Name: Equivalentes tridimensionales tejido humano inflamatorio de la encía (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprende a reconstruir un modelo tridimensional de encía inflamatoria humana in vitro utilizando queratinocitos HaCaT, fibroblastos gingivales y macrófagos THP-1. Este método avanzado permite estudiar la inflamación y regeneración tisular en enfermedades periodontales.

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Este trabajo fue apoyado en parte por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) subvenciones para la investigación científica (26861689 y 17 K 11813). Los autores desean agradecer al Sr. Nathaniel Green por corrección.

Este protocolo está diseñado para crear equivalentes de tejido gingival humano, modelos de heridas gingivales y gingivitis modelos. Queratinocitos epidérmicos de la piel humana (HaCaT) fueron amablemente proporcionados del Profesor Norbert E. Fusenig de Deutsches Krebsforschungszentrum (Heidelberg, Alemania)7. Los fibroblastos gingivales humanos (HGFs) fueron aislados de tejidos gingivales según los protocolos previamente publicados8. El consentimiento informado fue obtenido previamente y el estudio fue aprobado según los lineamientos establecidos por el Comité de ética, la Nippon Dental University Facultad de vida Odontología de Tokio (número de autorización: NDU-T2012-35). Pasos del protocolo 1 al 3 deben realizarse en una campana de cultivo celular.
1. preparación de los equivalentes de tejido humano 3D de encía (GTE) (figura 1A)
<ol><li>Mezclar colágeno tipo-un gel con 10% concentrado MEM-alfa y reconstrucción 10% buffer (2,2 g de NaHCO3 y 4,47 g HEPES en 100 mL 0.05 N NaOH) en un tubo de 15 mL estéril mediante pipeteo. Mantener la solución de colágeno mezclado en hielo hasta su uso.</li>
	<li>Colocar insertos de cultura 24-well (poro tamaño 3.0 μm) en una placa de 24 pocillos.</li>
	<li>
Quitar HGFs de la superficie de cultivo con solución al 0.25% tripsina-EDTA. Suspender las células en 10 mL de medio de cultivo A (MEM-alfa + 20% FBS + 1% GlutaMAX). Contar las células de un contador de células de Türk Bürker.
	<ol>
<li>Extraer la cantidad deseada de las células (1-5 x105 células/mL) y centrifugar durante 4 min a 190 x g.</li>
		<li>Suspender las células en la solución de colágeno mixta. Mantenga la mezcla en hielo hasta el siguiente paso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Agregar 0,5 mL de la mezcla de células de colágeno (0,5 – 2,5 x 105 células/pocillo) en el inserto de cultura sin producir burbujas. Incubar la mezcla por 10-30 min en una atmósfera humidificada con 5% CO2 a 37 º C para coagular la mezcla en un gel. Nota: Agregar la mezcla de colágeno en el centro de la inserción de la cultura para evitar la formación desigual del gel de colágeno.</li>
	<li>Añadir 1 mL de medio de cultivo en el pozo y 0,5 mL en el inserto. Incubar la placa de cultivo de 24 h o toda la noche en una atmósfera humidificada con 5% CO2 a 37 ° C.</li>
	<li>Eliminar las células HaCaT desde la superficie de cultivo con solución al 0.25% tripsina-EDTA. Suspender las células en 10 mL de medio B (DMEM 10% FBS + 1% GlutaMAX) y contar las células. Extracto de la cantidad necesaria de células (1 – 5 x 105 células/mL) con una pipeta, centrifugar durante 4 min a x 190 g. suspender las células en medio B.</li>
	<li>Retire el medio de los insertos de la cultura, que contienen la mezcla de HGF-colágeno, por la aspiración. Agregar 0,5 mL de suspensión de células HaCaT (0,5 – 2,5 x 105 células/pocillo) en la parte superior de la mezcla de HGF-colágeno. Incubar los cultivos para 24 horas o durante la noche. Nota: En este momento, el medio de la cultura bien debe ser A medias, mientras que el medio de la inserción de la cultura debe ser medio B.</li>
	<li>Reemplazar el medio de cultivo con KSR medio (co-cultivo) (MEM-alfa + 15% nocaut suero recambio + 1% GlutaMAX) + 5% FBS. Añadir 1 mL de medio de cultivo en la cultura bien y 0,5 mL en el inserto de la cultura. Incubar los cultivos durante 24 – 48 h.</li>
	<li>Reemplazar el medio de cultivo con medio KSR + 1% FBS. Añadir 1 mL en la cultura bien y 0,5 mL en el inserto de la cultura. Incubar los cultivos para 24 horas o durante la noche.</li>
	<li>Reemplazar el medio de cultivo en la cultura con 0,7 – 1 mediano KSR de mL. Retire completamente el medio de la inserción de la cultura (la superficie de la cultura debe estar expuesta al aire). Incubar los cultivos durante 1 – 2 semanas. Cambiar el medio en la cultura bien dos veces por semana. Nota: No deje que el aumento del nivel medio sobre la superficie de cultivo (la capa superior compuesta de queratinocitos). Mantenga la superficie de cultivo seco.</li>
</ol>2. preparación de GTE herido (figura 1B)
<ol><li>Preparar un golpeador de tejido de 1 – 3 mm de diámetro. Esterilizar con un autoclave a 121 ° C durante 20 minutos.</li>
	<li>Introduzca el punzón de tejido perpendicular GTE sobre 300 μm de profundidad y perforar un agujero en el tejido para simular una herida.</li>
	<li>En este paso, utilice el GTE de heridos para la investigación de regeneración de tejido y cicatrización de herida. Por otra parte, fijar GTE uso tampón neutro de formalina al 10% para realizar el análisis histológico.</li>
</ol>3. preparación de GTE inflamatoria (iGTE) (figura 1B)
<ol><li>Cultivar células THP-1 según el anterior informe9.</li>
	<li>Mezclar colágeno tipo-un gel con 10% concentrado RPMI 1640, almacenador intermediario de la reconstrucción de 10% (2,2 g de NaHCO3 y 4,47 g HEPES en 100 mL 0.05 N NaOH) y 10 ng/mL PMA. No la solución de colágeno mezclado en hielo hasta su uso.</li>
	<li>Cuenta de 1-2 x 106 THP-1 células y centrifugar durante 4 min a x 190 g. suspender las células en 1 mL de la solución de colágeno mixta. Mantenga la mezcla en hielo hasta el siguiente paso.</li>
	<li>Añadir mezcla de 10-30 μL THP-1-colágeno en el área de heridos de GTE. Reemplazar el medio de cultivo a 0,7 – 1 medio KSR de mL que contiene 10 ng/mL de PMA.</li>
	<li>Incubar la mezcla en una atmósfera humidificada con 5% CO2 a 37 ° C por 72 h.</li>
	<li>Utilizar el modelo para la investigación de gingivitis o enfermedad periodontal (por ejemplo, añadir potencial medicamento antinflamatorio a iGTE a ver sus efectos en el cytokine release10). Como alternativa, omite 72 h PMA-tratamiento, añadir 2 μg/mL de LPS en la cultura e incubar el tejido en una atmósfera humidificada con 5% CO2 a 37 ° C por 48 h11,12.</li>
</ol>4. la fijación y el Immunostaining de montar toda de GTE y iGTE culturas
<ol><li>
Fijación de las culturas.
	<ol>
<li>Retire el medio de cultivo de la placa de 24 pocillos. Lavar los tejidos 2 veces con tampón fosfato salino (PBS).</li>
		<li>Añadir 1 mL de formol al 10% buffer neutro solución el prospecto y 1 mL a la cultura también. Deje la placa de 24 pocillos en un refrigerador a 4 ° C durante la noche.</li>
		<li>Retire la solución de tampón neutro de formalina 10% al día siguiente.</li>
		<li>Por todo Monte immunostaining, lavar los tejidos 3 - 4 veces con PBS después de la fijación.</li>
		<li>De hematoxilina y eosina (H & E) coloración y immunostaining regular, proceder con la deshidratación, inclusión en parafina y seccionamiento. Nota: Para todo immunostaining de Monte, puede omitirse este paso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Todo Monte inmunotinción Nota: Este protocolo fue modificado de la referencia 13.<ol>
<li>Lavar los tejidos 3 x en PBS 0.5 – 1% Triton, 10-30 min cada vez.</li>
		<li>Incubar los tejidos dos veces por 30 min en solución amortiguadora de bloqueo (PBS 1% Tritón + BSA de 10%), a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavar los tejidos 2 × en solución amortiguadora de bloqueo, 5 – 10 min cada vez.</li>
		<li>Añadir 50 μl de solución de anticuerpo primario en la dilución/concentración requerida a los insertos. Utilice una película delgada transparente plástico para envolver los insertos para evitar secar el tejido.</li>
		<li>Incubar el tejido durante 1 a 2 días a 4 ° C.</li>
		<li>Lavar los tejidos 3 veces, durante 30 minutos en PBS 1% Tritón + 10% de BSA. Lavar nuevamente 3 veces, durante 5 minutos en PBS 1% Triton.</li>
		<li>Añadir 50 μl de anticuerpo secundario en solución amortiguadora de bloqueo (PBS 1% Tritón + BSA de 10%) y 5 μl de solución de Hoechst 33342 (tinción de NucBlue en vivo de la célula) para cada insert. Utilice una película delgada transparente plástico para envolver los insertos para evitar secar el tejido.</li>
		<li>Incubar durante 1 a 2 días a 4 ° C. Envolver la placa de 24 pocillos en una toalla de papel húmeda y luego ponerlo en un envase plástico para ser utilizado a lo largo de la incubación.</li>
		<li>Lavar los tejidos 3 veces, durante 10 min en el Tritón de PBS 1%</li>
		<li>Utilice una aguja afilada para cortar la membrana de la inserción de la cultura para obtener el tejido. Colocar la membrana en un portaobjetos. Nota: El tejido debe estar en la membrana.</li>
		<li>Añadir 2-3 gotas de medio de montaje de fluorescencia. Cubrir el tejido con una cubierta de vidrio y conservar a 4 ° C en la oscuridad hasta su análisis.</li>
		<li>Ver los tejidos con un láser confocal de barrido microscopía (LSM).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+and+immune+pathways+in+the+pathogenesis+of+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontology+2000%22%5BJournal%5D)">Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease.</a> Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).</li>
<li>Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Inflammatory+Diseases+and+Systemic+Inflammation%3A+Role+of+the+Macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Oral Inflammatory Diseases and Systemic Inflammation: Role of the Macrophage.</a> Frontiers in Immunology. 3, 118(2012).</li>
<li>Koh, T. J., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+wound+healing%3A+The+role+of+the+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+reviews+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Inflammation and wound healing: The role of the macrophage.</a> Expert reviews in molecular medicine. 13, e23(2011).</li>
<li>Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+and+fibroblasts+during+inflammation+and+tissue+repair+in+models+of+organ+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Macrophages and fibroblasts during inflammation and tissue repair in models of organ regeneration.</a> Regeneration. 4 (2), 39-53 (2017).</li>
<li>Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Animal+Models+in+Periodontology%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Open+Dentistry+Journal%22%5BJournal%5D)">Experimental Animal Models in Periodontology: A Review.</a> The Open Dentistry Journal. 4, 37-47 (2010).</li>
<li>Han, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+Periodontal+Bacteria+and+Human+Oral+Epithelial+Cells%3A+Fusobacterium+nucleatum+Adheres+to+and+Invades+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interactions between Periodontal Bacteria and Human Oral Epithelial Cells: Fusobacterium nucleatum Adheres to and Invades Epithelial Cells.</a> Infection and Immunity. 68 (6), 3140-3146 (2000).</li>
<li>Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+keratinization+in+a+spontaneously+immortalized+aneuploid+human+keratinocyte+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line.</a> J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).</li>
<li>Xiao, L., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen-rich+water+achieves+cytoprotection+from+oxidative+stress+injury+in+human+gingival+fibroblasts+in+culture+or+3D-tissue+equivalents%2C+and+wound-healing+promotion%2C+together+with+ROS-scavenging+and+relief+from+glutathione+diminishment%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Cell%22%5BJournal%5D)">Hydrogen-rich water achieves cytoprotection from oxidative stress injury in human gingival fibroblasts in culture or 3D-tissue equivalents, and wound-healing promotion, together with ROS-scavenging and relief from glutathione diminishment.</a> Hum Cell. 30 (2), 72-87 (2017).</li>
<li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
<li>Ara, T., Kurata, K., Hirai, K., Uchihashi, T., Uematsu, T., Imamura, Y., Furusawa, K., Kurihara, S., Wang, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gingival+fibroblasts+are+critical+in+sustaining+inflammation+in+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Periodontal+Res%22%5BJournal%5D)">Human gingival fibroblasts are critical in sustaining inflammation in periodontal disease.</a> J Periodontal Res. 44 (1), 21-27 (2009).</li>
<li>Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+THP-1+differentiation+is+required+for+the+detection+of+responses+to+weak+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli.</a> Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).</li>
<li>Sharif, O., Bolshakov, V. N., Raines, S., Newham, P., Perkins, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+the+LPS+induced+NF-kappaB+response+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of the LPS induced NF-kappaB response in macrophages.</a> BMC Immunol. 8, 1(2007).</li>
<li>Abcam. Whole mount fluorescent immunohistochemistry. , Available from:
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<li>Shetty, S., Gokul, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinization+and+its+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Oman+Med+J%22%5BJournal%5D)">Keratinization and its disorders.</a> Oman Med J. 27 (5), 348-357 (2012).</li>
<li>Klinge, B., Matsson, L., Attström, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+of+initial+gingivitis+in+humans.+A+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Histopathology of initial gingivitis in humans. A pilot study.</a> J Clin Periodontol. 10 (4), 364-369 (1983).</li>
<li>Nagarakanti, S., Ramya, S., Babu, P., Arun, K. V., Sudarsan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+E-cadherin+and+cytokeratin+19+and+net+proliferative+rate+of+gingival+keratinocytes+in+oral+epithelium+in+periodontal+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of E-cadherin and cytokeratin 19 and net proliferative rate of gingival keratinocytes in oral epithelium in periodontal health and disease.</a> J Periodontol. 78 (11), 2197-2202 (2007).</li>
<li>Goodpaster, T., Legesse-Miller, A., Hameed, M. R., Aisner, S. C., Randolph-Habecker, J., Coller, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunohistochemical+method+for+identifying+fibroblasts+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> J Histochem Cytochem. 56 (4), 347-358 (2008).</li>
<li>Langeland, K., Rodrigues, H., Dowden, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodontal+disease%2C+bacteria%2C+and+pulpal+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Surg+Oral+Med+Oral+Pathol%22%5BJournal%5D)">Periodontal disease, bacteria, and pulpal histopathology.</a> Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 37 (2), 257-270 (1974).</li>
<li>Holness, C. L., Simmons, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+CD68%2C+a+human+macrophage+marker+related+to+lysosomal+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins.</a> Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).</li>
<li>Mor-Vaknin, N., Punturieri, A., Sitwala, K., Markovitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin+is+secreted+by+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vimentin is secreted by activated macrophages.</a> Nat Cell Biol. 5 (1), 59-63 (2003).</li>
<li>Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+squalane-dissolved+on+adipogenesis-accompanied+oxidative+stress+and+macrophage+in+a+preadipocyte-monocyte+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of squalane-dissolved on adipogenesis-accompanied oxidative stress and macrophage in a preadipocyte-monocyte co-culture system.</a> Biomaterials. 31 (23), 5976-5985 (2010).</li>
<li>Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+hydroxylated+fullerene+localizes+at+the+cytoskeleton+and+inhibits+oxidative+stress+in+adipocytes+and+a+subcutaneous+adipose-tissue+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Highly hydroxylated fullerene localizes at the cytoskeleton and inhibits oxidative stress in adipocytes and a subcutaneous adipose-tissue equivalent.</a> Free Radic Biol Med. 51 (7), 1376-1389 (2011).</li>
</ol>

Los autores no declaran conflicto de intereses.

Este protocolo se basa en métodos de creación de tejido gingival equivalentes y equivalentes de tejido adiposo subcutáneos, según anteriores informes8,21,22. Aunque este es un método simple y fácil, algunos pasos requieren especial atención. Por ejemplo, la mezcla de colágeno debe conservarse en hielo hasta su uso para evitar la formación de gel en la solución. Cuando se agrega la mezcla de colágeno en el inserto de la cultura, ...

Enfermedades periodontales son la principal causa de pérdida de dientes en adultos. Gingivitis y la periodontitis son las enfermedades periodontales más comunes. Ambos presentan cambios inflamatorios agudos o crónicos mediada por biofilms en encía. Gingivitis se caracteriza por inflamación aguda, mientras que la periodontitis se presenta generalmente como una inflamación crónica. A nivel histológico, los componentes bacterianos desencadenan la activación de las células inmunes como macrófagos, linfocitos, células plasmáticas y mastocitos1,2. Estas células inmunitarias, especialmente macrófagos, interactúan con las células locales (incluyendo las células epiteliales gingivales, fibroblastos, células endoteliales y osteoblastos) dando lugar a lesiones inflamatorias en el tejido periodontal3,4. Modelos experimentales de enfermedades periodontales se han establecido en varios tipos de animales, como ratas, hámsters, conejos, hurones, caninos y primates. Sin embargo, la fisiopatología de los modelos animales es diferente a la de los seres humanos, lo que hace difícil analizar mecanismos celulares y moleculares y evaluar nuevos medicamentos de enfermedades periodontales5. Co cultivo de bacterias periodontales y células epiteliales orales humanos monocapa se ha utilizado para investigar el mecanismo de las infecciones periodontales6. Sin embargo, cultivos monocapa de células orales carecen de la arquitectura celular de tridimensional (3D) de tejido intacto; por lo tanto, no imitan la situación en vitro .
Aquí, equivalentes 3D tejido humano inflamatoria de la encía (iGTE) se establecen para representar enfermedades periodontales en vitro. Este modelo 3D de las enfermedades periodontales ocupa una posición intermedia entre los cultivos celulares monocapa y en modelos animales. Tres tipos de células humanas, incluyendo queratinocitos HaCaT, fibroblastos gingivales y macrófagos THP-1, se cultivan conjuntamente en gel de colágeno y estimulados por inflamatorias iniciadores para construir iGTE. IGTE simula de cerca las condiciones en vivo de diferenciación celular, interacción célula-célula y activación de los macrófagos en la encía. Este modelo tiene muchas aplicaciones posibles de drogas evaluación y análisis de nuevas aproximaciones farmacológicas en enfermedades periodontales, así como para analizar los mecanismos celulares y moleculares en la cicatrización de heridas, inflamación y regeneración de los tejidos.

<table><tbody><tr><td>Colágeno tipo I-A</td><td>Nitta Gelatin Inc</td><td></td><td>Para hacer dermis de GTE</td></tr><tr><td>MEM-alpha</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11900073</td><td>Medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>Inserto de cultivo celular (para placa de 24 pocillos), tamaño de poro 3.0 &mu; m</td><td>Corning, Inc.</td><td>353096</td><td>para el cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>35050061 Reactivo de cultivo celular</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31600034</td><td>Medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>Reactivo de cultivo celular</td></tr><tr><td>Perforadora de tejidos</td><td>Shibata system service co., LTD</td><td>SP-703</td><td>Para perforación de agujeros en GTE</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31800022</td><td>Medio de cultivo celular</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td>Para inmunotinción</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (tinción de células vivas NucBlue)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37605</td><td>Para el etiquetado de núcleos</td></tr><tr><td>Medio de montaje de fluorescencia</td><td>Dako</td><td></td><td>Para el montaje de muestras después de la</td></tr> <tr><td>inmunotinciónAnticuerpo anti-citoqueratina 8 + 18 [5D3]</td><td>abcam</td><td>ab17139</td><td>Para identificar epitelio</td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de barrido</td><td>Hitachi, Ltd.</td><td>HITACHI S-4000</td><td>Para observar la topografía y la composición de la superficie de las muestras</td></tr><tr><td>Microscopía de barrido láser confocal</td><td>LSM 700; Carl Zeiss Microscopía Co., Ltd.</td><td>LSM 700</td><td>Para la observación de muestras de tinción de inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Anti-Citoqueratina 19 anticuerpo</td><td>abcam</td><td>ab52625</td><td>Para la identificación del epitelio</td></tr><tr><td>Anti-vimentina anticuerpo</td><td>abcam</td><td>ab92547</td><td>Para la identificación de fibroblastos y macrófagos activados</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-TE-7</td><td>Millipore</td><td>CBL271</td><td>Para la identificación de fibroblastos en la dermis</td></tr><tr><td>Anti-CD68 anticuerpo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB2700244</td><td>Para la identificación de macrófagos</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD14 humano</td><td>R& D Systems</td><td>MAB3832-SP</td><td>Para la identificación de macrófagos</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anticuerpo secundario conjugado contra cabras anti-conejo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11012</td><td>Para tinción por inmunofluorescencia</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anticuerpo secundario anti-ratón</td> contra cabras <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td>Para tinción por inmunofluorescencia</td>Sistema de adquisición de</tr><tr><td>imágenes celulares EVOS FL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Para la observación de la inmunofluorescencia de la muestra que tiñe</td></tr><tr><td>las células THP-1</td><td>Banco de células Riken BRC</td><td></td><td>RCB1189 Para la fabricación de iGTE</td></tr><tr><td>PMA (Forbol 12-miristato 13-acetato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td>Para diferenciar células THP-1</td></tr></tbody></table>

equivalentes tridimensionales tejido humano inflamatorio de la encía

Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva

Enfermedades periodontales (como gingivitis y periodontitis) son las principales causas de pérdida de dientes en adultos. Inflamación en la encía es la fisiopatología fundamental de las enfermedades periodontales. Actuales modelos experimentales de enfermedades periodontales se han establecido en varios tipos de animales. Sin embargo, la fisiopatología de los modelos animales es diferente a la de los seres humanos, lo que hace difícil analizar mecanismos celulares y moleculares y evaluar nuevos medicamentos para enfermedades periodontales. Aquí, presentamos un protocolo detallado para reconstruir equivalentes de humano tejido inflamatorio de la encía (iGTE) en vitro. Primero construimos equivalentes de tejido humano de la encía (GTE) utilizando dos tipos de células humanas, incluyendo fibroblastos gingivales humanos (HGF) y queratinocitos epidérmicos de la piel humana (HaCaT), bajo condiciones tridimensionales. Creamos un modelo de la herida usando un golpeador de tejido para hacer un agujero en el GTE. Próxima, humanas THP-1 monocitos mezclados con gel de colágeno se inyectan en el orificio del GTE. Por adimistration de 10 ng/mL forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) por 72 h, distinguen células THP-1 en macrófagos a focos inflamatorios forma en GTE (iGTE) (IGTE también puede ser stumilated con 2 μg/mL de los lipopolisacáridos (LPS) por 48 h para iniciar la inflamación ). IGTE es el primer modelo en vitro de encía inflamatorio con células humanas de una arquitectura tridimensional. IGTE refleja importantes cambios patológicos (immunocytes hidrógeno, interacciones intracelulares entre fibryoblasts, las células epiteliales, monocitos y macrófagos) en enfermedades periodontales. GTE, GTE herido y iGTE pueden utilizarse como herramientas versátiles para el estudio de la cicatrización de heridas, regeneración tisular, inflamación, interacción célula-célula y medicamentos potenciales pantalla para enfermedades periodontales.

Las células HaCaT muestran morfología típica del keratinocyte bajo observación microscópica de contraste de fase (figura 2A). Scanner electrón microscópico (SEM) las imágenes demostraron que las superficies de células HaCaT estaban cubiertas por microvellosidades muchos. Conexiones intercelulares entre las células HaCaT fueron mediadas por procesos de membrana (figura 2B). Las células HaCaT expresaron epitelio gingival marcador K...

El objetivo del protocolo es construir un modelo de inflamatoria gingival humano in vitro. Este modelo de tejido co cultiva tres tipos de células humanas, queratinocitos HaCaT, fibroblastos gingivales y macrófagos THP-1, en condiciones de tridimensionales. Este modelo puede aplicarse a la investigación de enfermedades periodontales como gingivitis y periodontitis.

Equivalentes tridimensionales tejido humano inflamatorio de la encía

Periodontal diseases (such as gingivitis and periodontitis) are the leading causes of tooth loss in adults. Inflammation in gingiva is the fundamental ...

El objetivo general de este experimento es reconstruir un modelo de tejido gingival inflamatorio en 3D mediante el uso de tres tipos de células humanas in vitro. Este método puede ayudar a estudiar la cicatrización de heridas, la regeneración de tejidos, la inflamación y detectar posibles medicamentos para las enfermedades periodontales. La principal ventaja de esta técnica es que se trata del primer método para construir un modelo in vitro de encía inflamatoria utilizando células humanas con una arquitectura tridimensional.En un tubo estéril de 15 mililitros, agregue colágeno tipo I-A, MEM-alfa concentrado al 10% y tampón de reconstrucción al 10%. Luego, deje la mezcla de colágeno en hielo hasta el próximo uso. A continuación, coloque los insertos de cultivo de 24 pocillos con un tamaño de poro de tres micrómetros en una placa de cultivo de 24 pocillos.A continuación, utilice una solución de tripsina-EDTA al 25% para separar los HGF del matraz de cultivo. A continuación, suspenda las células desprendidas en 10 mililitros de medio de cultivo. A continuación, cuente el número de celdas con un contador de células Burker-Turk.Después de aislar el número de células deseado, centrifugue las células a 190 veces g durante cuatro minutos. Luego, suspenda el pellet celular con la solución de colágeno y deje el tubo en hielo. A continuación, agregue 5 mililitros de mezcla de colágeno celular en el inserto de cultivo sin producir burbujas de aire.A continuación, incubar el inserto de cultivo con la mezcla de célula y colágeno a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 10 a 30 minutos. Después de la incubación, agregue un mililitro del medio de cultivo en el pocillo y 5 mililitros del medio en el inserto. Luego, incube la placa de cultivo a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante un día.A continuación, utilice el 25% de la solución de tripsina-EDTA para separar las células HaCaT de la placa de cultivo. Una vez que las células estén separadas, agregue 10 mililitros de medio B a las celdas. Luego, cuente el número de celular.Después de aislar el número de células deseado, centrifugue las células a 190 veces g durante cuatro minutos. Después de la centrifugación, disuelva el gránulo celular en el medio B. A continuación, aspire el medio del inserto de cultivo. A continuación, añade 5 mililitros de suspensión de células HaCaT sobre la mezcla de HGF y colágeno.Deje el inserto de cultivo en la incubadora durante un día. Al día siguiente, reemplace el medio de cultivo. Añadir un mililitro de medio KSR de cocultivo suplementado con un 5% de suero bovino fetal en el pocillo de cultivo y 5 mililitros en el inserto de cultivo.Luego, incube la placa de cultivo a 37 grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente, sustituya el medio de cultivo por un medio KSR de cocultivo complementado con suero bovino fetal al 1%. Retire todo el medio de cultivo tanto del inserto de cultivo como del pozo de cultivo después de 24 horas.A continuación, añada de 7 a un mililitro de medio KSR sólo en el pozo de cultivo, y continúe cultivando durante dos semanas. Recuerde cambiar el medio en el pozo de cultivo dos veces por semana. Prepare un punzón de tejido de uno a tres milímetros de diámetro y esterilice el punzón en el autoclave a 121 grados centígrados durante 20 minutos.Después de la esterilización, empuje el perforador de tejido perpendicularmente en GTE durante unos 30 micrómetros de profundidad para hacer una herida en el tejido. A continuación, mezcle 10 nanogramos por mililitro de PMA, 10% de tampón de reconstrucción y 10% de medio RPMI concentrado con gel de colágeno tipo I-A. Luego, deje la mezcla de colágeno en hielo hasta el próximo uso.A continuación, centrifugar las células THP-1 a 190 veces g durante cuatro minutos. Después de la centrifugación, suspenda el pellet celular en un mililitro de solución de colágeno y déjelo en hielo. Luego, agregue de 10 a 30 microlitros de la mezcla de células y colágeno THP-1 en el área lesionada del GTE.A continuación, sustituya el medio de cultivo por un medio KSR de 7 a un mililitro que contenga 10 nanogramos por mililitro de PMA. Luego, incube la mezcla a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante 72 horas. Para caracterizar el GTE reconstruido, se realiza tinción de H y E y microscopía electrónica de barrido.Las imágenes muestran a GTE exhibiendo una estructura de tejido similar a una encía con múltiples capas de epitelio y lámina propia. Las imágenes también muestran que las células HGF en los GTEs reconstruidos presentan características morfológicas distintivas de fibroblastos rodeados de fibras de colágeno. A continuación, se realiza una tinción de inmunofluorescencia para estudiar la expresión de marcadores dérmicos y epiteliales.Esto es para validar si GTE e iGTE tienen las características moleculares de la encía humana inflamatoria real. Las imágenes muestran que la vimentina y el TE-7 están fuertemente presentes en la lámina propia de GTE. K19, un marcador específico del epitelio de unión en la periodontitis, aunque se expresa débilmente en el epitelio GTE, es lo suficientemente fuerte en el epitelio iGTE.Finalmente, con el fin de generar los focos inflamatorios en iGTE, se inyectan monocitos THP-1 tratados con PMA en el área lesionada del tejido. A las 72 horas después del tratamiento con PMA, las células THP-1 se diferencian en células similares a los macrófagos. La inmunotinción de montaje completo confirmó que estas células expresan dos importantes marcadores de macrófagos, CD14 y vimentina, y formaron los focos inflamatorios.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres o cuatro semanas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe evitar la contaminación. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el uso de LPS para estimular las respuestas inflamatorias, con el fin de responder preguntas adicionales, como cómo inducir la inflamación a través de las interacciones huésped-biopelícula.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la inflamación, la regeneración de tejidos y la cicatrización de heridas exploraran el mecanismo celular y molecular y examinaran posibles medicamentos para las enfermedades periodontales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir un modelo de tejido gingival inflamatorio en 3D in vitro.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

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Aprende a reconstruir un modelo tridimensional de encía inflamatoria humana in vitro utilizando queratinocitos HaCaT, fibroblastos gingivales y macrófagos THP-1. Este método avanzado permite estudiar la inflamación y regeneración tisular en enfermedades periodontales.

Equivalentes tridimensionales tejido humano inflamatorio de la encía

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