Una evaluación In Vivo de la interrupción de la Barrera Blood - Brain en un modelo de rata de ictus isquémico

El objetivo general de este procedimiento es presentar un método altamente reproducible de una evaluación in vivo de la ruptura de la barrera hematoencefálica en un modelo de reacción de accidente cerebrovascular isquémico. Esto se logra mediante la inducción de un accidente cerebrovascular isquémico utilizando filamento intraluminal para la oclusión de la arteria cerebral media en el lado izquierdo del cerebro. El siguiente paso del procedimiento es la canulación de la rama externa de la vena yugular y la inyección de tinte azul de Evans al final de la oclusión de la arteria cerebral media y el comienzo del período de reperfusión.

Veinticuatro horas más tarde, bajo anestesia profunda, el sistema circulatorio del animal se lava de Evans Blue y se extrae el cerebro. A continuación, se separan, homogeneizan y centrifugan dos hemisferios cerebrales y, en última instancia, se utilizan sobrenadantes de tejidos para medir la concentración de azul de Evans con un espectrofotómetro. Anestesia y flujometría.

Inducir la anestesia con isoflurano al 4% y mantenerla con isoflurano al 1-1,5% en una mezcla de 70% de óxido nitroso y 13% de oxígeno durante la cirugía. Coloque al animal anestesiado en decúbito prono sobre una manta calefactora de control de retroalimentación y mantenga la temperatura corporal en el rango fisiológico normal por medio de una sonda rectal conectada a esta unidad de calentamiento. Afeitar la región de la cirugía en el lado izquierdo del cráneo y aplicar la solución de Betadine con una gasa para desinfectar la piel.

Reemplácelo con una almohadilla estéril que contenga 70% de etanol y repita ambos pasos con tres ciclos. Haga una incisión de un centímetro de largo en la piel del cráneo que se extienda desde el canto lateral del ojo izquierdo hasta la base de la oreja izquierda y diseccione el músculo temporal izquierdo para exponer el cráneo. A continuación, corte un pequeño orificio a cinco milímetros lateral y un milímetro posterior al bregma para facilitar la colocación de la punta de la sonda de lápiz del caudalímetro Doppler.

Gire la rata de posición prona a supina y luego coloque la sonda de lápiz láser en el orificio del cráneo previamente perforado para monitorear el flujo sanguíneo cerebral regional. Registre el flujo sanguíneo cerebral regional basal de cada animal y considérelo como 100%Inducción de la isquemia cerebral focal. Afeitar la región del cuello y desinfectar la piel con solución de Betadine y etanol al 70%.

Inyecte 0,2 mililitros de bupivacaína al 0,5% por vía subcutánea en el sitio de la cirugía para la analgesia. Realizar una incisión quirúrgica de dos centímetros de largo en la superficie ventral del cuello para acceder a la arteria carótida común izquierda. Aísle la arteria carótida común de la fascia vecina y del nervio vago para acceder a la bifurcación de la arteria carótida externa y la arteria carótida interna.

Ligue permanentemente la arteria carótida común izquierda o la arteria carótida externa empleando una sutura de saco 5-0 y diseccione la arteria carótida interna hasta el nivel de la arteria pterigopalatina. Coloque sin apretar una sutura de saco 5-0 alrededor de la arteria carótida común y luego pinje temporalmente la arteria carótida interna con un microclip vascular. Haga una pequeña incisión en la arteria carótida común antes de la atadura suelta previamente colocada y luego inserte una sutura de nailon recubierta de silicona 4-0 en el espacio luminal de la arteria carótida interna y apriete la sutura alrededor de la arteria carótida común para asegurar la sutura de nailon y evitar fugas de sangre.

Retire el microclip vascular de la arteria carótida interna. A continuación, avance el filamento intraluminal recubierto de silicona hasta observar una marcada disminución del flujo sanguíneo cerebral regional que indica una oclusión del origen de la arteria cerebral media. En particular, se inicia la oclusión de la arteria cerebral medial, donde se detecta una disminución del flujo sanguíneo cerebral regional de más del 80%.

En este modelo, bloqueamos temporalmente la arteria pterigopalatina, utilizando una micropinza para guiar el filamento correctamente hacia la vía auricular. Tenga en cuenta que este paso es muy importante para el éxito de la oclusión de la arteria cerebral medial. Canulación de la vena yugular e inyección de Evans Blue.

Haga una incisión longitudinal de un centímetro en el cuello hacia el lado izquierdo de la línea media y luego diseccione sin rodeos la fascia superficial para acceder a la rama externa de la vena yugular izquierda. A continuación, ligar permanentemente el extremo cornual de la vena yugular con una sutura de saco 5-0. Coloque sin apretar dos ataduras alrededor de la vena y luego sujete temporalmente el extremo cardíaco de la vena yugular con una micropinza vascular.

Hacer una pequeña incisión en la vena yugular con dos suturas y luego insertar un catéter heparinizado lleno de suero en el espacio luminal de la vena y avanzarlo aproximadamente 10 milímetros. Después, apriete las ligaduras alrededor de la vena para asegurar el catéter y evitar el sangrado. Inyecte una pequeña cantidad de suero para evitar el colapso de la vena.

Al final del período isquémico, es decir, 90 minutos, se inicia la reperfusión retirando la sutura intraluminal. Al comienzo del período de reperfusión, inyecte lentamente el tinte Evans Blue un mililitro por kilogramo de solución salina al 2% durante un período de cinco minutos. Posteriormente, lavar la cánula mediante inyección de suero fisiológico normal de 0,5 mililitros y retirar la cánula inyectora de la vena.

Nótese el cambio de color del tejido después de la inyección de Evans Blue. Finalmente, sutura las incisiones del cuello y la cabeza y coloca al animal en una jaula de recuperación. Valoración de la permeabilidad de la barrera hematoencefálica.

Después de 24 horas de reperfusión, anestesiar profundamente al animal con tiopental sódico. Luego, abra la cavidad torácica haciendo un pequeño orificio debajo del esternón. Haga una pequeña abertura en la aurícula derecha e inyecte 250 mililitros de solución salina precalentada a través del ventrículo izquierdo durante 15 minutos para lavar Evans Blue de la circulación hasta que la solución salina normal que queda fuera de la aurícula se vuelva incolora.

Retire inmediatamente el cerebro del cráneo y colóquelo en la matriz cerebral. Diseccione el bulbo olfatorio y el cerebelo y luego, con una cuchilla de afeitar limpia, separe el hemisferio derecho del cerebro del izquierdo a lo largo de la línea media. Pesar cada hemisferio y homogeneizarlos por separado en solución salina tamponada con fosfato de 2,5 mililitros y luego mezclarlo con 2,5 mililitros de ácido tricloroacético al 16% durante dos minutos utilizando una máquina de vórtice.

Centrifuga las muestras de cerebro durante 30 minutos y deja que se enfríen en la nevera durante 10 minutos. Utilice los sobrenadantes para estimar la absorbancia del azul de Evans mediante un espectrofotómetro a 610 nanómetros. Resultados representativos.

En los animales operados de forma simulada, la concentración de azul de Evans de los tejidos preparados para ambos hemisferios del cerebro es muy pequeña y no hay diferencia significativa en comparación entre sí. La inducción de isquemia durante 90 minutos seguida de 24 reperfusiones causó un aumento significativo en los niveles de azul de Evans en el hemisferio lesionado del cerebro en ratas isquémicas. En conjunto, estos hallazgos indican que, en condiciones normales, Evans Blue no puede cruzar fácilmente la barrera hematoencefálica hacia el parénquima cerebral y las lesiones isquémicas cerebrales inducen la extravasación de Evans Blue a través de una permeabilidad interna de la barrera hematoencefálica.

La fotografía muestra el cerebro de los animales operados simuladamente e isquémicos. Tenga en cuenta que la intensidad de la extravasación del azul de Evans en el tejido cerebral de color azul surge de la extensión de la interrupción de la barrera hematoencefálica en el hemisferio lesionado. Conclusión. La evaluación in vivo de la barrera hematoencefálica permite a los investigadores estudiar los posibles mecanismos fisiopatológicos del edema cerebral vasogénico inducido por isquemia y encontrar nuevas intervenciones terapéuticas.

Esta técnica es sencilla y fiable. Un investigador debe tener en cuenta algunos puntos técnicos para mejorar aún más el rendimiento de la técnica y garantizar su precisión. El registro constante del flujo sanguíneo cerebral regional con un medidor de flujo láser Doppler y el uso de filamento recubierto de silicona puede aumentar la tasa de éxito de MCAO y reducir la tasa de mortalidad.

La dosis y el momento de la inyección son dos parámetros esenciales para obtener resultados fiables debido a la naturaleza dinámica de la barrera hematoencefálica tras las lesiones isquémicas.