Cuantificación histológica para determinar la carga micótica pulmonar en aspergilosis Experimental

El objetivo general de este protocolo es cuantificar la carga fúngica pulmonar en ratones con aspergilosis invasiva mediante análisis histológico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la patogénesis fúngica sobre los mecanismos de respuesta protectores y perjudiciales del huésped y los factores clave de virulencia fúngica. La principal ventaja de esta técnica es que las muestras histológicas existentes se pueden utilizar para obtener una carga fúngica con resultados comparables a la aplicación cuantitativa de PCR de ADN fúngico pulmonar.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la aspergilosis invasiva, también se puede aplicar a otros estudios de enfermedades en los que los patógenos se pueden teñir diferencialmente dentro de los tejidos del huésped. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando empezamos a pensar en métodos alternativos para cuantificar la carga fúngica pulmonar con menos variabilidad que los métodos cuantitativos de ADN. La demostración de los procedimientos de infección y cosecha estará a cargo de Angar Tsoggeral, un técnico de investigación.

24 horas antes de la infección, agotar los neutrófilos de cada ratón experimental de siete a 10 semanas de edad con 0,5 miligramos de anticuerpo anti-Ly-6G en solución salina estéril administrada intraperitonealmente en un ángulo de 45 grados en el cuadrante lateral inferior derecho de cada animal y devolver a los ratones a sus jaulas. A la mañana siguiente, vierta 1,5 gramos de perlas de vidrio de 0,5 milímetros en una placa de cultivo de conidios de A. fumigatus e incline suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás hasta que las perlas estén cubiertas con el hongo. Recoja la mezcla de cuentas recubiertas de conidios en un tubo cónico de 15 mililitros y suspenda las cuentas en cinco mililitros de DPBS.

Agite las perlas para separarlas del hongo y cuente los conidios en una dilución 50X de sobrenadante en un hemocitómetro. Diluir los conidios a una concentración de uno por 10 a 8 conidios por mililitro de DPBS y cargar 50 microlitros de solución de conidios por ratón en micropipetas individuales. Después de confirmar la falta de respuesta al pinzamiento de los dedos del pie, coloque el primer ratón anestesiado sobre una tabla inclinada en posición supina y sujete suavemente los incisivos superiores con una banda elástica y los incisivos inferiores con un alambre metálico.

Luego, use pinzas pequeñas para sostener cuidadosamente la lengua en extensión completa y administre 50 microlitros de la solución de conidios en la base de la lengua. Manteniendo la lengua en plena extensión, escuche la respiración rápida y el chasquido distintivo de la aspiración durante 20 segundos o hasta que la suspensión esté completamente aspirada. Luego, regrese suavemente al ratón a su jaula con monitoreo hasta que esté completamente recostado e infecte al siguiente animal.

Cuando todos los ratones hayan sido infectados, inyecte un subconjunto de los animales con un agente antifúngico y repita la depleción de neutrófilos en todos los animales 24 horas después de la infección. Tres días después de administrar el hongo, coloque el primer ratón en posición supina sobre una tabla de espuma cubierta con una almohadilla absorbente. Asegúrese de que el ratón sea sacrificado con un pellizco en el dedo del pie y desinfecte el cabello con etanol al 70%.

Después de asegurar las extremidades, use unas tijeras para abrir con cuidado la cavidad torácica superior cortando la caja torácica para exponer los pulmones y el corazón. Corte la vena cava inferior que desciende desde el corazón, teniendo cuidado de evitar cortar otros vasos sanguíneos o perforar algún órgano, y use una jeringa de cinco mililitros equipada con una aguja de calibre 25 sostenida en un ángulo de 45 grados para perfundir lentamente cinco mililitros de DPBS frío en el ventrículo derecho del corazón. Después de la perfusión con cinco mililitros de formalina al 10% de la misma manera, exponga cuidadosamente la tráquea y separe las almohadillas de grasa circundantes teniendo cuidado de no perforar la tráquea.

Eleve la tráquea expuesta con pinzas y use una aguja de calibre 25 para hacer un agujero en la tráquea superior. Inserte con cuidado una cánula a través del orificio hacia los pulmones y ate un hilo quirúrgico sin apretar alrededor de la tráquea para asegurar la cánula. Use una jeringa de un mililitro para inflar los pulmones con un mililitro de tampón de formalina al 10% a través de la cánula y retire la cánula de manera rápida pero cuidadosa.

Apriete el hilo quirúrgico para sellar la tráquea y tire suavemente del hilo para desconectar el tejido conectivo, permitiendo que se extraigan los pulmones y la tráquea. Coloque los pañuelos en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 15 mililitros de tampón de formalina al 10% con un extremo de la rosca fuera del tubo. A continuación, selle el tapón e invierta el tubo para sumergir completamente la muestra y el fijador durante al menos 24 horas.

Para obtener imágenes del tejido extraído, primero abra un programa de cuantificación de imágenes apropiado y use un microscopio óptico para obtener al menos cuatro campos distintos de cada portaobjetos de plata de metanamina modificada de Gomori, o teñido con GMS, bajo el objetivo 10X. Asegúrese de que las imágenes sean representativas de las vías respiratorias infectadas dentro del pulmón y que presenten una densidad de tejido similar. Para agregar barras de escala a las imágenes, en el menú Editar, seleccione Agregar/Editar marcas de calibración y seleccione el grosor de línea, el color y el tamaño de la barra de escala.

Haga clic en la imagen donde se colocará la barra de escala, luego abra el menú Editar y seleccione Combinar y Fusionar marcas de calibración para agregar una barra de escala a cada imagen y guardar las imágenes en las carpetas de grupo experimental apropiadas. Para calcular la carga fúngica en cada animal, abra un programa de procesamiento de imágenes adecuado y abra la primera carpeta de imágenes. En el menú Imagen, seleccione Tipo y pila RGB para convertir las imágenes.

Con la tecla de flecha derecha, selecciona la segunda de las tres imágenes y presiona Control-Shift-T para abrir el ajustador de configuración del menú Umbral. Localice la imagen tiff o jpg original como referencia y abra la imagen con un programa de visualización de imágenes. Al seleccionar el valor umbral, es fundamental poder ver la imagen original para que el área seleccionada sea representativa de las hifas fúngicas y para garantizar la coherencia entre las muestras.

Mueva el control deslizante superior completamente hacia la izquierda y ajuste el control deslizante inferior hasta que el área roja seleccionada sea representativa de la imagen de microscopía. Haga clic en Establecer y Aceptar, y seleccione Analizar y Establecer mediciones marcando Área, Fracción de área, Límite al umbral, Mostrar etiqueta y dejando la configuración inferior como predeterminada. Haga clic en Aceptar y seleccione Analizar y medir.

Deberían aparecer los resultados. A continuación, exporte los datos a un programa de análisis de datos para su creación de gráficos y análisis estadísticos e introduzca la media de los cuatro o más porcentajes de área para cada muestra de pulmón. Como demuestra este gráfico representativo de supervivencia, los ratones deficientes en eosinófilos con aspergilosis invasiva tratados con un agente antifúngico después de la infección muestran una mayor supervivencia en comparación con los animales de tipo salvaje.

La tinción representativa de GMS de ratones neutropénicos de tipo salvaje y deficientes en eosinófilos con aspergilosis invasiva revela un aclaramiento fúngico casi total en ratones knockout tratados con antifúngicos que no es recíproco en animales de tipo salvaje con o sin tratamiento antifúngico. Además, la PCR cuantitativa y la cuantificación de GMS con microscopía óptica manual, como se acaba de demostrar, confirman que el tratamiento con agentes antifúngicos da como resultado la disminución más significativa de la carga fúngica entre los ratones de tipo salvaje y los con deficiencia de eosinófilos. Sin embargo, en ratones no tratados, solo la cuantificación de GMS determinó una disminución significativa en los ratones con deficiencia de eosinófilos en este experimento.

Cuando se calculan las áreas medias de las secciones teñidas de GMS de pulmón completo con un aumento de cuatro X, las diferencias son similares a los resultados obtenidos con cuatro campos representativos de 10X, aunque con menor significación estadística. También se observan resultados similares de supervivencia, carga fúngica y eliminación de hongos en ratones con deficiencia de células T gamma-delta tratados con el mismo agente antifúngico. Al intentar este procedimiento, es importante mantener la constancia al tomar imágenes de las secciones histológicas y al ajustar el valor umbral para obtener resultados comparables.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos que implican el análisis histológico de muestras con claras diferencias entre la tinción objetivo y de fondo para responder a preguntas adicionales relacionadas con la patología de la enfermedad en los pulmones y otros tejidos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo infectar ratones con conidios fúngicos por aspiración involuntaria y cómo medir el crecimiento de hongos en secciones de tejido pulmonar con un software de procesamiento de imágenes. No olvide que trabajar con Aspergillus fumigatus y la mancha de plata de metanamina modificada de Gomori puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como usar equipo de protección personal y trabajar bajo una capucha bien ventilada mientras se realiza este procedimiento.