Agregación del Receptor de superficie celular microscopia confocal revela a través espectroscopia de la correlación de imagen

El objetivo general de este protocolo de espectroscopia de correlación de imágenes es proporcionar una metodología accesible para la cuantificación de los eventos de agrupamiento que ocurren en la superficie de la célula. Los anticuerpos que se unen a los receptores en la superficie celular pueden conferir alteraciones de confirmación y agrupamiento. Los análisis de estos procesos dinámicos son importantes para la caracterización de las dianas farmacológicas.

La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una metodología accesible para la cuantificación de eventos de agrupamiento en la superficie celular utilizando aparatos de imagen de fácil acceso. Para empezar, siembra 10.000 células de carcinoma epidermoide A431 en cada pocillo de un portaobjetos de ocho cámaras. Al día siguiente, agregue 100 nanogramos por mililitro de ligando EGF inmediato a las células para estimular la agregación del receptor de EGF.

Incubar las células con el ligando a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de fijarlas. A continuación, siga el protocolo de inmunocitoquímica e imágenes confocales en el protocolo de texto adjunto, prestando mucha atención a la configuración utilizada durante la recopilación, y cargue los conjuntos de datos adquiridos en Fiji. Debe evitarse la sobresaturación.

Las imágenes finales deben contener tamaños de píxel de menos de 1 micra cuadrada. Además, capture una superficie plana en la superficie apical o basal, así como una región libre de células para la posterior normalización de la muestra. Comience por identificar la región de la membrana de la superficie celular apical o basal de interés en la primera imagen.

Seleccione un tamaño de píxel de 2 a n en el intervalo de 256 por 256, 128 por 128 o 64 por 64. A continuación, ve al menú de la imagen y selecciona duplicar. A continuación, vaya a analizar y baje a las mediciones.

Calcule la intensidad media del área de interés recortada. Ahora, identifique una región de fondo del mismo tamaño que la imagen original. Duplícalo como antes.

Y calcule la intensidad media del área de interés recortada del fondo. Con el área de interés y el fondo medidos, vaya a proceso y seleccione la calculadora de imágenes. Coloque el área de interés como Imagen 1 y la imagen de fondo como Imagen 2 y seleccione Restar como operación.

A continuación, vaya al menú de procesos. Vaya a FFT y seleccione FD Math. En el cuadro de diálogo matemático FFT, seleccione escribir las imágenes como se muestra aquí y establezca la operación en correlacionar.

Asegúrese de que la transformación inversa esté activada. Normalice la imagen resultante seleccionando proceso, desplazándose hacia abajo hasta matemáticas, seleccionando dividir e introduciendo el número total de píxeles en el cuadro de diálogo. A continuación, normalice de nuevo dividiendo por la intensidad media del área recortada normalizada al cuadrado.

A continuación, dibuja una línea a través de la función de dispersión de puntos. Traza el perfil de esta línea para calcular el valor máximo yendo a analizar y seleccionando perfil de trazado. Calcule los clústeres por área de haz transfiriendo el valor máximo a una hoja de cálculo.

A continuación, establezca los clústeres por área de haz igual a uno sobre el valor máximo menos uno. Para procesar las imágenes por lotes, se recomienda establecer una macro Fiji. Esto permite un análisis consistente y rápido de múltiples imágenes confocales para el análisis de espectroscopia de correlación de imágenes.

Para establecer una macro para el flujo de trabajo de espectroscopia de correlación de imágenes, configure el programa para registrar cada comando de menú en el protocolo. Para ello, vaya a plug ins, hasta marcos, y seleccione grabar. Luego, regrese a la ventana principal y ejecute el protocolo descrito en la sección anterior de este video.

Cuando termine, vuelva a la ventana de macros y seleccione crear para generar una macro. A continuación, en la ventana de edición de macros, asegúrese de seleccionar el idioma como LJ1 macro. Si no se selecciona, el programa no podrá ejecutarse.

Por último, guarde la macro. La función de transferencia óptica de un microscopio garantiza que incluso los objetos de tamaño molecular aparezcan como imágenes de entre 200 y 300 nanómetros en el plano XY. Al obtener imágenes de perlas de fresina de subresolución de la misma manera que las celdas, como se describe en este protocolo, se puede calcular el área de la función de dispersión puntual del microscopio.

Estas imágenes representan células de carcinoma epidermoide A431 adherentes estimuladas y no simuladas con EGF marcadas con un anticuerpo primario de cetuximab dirigido al receptor de EGF de la superficie celular. Los cuadros amarillos representan la membrana celular que contiene regiones de cultivo con dimensiones de píxeles de 64 por 64. Estas imágenes se utilizaron para realizar análisis espectroscópicos de correlación de imágenes.

Después de la normalización de la función de autocorrelación, la función de dispersión de puntos se puede medir utilizando la herramienta de línea. El perfil de esta función de línea se traza para detectar el valor máximo. Utilizando estos métodos, se observó que la estimulación de EGF inducía una disminución de 2,56 veces en los grupos de EGFR detectados por área de haz en comparación con las células no estimuladas.

Una vez dominado, el análisis de sus imágenes confocales solo tomará unos minutos por imagen. Al intentar este procedimiento, es importante recopilar varias réplicas de cada condición experimental utilizando la configuración descrita en este protocolo. Siguiendo este procedimiento, la espectroscopia de correlación de imágenes se puede expandir para explorar los cambios temporales de los eventos de agrupamiento en células vivas utilizando microscopía de lapso de tiempo.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploraran estados de agregación de orden superior utilizando ICS de fotoblanqueo, mientras que la colocalización de dos proteínas basadas en membrana utilizando metodologías de espectroscopia de correlación cruzada de imágenes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo calcular el estado de agrupamiento de su molécula de superficie celular de interés.