Name: Una evaluación In Vivo de la interrupción de la Barrera Blood - Brain en un modelo de rata de ictus isquémico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Aprende a evaluar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica en ratas tras ictus isquémico mediante inyección de azul de Evans y espectrofotometría. Este método permite cuantificar la disrupción vascular cerebral.

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Los autores están agradecidos al Vicerrector de investigación de la Ardabil Universidad de ciencias médicas (Ardabil, Irán) para la ayuda financiera (subsidio No: 9607).

Todos los procedimientos fueron realizados siguiendo las directrices de Ardabil Universidad del Consejo de investigación de ciencias médicas para llevar a cabo estudios en animales (número de identificación ética: ir ALCATRACES. Rec.1394.08). en este estudio visualizado, utilizamos adultos hombres ratas Sprague-Dawley (300-350 g) de pasto Instituto (Teherán, Irán).
1. anestesia y flujometría
<ol><li>Inducir la anestesia con isoflurano 4% y mantenerlo con isoflurano (1-1.5%) en una mezcla de óxido nitroso (70% v/v) y oxígeno (30% v/v) para la duración de la cirugía.</li>
	<li>Colocar un animal anestesiado en la postura propensa en una manta de calentamiento controlado de la retroalimentación y mantener la temperatura corporal a 37±0.5 ° C por medio de una sonda rectal conectada a esta unidad de calefacción.</li>
	<li>Aplique una pequeña cantidad de pomada oftálmica en ambos ojos para evitar la sequedad.</li>
	<li>Afeite la región quirúrgica en el lado izquierdo del cráneo con las podadoras eléctricas. Use solución de betadine con una gasa para desinfectar la piel. Enjuague esta región con un paño estéril que contiene etanol al 70% y repita los dos pasos para tres ciclos17.</li>
	<li>Para la analgesia, inyectar 0,2 mL de bupivacaína 0.5% por vía subcutánea en la región de la cirugía17.</li>
	<li>Realice una incisión de piel largo de 1 cm en el cráneo (que se extiende desde el canto lateral del ojo izquierdo hasta la base del oído izquierdo) y disecar el músculo de los temporalis izquierda para exponer el cráneo. Entonces, de crear un agujero de las rebabas pequeñas 5 mm lateral a y 1 mm posterior a bregma18 para facilitar la colocación de la punta de la sonda de lápiz medidor de flujo Doppler.</li>
	<li>Gire a la rata de los propensos a la posición supina y luego poner la punta de prueba del lápiz de láser en el agujero ciego de cráneo previamente perforados para controlar el flujo de sangre cerebral regional (rCBF).</li>
	<li>Grabar rCBF de línea de base de cada animal y considerar esto como 100%. En particular, oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) se inicia cada vez que una disminución de rCBF de más del 80% es detectado19,20.</li>
</ol>2. inducción de la isquemia Focal Cerebra
<ol><li>Afeitado de la región del cuello y desinfectar la piel con betadine solución y el 70% de etanol. Inyectar 0,2 mL de bupivacaína 0.5% por vía subcutánea en el sitio de la cirugía para analgesia17.</li>
	<li>Hacer una incisión de 2 cm largo quirúrgico en la superficie ventral del cuello a la arteria carótida común izquierda (LCCA). Aislar el LCCA desde la fascia vecina y nervio del nervio vago para acceder a la bifurcación de la arteria carótida externa (CEPA) y la arteria carótida interna (ACI).</li>
	<li>Ligar permanentemente el LCCA o cepa empleando una sutura de seda 5-0 y diseccionar ICA libre al nivel de la arteria pterigopalatina.</li>
	<li>Colocar sin apretar un lazo de sutura de seda 5-0 alrededor de LCCA, y entonces temporalmente ICA Sujete con un clip vascular de micro.</li>
	<li>Realice una pequeña incisión en el LCCA antes la corbata suelta previamente colocado, inserte una sutura de nylon de silicio de 4-0 en el espacio luminal del ICA y apretar la sutura alrededor el LCCA para asegurar la sutura de nylon y evitar fugas de sangre.</li>
	<li>Retire el clip vascular de micro de la ACI. Luego, avanzar un filamento revestido intramural de silicio hasta observar una disminución marcada de rCBF que indica oclusión del origen MCA. Al final del período isquémico (90 min), iniciar la reperfusión retirando la sutura intraluminal del21.</li>
</ol>3. vena yugular la canulación y Evans azul (EB) inyección
<ol><li>Realizar una incisión longitudinal de 1 cm en el cuello en el lado izquierdo de la línea media y luego diseccionar sin rodeos a fascia superficial para acceder a la rama externa de la vena yugular izquierda (LGV). Luego, ligar permanentemente el extremo craneal de la línea de alta velocidad con sutura de seda 5-0. Libremente Ponga dos lazos alrededor de la vena y luego Sujete temporalmente el cardiaco final de la línea de alta velocidad con una abrazadera de micro vascular.</li>
	<li>Realice una pequeña incisión en la línea de alta velocidad entre dos suturas y luego inserte el catéter suero heparinizado llenado en el espacio luminal de la LGV y avanzar aproximadamente 10 mm. después, apriete las ligaduras alrededor de la vena para asegurar el catéter y evitar el sangrado. Inyectar pequeñas cantidades de suero para evitar el colapso de la vena.</li>
	<li>Al principio del período de reperfusión, inyecte lentamente tinte EB (1 mL/kg de solución al EB 2% en solución salina) durante 5 minutos. Posteriormente, lavar la cánula de la inyección de solución salina normal 0,5 mL y retirar la cánula de inyección de la vena12,22.</li>
	<li>Por último, suturar las incisiones en cabeza y cuello e inyectar 0,05 mg/kg de buprenorfina por vía intraperitoneal (IP) y repetir la inyección cada 6-8 h durante el período de reperfusión para analgesia postoperatoria de17.</li>
	<li>Inyectar 5 mL de saline(IP) precalentado para proporcionar la hidratación en la jaula de recuperación17.</li>
	<li>El animal en una jaula de recuperación equipado con control de temperatura y aire acondicionado y supervisar la recuperación del animal de la anestesia.</li>
</ol>4. evaluación de la permeabilidad de la barrera sangre cerebro
<ol><li>Después de 24 h de la reperfusión, profundamente anestesiar el animal con tiopental sódico. A continuación, abrir la cavidad torácica haciendo un agujero pequeño debajo del esternón.</li>
	<li>Hacer una pequeña apertura en la aurícula derecha e inyectar 250 mL de solución salina 0.9% precalentado (37 ° c) a una presión de 110 mmHg a través del ventrículo izquierdo por 15 min a lavar EB de la circulación hasta que las salidas de solución Salinas normales desde la aurícula llega a ser descolorido23.</li>
	<li>Quitar inmediatamente el cerebro del cráneo y colocarlo en la matriz del cerebro. Disecar el bulbo olfatorio y el cerebelo, y entonces usando una cuchilla de limpiar, separar el hemisferio derecho del cerebro de la izquierda (Lesioned) a lo largo de la línea media.</li>
	<li>Pesan cada hemisferio y homogeneizar por separado en 2,5 mL de tampón fosfato salino y mezclar esto con 2,5 mL de ácido tricloroacético (60%) durante 2 min con una máquina de vórtice.</li>
	<li>Centrifugar las muestras de cerebro durante 30 min a 1.322 x g y permita que las muestras se enfríe en el refrigerador de 4 ° C durante 10 minutos.</li>
	<li>Utilice los sobrenadantes para calcular la absorbancia de EB por un espectrofotómetro a 610 nm23.</li>
	<li>Calcular las concentraciones de EB contra una curva estándar y resultados expresados como μg/g de tejido cerebral.</li>
</ol>5. producción de la curva estándar de EB
<ol><li>Preparar soluciones de muestra 10 de EB con concentraciones de 1-10 μg de EB en 5 mL de tampón fosfato salino.</li>
	<li>Medir la absorbancia de cada muestra a 610 nm usando un espectrofotómetro.</li>
	<li>Hacer un gráfico de dispersión con una hoja de cálculo y presente concentraciones de EB en el eje X y los valores de absorbancia en el eje Y (figura 1).</li>
	<li>Definir una línea de tendencia lineal para la curva con su ecuación. Entonces, se usa para obtener la concentración de la EB de las muestras.</li>
	<li>Informar sobre los resultados finales de la extravasación de EB como μg/g del peso de tejido cerebral.</li>
</ol>6. simulacro de operación
<ol><li>Realizar el mismo proceso quirúrgico con las ratas en el grupo sham-funcionado (incluyendo haciendo una incisión en la región del cuello y la inyección de EB) pero excluye la MCAO.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hasta el momento, varios métodos tales como autorradiografía y detección de los trazadores radiactivos24,25, inmunofluorescencia microscopía26,27y EB extravasación técnica20, 23 se han utilizado para evaluar el daño de la barrera blood - brain. Tinte EB es fuertemente capaz de atar a la albúmina de suero y se utiliza como trazador para detectar f...

Edema cerebral de vasogenic debido a la interrupción de la barrera blood - brain (BBB) sigue siendo una complicación importante de ictus isquémico y un determinante de la tasa de supervivencia en los pacientes de accidente cerebrovascular1,2. La barrera blood - brain (BBB), que está formada por células endoteliales capilares del cerebro (BCECs) y compuesta de neurovascular distintos componentes (por ejemplo, uniones estrechas entre células neuronales3, BCECs, pericitos y astroglial), proporciona un especializada y dinámica interfaz entre el sistema nervioso central (SNC) y la circulación de la sangre periférica4,5. Insultos tales como lesiones de isquemia-reperfusión podrían interrumpir la integridad funcional de la BBB y conducen a la penetración posterior de leucocitos que circulan en el parénquima cerebral que finalmente desencadenan la inflamación cerebral y lesiones cerebrales primarias 6 , 7. modelos animales son necesarios para la detección exacta de la disfunción del BBB después de ocurrencia de un accidente cerebrovascular. Estos modelos son de gran importancia para el estudio subyacente mecanismos fisiopatológicos y la introducción de nuevas estrategias neuroprotectoras. In vitro de la célula cultura modelos basados en el BBB han sido altamente desarrollados y utilizado para el estudio molecular de la BBB Fisiopatología8,9,10. Sin embargo, en vivo los modelos animales, que producen el daño isquémico de la BBB similar a condiciones clínicas humanas, están también vale la pena en este sentido. Detección cuantitativa de la extravasación de azul de Evans (EB) es una técnica bien aceptada y sensible que se ha utilizado para la evaluación de la integridad BBB y la función en las enfermedades neurodegenerativas, incluyendo accidente cerebrovascular isquémico11, 12 , 13 , 14. este método es rentable, factible, reproducible y totalmente aplicable en cualquier laboratorio experimental. Su aplicación no requiere de equipos avanzados, tales como trazadores radiactivos15 o la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI)16, que son requisitos previos para otros métodos. En este artículo demostramos comprensivo procesos técnicos básicos de evaluación de BBB con extravasación de EB en modelos de rata de accidente cerebrovascular isquémico.

<table><tbody><tr><td>Isoflurano</td><td>Piramal</td><td>AWN 34041100</td><td>20 - 25 &deg; C</td></tr><tr><td>2,3,5-Cloruro de trifeniltetrazolio (TTC)</td><td>Molekula</td><td>31216368</td><td>4 años</td></tr><tr><td>Sprague&ndash; Ratas Dawley&nbsp;</td><td>Instituto de pastos (Teherán, Irán)</td><td></td><td>300-350g</td></tr><tr><td>Evans Blue&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>314-13-6</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tricloroacético&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>76-03-9</td><td>2 años</td></tr><tr><td>Bupivacaína HCl (0.5%)</td><td>Delpharm Tours</td><td></td><td>abajo&nbsp; 25 &deg; C</td></tr><tr><td>Bupernorfina</td><td>Exir (Irán)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>497-19-8</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Di- Hidrogenofosfato de sodio</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td>231-448-7</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>&nbsp; 7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>silicona (xantopren)</td><td>Heraeus</td><td>EN ISO 4823</td><td></td></tr><tr><td>Activador universal plus</td><td>Heraeus</td><td>66037445</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de microdisección</td><td>Stoelting</td><td>52100-41</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de muelle</td><td>Stoelting</td><td>52130-00</td><td></td></tr><tr><td>Operativas&nbsp; Tijeras</td><td>Roboz</td><td>52140-70</td><td></td></tr><tr><td>Matriz cerebral&nbsp;</td><td>Stoelting</td><td>51390</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de anestesia para animales pequeños |</td><td>&nbsp; Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Power Lab</td><td>AD Instruments</td><td>ML880</td><td></td></tr><tr><td>Caudalímetro láser Doppler</td><td>AD Instruments</td><td>ML191</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de retroalimentación de calefacción</td><td>Harvard Appratus</td><td>72-7560</td><td></td></tr><tr><td>Micropinza vascular</td><td>FineScience Tools</td><td>18055-03</td><td></td></tr><tr><td>Hilo de sutura Silk 5-0</td><td>Ethicon</td><td>682G</td><td></td></tr><tr><td>Hilo de sutura Ethilon 4-0&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>EH6740G</td><td></td></tr></tbody></table>

una evaluación in vivo de la interrupción de la barrera blood - brain en un modelo de rata de ictus isquémico

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Accidente cerebrovascular isquémico conduce a edema cerebral vasogénico y lesión cerebral primaria posterior, que es mediada a través de la destrucción de la barrera blood - brain (BBB). Ratas con ictus isquémico inducido fueron establecidas y utilizadas como modelos en vivo para investigar la integridad funcional de la BBB. Detección espectrofotométrica de azul de Evans (EB) en las muestras de cerebro con lesión isquémica podría proporcionar justificación confiable para la investigación y desarrollo de nuevas modalidades terapéuticas. Este método genera resultados reproducibles y es aplicable en cualquier laboratorio sin necesidad de equipo especial. Presentamos una pauta técnica y visualizada en la detección de la extravasación de EB tras inducción de movimiento isquémico en ratas.

No hubo diferencias significativas en los niveles EB en el hemisferio derecho versus hemisferio izquierdo de las ratas sham-funcionado (1,06 ± 0.1 μg/g y 1,1 ± 0.09 μg/g, respectivamente). Como se muestra en la figuras 2A-2B, inducción de isquemia transitoria (90 min de isquemia / reperfusión de 24 h) causó una diferencia significativa en los niveles de EB (10,41 ± 0.84 μg/g, p &lt; 0.001) en el hemisferio izquierdo de ratas isquémicas, en comparación con el resp...

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar una técnica muy reproducible para evaluación en vivo de la interrupción de la barrera blood - brain en modelos de rata de accidente cerebrovascular isquémico.

Una evaluación In Vivo de la interrupción de la Barrera Blood - Brain en un modelo de rata de ictus isquémico

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

El objetivo general de este procedimiento es presentar un método altamente reproducible de una evaluación in vivo de la ruptura de la barrera hematoencefálica en un modelo de reacción de accidente cerebrovascular isquémico. Esto se logra mediante la inducción de un accidente cerebrovascular isquémico utilizando filamento intraluminal para la oclusión de la arteria cerebral media en el lado izquierdo del cerebro. El siguiente paso del procedimiento es la canulación de la rama externa de la vena yugular y la inyección de tinte azul de Evans al final de la oclusión de la arteria cerebral media y el comienzo del período de reperfusión.Veinticuatro horas más tarde, bajo anestesia profunda, el sistema circulatorio del animal se lava de Evans Blue y se extrae el cerebro. A continuación, se separan, homogeneizan y centrifugan dos hemisferios cerebrales y, en última instancia, se utilizan sobrenadantes de tejidos para medir la concentración de azul de Evans con un espectrofotómetro. Anestesia y flujometría.Inducir la anestesia con isoflurano al 4% y mantenerla con isoflurano al 1-1,5% en una mezcla de 70% de óxido nitroso y 13% de oxígeno durante la cirugía. Coloque al animal anestesiado en

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este vídeo muestra un procedimiento para evaluar la alteración de la barrera hematoencefálica en un modelo de ratón EAE. Los tintes fluorescentes de diferentes tamaños se inyectan retroorbitalmente y circulan a través de los vasos sanguíneos del cerebro. El tinte más pequeño se filtra a través de los espacios en el tejido cerebral, mientras que el tinte más grande ingresa solo si la interrupción es grave, lo que se correlaciona con el grado del daño de la barrera.

Determinación de la disrupción de la barrera hematoencefálica mediante colorantes fluorescentes en un modelo de ratón EAE

Este video muestra la evaluación de la zona de infarto y el edema cerebral en cortes de cerebro de ratas sometidas a oclusión de la arteria cerebral media. Las áreas infartadas se identifican mediante tinción redox, mientras que un filtro azul y una función de umbral en el software de análisis de imágenes cuantifican la zona de infarto y el edema en el hemisferio afectado.

Medición de la zona de infarto y el edema cerebral en el cerebro de una rata después de la oclusión de la arteria cerebral media

Fuente: Kuts, R. et al. Lesión cerebral inducida por láser en la corteza motora de ratas. J. Vis. Exp. (2020)Este video demuestra la evaluación de la integridad de la barrera hematoencefálica (BBB) después de una lesión cerebral inducida por láser en ratas. Se inyecta un tinte de rastreo en la vena de la cola, lo que permite que circule al cerebro y se filtre en el tejido a través de la BHE dañada. A continuación, se extrae el cerebro y se procesa para liberar el tinte. La intensidad de...

Evaluación de la integridad de la barrera hematoencefálica en un modelo de rata con lesiones cerebrales inducidas por láser 

Hematoencefálica interrupción de la barrera ayuda a la entrega de ciertos medicamentos para el cerebro. Manitol entregado intraarterial células se contrae los vasos sanguíneos circundantes con el fin de perturbar físicamente la barrera.

Modelo de rata de ruptura de la barrera sangre-cerebro para permitir dirigida Therapeutics neurovascular

Este protocolo describe el precondicionamiento hipóxico repetitivo, o exposiciones breves a la hipoxia sistémica que reducen los volúmenes de infarto y la interrupción de la barrera hematoencefálica después de una oclusión transitoria de la arteria cerebral media en ratones. También detalla la cuantificación dual del volumen del infarto y la alteración de la barrera hematoencefálica después de un accidente cerebrovascular para evaluar la eficacia de la protección neurovascular.

Cuantificación de Protección neurovascular Siguiendo repetitivo hipóxico Precondicionamiento y transitoria cerebral media oclusión de la arteria en ratones

En este estudio, presentamos un procedimiento fácil y eficiente para evaluar la interrupción de la barrera sangre - cerebro en enfermedades neurodegenerativas. Para lograr nuestro objetivo, nos infunde isotiocianato de fluoresceína de alto peso molecular etiquetado (FITC)-albúmina en yugular de ratón de la vena y evaluado su salida en el parénquima cerebral por microscopía de fluorescencia.

Evaluación de la permeabilidad de la barrera hemato - encefálica por infusión intravenosa de albúmina marcado con FITC en un modelo murino de enfermedad neurodegenerativa

Aquí presentamos un ensayo de permeabilidad vascular de cerebro de ratón mediante inyección intraperitoneal de trazadores fluorescentes seguido de perfusión que es aplicable a los modelos animales de disfunción de la barrera blood - brain. Una hemi-cerebro se utiliza para evaluar cuantitativamente la permeabilidad y el otro para tracer visualización/immunostaining. El procedimiento toma 5-6 h por 10 ratones.

Un en Vivo Barrera Blood - brain permeabilidad ensayo en ratones usando fluorescencia etiquetada trazadores

Este protocolo describe una novedosa técnica de medir los tres parámetros más importantes de la lesión cerebral isquémica en el mismo conjunto de muestras cerebrales de roedores. El uso de una sola muestra cerebral es altamente ventajoso en términos de costos éticos y económicos.

Medición del edema cerebral post-accidente cerebrovascular, zona infarta y descomposición de la barrera hematoencefálica en un solo conjunto de muestras cerebrales de roedores

Se desarrolló un método para visualizar la extravasación del tinte debido a la ruptura de la barrera hematoencefálica (BBB) mediante la administración de dos tintes fluorescentes a ratones en diferentes puntos de tiempo. El uso de glicerol como crioprotector facilitó la inmunohistoquímica en la misma muestra.

Evaluación de la ruptura de la barrera hematoencefálica en un modelo de ratón de lesión cerebral traumática leve

Los modelos in vivo de ratas son herramientas indispensables para investigar los mecanismos patológicos y las dianas terapéuticas del ictus isquémico. Este trabajo describirá la realización de tinciones de inmunofluorescencia en cortes de cerebro infartados después de la oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) en ratas.

Evaluación de la señalización de la muerte celular por inmunofluorescencia en un modelo de rata de accidente cerebrovascular isquémico

Aprende a evaluar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica en ratas tras ictus isquémico mediante inyección de azul de Evans y espectrofotometría. Este método permite cuantificar la disrupción vascular cerebral.

Una evaluación In Vivo de la interrupción de la Barrera Blood - Brain en un modelo de rata de ictus isquémico

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