Visualización y cuantificación del potencial de la diferenciación de células mesenquimales Adipogenic con un marcador específico de linaje

El objetivo general de este procedimiento es visualizar y cuantificar la diferenciación de las células estromales en linaje adipogénico, utilizando un marcador de proteína específico del linaje, la proteína de unión a ácidos grasos cuatro. Esto se logra primero aislando y expandiendo las células estromales de interés. A continuación, las células estromales se cosechan y se siembran en placas de cultivo in vitro estándar.

Después de la incubación durante unos días, las células se tratan con un medio de diferenciación adipogénico. Las células se incuban durante 14 días, con reemplazo regular de los medios. Después de la diferenciación, las células se fijan y se tiñen con anticuerpos contra la proteína cuatro de unión a ácidos grasos.

Se utiliza un microscopio inmunofluorescente automatizado de cribado de alto contenido para capturar imágenes de las células marcadas en las placas de micropocillos. A continuación, se cuantifica la diferenciación, utilizando un software especializado en análisis de imágenes. A diferencia de los métodos tradicionales de medición de la diferenciación adipogénica que utilizan colorantes como Oil Red O, el ensayo descrito en este vídeo utiliza un anticuerpo contra la proteína específica del linaje, la proteína de unión a ácidos grasos cuatro, para confirmar la diferenciación adipogénica.

De este modo, este método cuantifica los cambios en la expresión génica que corresponden a la diferenciación adipogénica. Este ensayo es capaz de proporcionar una gran cantidad de información, incluido el porcentaje de células diferenciadas, la intensidad de la señal de fluorescencia por célula y los cambios en la morfología celular. La capacidad de analizar múltiples características permite la identificación de posibles cambios sutiles en la diferenciación en respuesta a diversos tratamientos.

Este ensayo también tiene una alta capacidad de extracción, lo que lo hace ideal para aplicaciones de detección de fármacos de alta extracción. Resuspender las células en medio ASC completo, que es DMEM/F-12 medio basal, suplementado con un 10% de suero fetal bovino, GlutaMAX y antibióticos. Pipetear en una placa de cultivo de 96 pocillos, a 5000 células por pocillo.

Se necesitan ocho pozos para cada donante. Cuatro pozos reciben medio de control, mientras que el resto recibe medio de diferenciación. Cada cuarto pocillo de cada tratamiento servirá para un control primario de ganglio.

Incubar las células a 37 grados, humidificadas con una condición atmosférica de 5% de dióxido de carbono durante cuatro días. Esto es para permitir que las células crezcan hasta confluir en cada pozo. Al cuarto día, saque las placas de la incubadora.

Retire la mitad del medio de cada pocillo. Agregue un volumen igual de medio ASC completo, o medio de diferenciación adipogénico, que se complementa con insulina, isobutilmetilxantina, dexametasona e indometasona. Placa de incubación a 37 grados, humidificada con una condición atmosférica de 5% de dióxido de carbono.

El período de tiempo requerido para una diferenciación suficiente es de 14 días. Durante este tiempo, reponga los medios realizando un cambio de medios cada dos o tres días. Después de la diferenciación, saque las placas de la incubadora.

Pipetee cuidadosamente todos los medios de cada pocillo. Fije las células agregando metanol helado. Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Retire el metanol y luego lávese con solución salina tamponada con Tris. Bloquee agregando 0.25% de bloqueador de caseína. Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Retire la caseína, luego lave con solución salina tamponada con Tris. Prepare la mezcla de anticuerpos primarios diluyendo el anticuerpo anti-FABP4 200 veces en tampón de dilución de anticuerpos. Agregue la mezcla a todos los pozos, excepto a los reservados como control primario del nodo.

En su lugar, agregue tampón de dilución de anticuerpos a estos pocillos. Incubar a temperatura ambiente durante una hora. Después de la incubación, lave las células una vez con solución salina tamponada con Tris.

Retirar, agregar solución salina fresca tamponada con Tris e incubar durante cinco minutos en la mecedora. Repite este proceso dos veces. Prepare la segunda mezcla de reanticuerpos diluyendo Anti-Rabbit Alexa 488 segundo reanticuerpo 200 veces en tampón de dilución de anticuerpos.

Agregue DAPI, que etiqueta los núcleos celulares, en una dilución final de uno a 2000. Agregue la mezcla a todos los pocillos y envuelva el plato con papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Después de la incubación, lave las células con TBS y luego dos lavados de 15 minutos en el balancín. Retire todo el tampón de los pocillos y agregue el tampón de almacenamiento, complementado con 0,4 miligramos por mililitro de timerosal, para evitar el crecimiento bacteriano. Para obtener imágenes de este bioensayo se utiliza una máquina de cribado de alto contenido equipada con una platina automatizada, objetivos de enfoque y filtros.

Verifique que los filtros correctos estén en su lugar. Limpie la parte inferior de la placa para obtener la mejor calidad. Cargue la placa en la plataforma con A1 colocado en la esquina superior izquierda.

Con el asistente de adquisición de placas, registre información esencial sobre el experimento, como el número de placa, la ampliación, la fecha, las condiciones experimentales y los detalles del etiquetado. Seleccione el tipo de placa de micropocillos utilizada. Los usuarios pueden seleccionar los pozos y el número de sitios que se adquirirán.

Seleccione todos los pozos que se van a visualizar resaltando la cuadrícula. Mueve el escenario al pozo más brillante. La selección del pozo más brillante garantizará que todas las imágenes se adquieran con valores de píxel-gris que estén en un rango lineal y, por lo tanto, directamente proporcionales a la intensidad de la tinción.

Si no se realiza este paso, las imágenes tomadas en pozos más brillantes pueden estar sobresaturadas. Seleccione las combinaciones de canales, el tiempo de exposición y los parámetros de desplazamiento Z adecuados para el experimento. Los filtros utilizados para la obtención de imágenes de FABP4 y DAPI corresponden a las etiquetas específicas utilizadas para visualizar la tinción.

Alexa 488, que excita a 480 nanómetros y emite a 560 nanómetros, se utilizó para visualizar FABP4. Y el tinte DAPI, que excita a 360 nanómetros y emite a 460 nanómetros, se utilizó para visualizar los núcleos de las células. En el caso de las placas etiquetadas con Oil Red O, las gotas de grasa se visualizaron con luz brillante transmitida por combustible.

Y también se visualizó con fluorescencia la etiqueta Oil Red O, ya que excita a 575 nanómetros y emite a 630 nanómetros. Cuando se completa toda la configuración, el ensayo biológico está listo para ser adquirido. La imagen se guarda automáticamente en el servidor en línea, para permitir un fácil acceso remoto a las imágenes.

Se puede acceder al conjunto completo de imágenes almacenadas en el servidor en línea mediante el programa de escritorio remoto. A continuación, las imágenes se pueden analizar con el software MetaXpress. La aplicación de puntuación de celdas permite a los usuarios seleccionar una longitud de onda para detectar todos los núcleos en un campo, como DAPI, en este caso.

Las longitudes de onda posteriores se pueden utilizar para detectar un marcador positivo en el núcleo, el citoplasma o ambas ubicaciones celulares. La proteína de unión a ácidos grasos cuatro, o FABP4, es un marcador de linaje adipogénico. La expresión de FABP4 se localiza en el núcleo y el citoplasma de los adipocitos diferenciados.

En este ensayo biológico, analizamos la expresión de FABP4, utilizando el módulo de puntuación celular. En primer lugar, detecte los núcleos celulares mediante el canal DAPI, con parámetros definidos por el usuario para el tamaño y la intensidad de la señal por encima del fondo. Detecte la señal FABP4 utilizando el canal de pie C y los parámetros definidos por el usuario para el tamaño y la intensidad de la señal sobre el fondo.

En este ensayo biológico, se analizaron gotas de grasa marcadas con Oil-Red-O, que se flourescen en el rango de 560 nanómetros, con un módulo de lata de MetaXpress, Transflour. Este algoritmo de análisis detecta el total de células utilizando núcleos marcados con DAPI, que cumplen con los criterios de tamaño de celda e intensidad de tinción especificados por el usuario. El usuario también especifica el tamaño y la intensidad de las fosas, que en este caso detectan gotas de grasa en las proximidades de los núcleos celulares.

La información sobre el tamaño de las gotas de grasa, la intensidad de la tinción, el número por célula, se registra mediante el ensayo Transflour. Es importante tener en cuenta que la etiqueta Oil Red O se filtró o se disolvió de algunas células, lo que podría limitar y confundir la verdadera cantidad de diferenciación que se estaba produciendo. Se muestran imágenes representativas de células de paso temprano y tardío, control y diferenciadas, marcadas con DAPI, una tinción nuclear y FABP4 junto con imágenes de fusión y segmentación.

Las imágenes de segmentación muestran celdas diferenciadas con una superposición verde y celdas indiferenciadas con una superposición roja. El porcentaje de células que expresan FABP4 se utilizó como medida del potencial de diferenciación adipogénica. Se observó un aumento significativo en las células que expresan FABP4 con diferenciación adipogénica en las células de paso temprano y tardío.

Las células de paso temprano demostraron un aumento significativamente mayor en la diferenciación que las células de paso tardío. Las imágenes representativas de DAPI y Oil Red O se muestran junto con imágenes de fusión y segmentación. Las imágenes de segmentación muestran todos los núcleos con una superposición verde y gotas de lípidos teñidas con aceite rojo con una capa roja.

El área de tinción de Oil Red O por célula se utilizó como medida del potencial de diferenciación adipogénica. Se observó un aumento significativo en el área de tinción de Oil Red O con diferenciación adipogénica. Las células de paso temprano mostraron una mayor área de tinción de aceite rojo O por célula, en comparación con las células de paso tardío.

Se realizó un Western blot para analizar el nivel de expresión de la proteína FABP4 de ASC diferenciadas de paso temprano y tardío. El análisis semicuantitativo de la densidad óptica de las bandas de FABP4 como proporción del control de la carga total de proteínas mostró que el inmunomarcaje de FABP4 aumentó significativamente en el paso temprano y, en menor grado, en las células diferenciadas de paso tardío. Al ver este video, debería haber adquirido una comprensión de cómo diferenciar las células madre en linaje adipogénico, cómo realizar la tinción de inmunofluorescencia utilizando un marcador específico de gen adipogénico, la proteína de unión a ácidos grasos cuatro y, finalmente, cómo obtener imágenes y analizar todas las características morfológicas relevantes de las células que son inmunopositivas para la proteína de unión a ácidos grasos cuatro.

Espero que este video te resulte útil para tu investigación.