mano, luego retire el sello de presión y espere un minuto para que las cuentas magnéticas se asienten. Ahora realiza un lavado.Drene el plato sobre un fregadero y use un papel de seda para secarlo suavemente, luego cargue todos los pocillos con 100 microlitros de tampón de lavado 1X y espere 15 segundos. Repite este proceso tres veces para completar el paso de lavado. Después de eliminar el último lavado, vuelva a cargar los pocillos con 50 microlitros del reactivo del preamplificador, luego selle la placa con un sellador de placas de aluminio y agite la placa a 800 rpm durante un minuto a temperatura ambiente.Luego continúe agitando el plato a 50 grados centígrados durante una hora. Una vez completado, realice otro paso de lavado. A continuación, vuelva a cargar los pocillos con 50 microlitros del reactivo amplificador, selle la placa con un sello de placa de aluminio y repita la incubación agitada de un minuto a temperatura ambiente seguida de una hora a 50 grados centígrados, seguida de otro paso de lavado.Ahora agite la sonda de etiquetas durante 10 segundos a máxima velocidad y luego agregue 50 microlitros de sonda de etiquetas a cada pocillo. A continuación, vuelva a sellar la placa y repita la incubación agitada como antes, seguida de otro paso de lavado. A continuación, cargue los pocillos con 50 microlitros de ficoeritrina Streptavidin recién mezclada, luego realice una incubación agitada a temperatura ambiente a 600 rpm, seguida de un paso de lavado con tampón de lavado Streptavidin.Después de completar el paso de lavado, cargue cada pocillo con 100 microlitros de tampón de lavado Streptavidin y selle la placa con un sello de placa de aluminio, luego agite la placa a 800 rpm a temperatura ambiente durante tres minutos. Durante el último paso de incubación, ponga en marcha el analizador de perlas magnéticas y asegúrese de que el instrumento esté calibrado y de que se hayan realizado los protocolos de validación. En el software, agregue un nuevo análisis seleccionando Crear lote utilizando un protocolo existente en la pestaña Lotes.A continuación, en el diseño de placa, designe los pocillos como desconocidos o en blanco y proporcione una etiqueta para cada uno en el panel Muestra. Ahora retire el sello de aluminio de la placa de reacción, expulse la bandeja del cargador de placas y cargue la placa en el analizador. A continuación, haga clic en Retract, luego en Run Batch para iniciar el analizador.Después de la lectura, expulse la placa y limpie el analizador de perlas magnéticas según lo recomendado por el fabricante. Para el análisis, vaya a la pestaña Resultados del lote. Seleccione el archivo de análisis respectivo y use la opción de exportarlo como un archivo csv, luego cree promedios y puntajes brutos utilizando un software de hoja de cálculo.Asegúrese de que los controles muestren las señales esperadas. Normalice los datos brutos de muestra y analice la distribución de datos utilizando una plataforma de ciencia de datos o utilizando algoritmos definidos para ejecutar un análisis de componentes principales. El rendimiento del lector de perlas multiplex y del ensayo es crítico, y la ejecución de diluciones en serie de muestras de control bien anotadas antes de las valiosas muestras de pacientes garantiza resultados correctos.En Atributos, seleccione el subconjunto de datos genéticos normalizados y una variable nominal, como un subtipo de cáncer de mama. Aplique un algoritmo de clasificación entrenado y validado para caracterizar muestras desconocidas. El método descrito se ha aplicado para la medición simultánea de 40 transcripciones en material FFPE teñido con H&E, microdisecado y altamente degradado.Con este método, es posible mostrar una caracterización precisa del estado del receptor y la expresión diferencial del marcador mesenquimal FN1 al comparar el tumor y el tejido de control emparejado en los diversos subtipos de receptores positivos y negativos. La heterogeneidad dentro de los tumores se puede caracterizar utilizando este método. Un tumor ER positivo exhibe una expresión diferencial espacial de FN1 dentro de áreas que muestran una morfología tumoral y una actividad mitótica distintas.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir múltiples genes directamente a partir de lisados de tejidos después de la hibridación del ARN objetivo en perlas, amplificación de señales y cuantificación. La sensibilidad del ensayo permite el uso de material microdiseccionado con láser. Al intentar este procedimiento, es importante recordar calibrar el equipo antes de cada ensayo y determinar el rango de sensibilidad utilizando material de control de calidad antes de analizar muestras preciosas de pacientes.El flujo de trabajo de los ensayos se adapta fácilmente a los laboratorios clínicos. El perfil de ARN de hasta 90 muestras se puede realizar en 12 horas durante dos días. Medir el estado de los receptores del cáncer de mama en un laboratorio de patología lleva mucho tiempo y requiere patólogos experimentados.El uso de este ensayo digitalizado basado en perlas multiplex cuantifica la expresión de ARN con precisión. El análisis de biomarcadores fraccionados en biopsias en un diagnóstico primario es una presentación del tumor. El uso de esta metodología con un panel de biomarcadores más amplio y también la utilización de secciones completas identifica muestras heterogéneas.El desarrollo de ensayos utilizando esta metodología es versátil y requiere una baja entrada de muestra. Las muestras incluyen muestras clínicas anotadas importantes para la validación de biomarcadores y también biopsias líquidas que son importantes para la vigilancia del paciente y el diagnóstico temprano.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

A continuación se describe un reverso transcriptasa optimizado multiplex PCR cuantitativa (QRT-PCR) en combinación con el protocolo de una plataforma de microfluidos como un costo y el tiempo efectivo instrumento de cribado de alto rendimiento para los microRNA (miRNA) los niveles de expresión, especialmente cuando se trabaja con cantidades limitadas de muestras.

Perfiles de microARN de alto rendimiento: Multiplex Optimizado QRT-PCR en la escala de nanolitros de la IFC Fluidigm dinámica ArrayTM

El logro de un nivel de comprensión de los sistemas de procesos celulares es un objetivo de la biología celular moderna. Se describe aquí estrategias para luciferase reporteros multiplexación de varias funciones celulares puntos finales para interrogar la función de genes utilizando RNAi bibliotecas escala del genoma.

Una plataforma de detección de luciferasa basado multiplexado para interrogar cáncer asociado transducción de señales en las células cultivadas

Molecular señalización a través de estrógeno y microRNAs son fundamentales en el desarrollo y el crecimiento del cáncer de mama. El estrógeno activa los receptores de estrógeno, que son factores de transcripción. Muchos factores de transcripción pueden regular la expresión de microRNAs, y microARN regulados por estrógenos se puede perfilar el uso de diferentes técnicas a gran escala.

Perfiles de microARN regulados por estrógeno en las células del cáncer de mama

Aquí describimos un protocolo simplificado para análisis de expresión de microARN (miARN) en tejidos clínicos archivados de cáncer de próstata (PCa) fijados en formol, incluidos en parafina (FFPE) o congelados frescos que emplean PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR) e hibridación in situ (ISH).

Los análisis de expresión de miRNA en tejidos clínicos sobre el cáncer de próstata

Aquí presentamos un protocolo para detectar la expresión de miRNA en muestras de pacientes con cáncer de mama utilizando hibridación in situ de miRNA.

Análisis clínico-patológica de los genes miARN expresión en el cáncer de mama mediante el uso de tejidos miARN<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación

Hibridación in situ de la fluorescencia (pescado) se requiere a menudo en combinación con la histopatología y el diagnóstico molecular para la selección del tratamiento en la medicina personalizada. Fijador de tejido no enlazan a la Cruz, libre de formol novedoso que permite alta calidad morfológica, molecular y análisis de peces de la misma muestra por adición de un paso de la fijación antes de pescado se presenta.

Protocolo para HER2 de los pescados usando un fijador de tejido no enlazan a la Cruz, libre de formol para combinar las ventajas de la criopreservación y la fijación de formalina

Muestras de parafina-encajado formalina-fijos representan una valiosa fuente de biomarcadores moleculares de las enfermedades humanas. Aquí presentamos un protocolo de preparación Biblioteca de cDNA en laboratorio, inicialmente diseñado con ARN congelado fresco y optimizado para el análisis de los microRNAs de tejidos almacenan hasta 35 años.

La secuencia retrospectiva MicroRNA: ADN complementario biblioteca preparación protocolo utilizando a muestras de ARN de parafina-encajado formalina-fijo

El uso de un enfoque basado en ARN para determinar los perfiles inmunitarios cuantitativos de los tejidos tumorales sólidos y aprovechar las cohortes clínicas para el descubrimiento de biomarcadores de oncitología se describe a través de protocolos moleculares e informáticos.

Modelado inmune predictivo de tumores sólidos

Este informe describe un protocolo automatizado para ensayos de inmunofluorescencia múltiple (mIF) en un tintor de portaobjetos automatizado. Demuestra la alta reproducibilidad de la proteómica espacial en autotinciones tisulares estándar de alto rendimiento y generadores de imágenes de fluorescencia de portaobjetos completos, lo que es ideal para ensayos mIF personalizados en un gran número de portaobjetos de tejido en investigación traslacional.

Ensayos de inmunofluorescencia multiplex automatizados de alto rendimiento para la investigación traslacional

Este protocolo detalla una metodología para la detección de ARNm multiplex con citometría de masas de imágenes de proteínas en secciones de tejido incluidas en parafina fijadas en formalina.

Cartografía molecular de doble modalidad: integración de la detección de ARNm multiplex con citometría de masas de imágenes de proteínas

El protocolo describe un ensayo de hibridación de inmunofluorescencia en tándem con tejido fijado en formol e incluido en parafina para detectar y cuantificar microARN y proteínas multiplexadas simultáneamente.

Amplificación y reconocimiento de microARN a través de la hibridación in situ de ácido nucleico bloqueado como un nuevo método de detección y cuantificación

Aprende a optimizar un ensayo multiplex basado en ARN para clasificar cáncer de mama usando tejido de archivo fijado en formol. Este método permite analizar muestras degradadas con alta sensibilidad y reproducibilidad.

Optimización de un análisis de la expresión Multiplex basados en ARN usando Material de archivo de cáncer de mama

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