Aislamiento de células madre mesenquimatosas del periostio Alveolar humano y efectos de la vitamina D en la actividad osteogénica de células derivadas del periostio

El objetivo general de este estudio es investigar los efectos osteoinductivos de la vitamina D en células madre mesenquimales cultivadas que se han recolectado del periostio alveolar dental. El uso de células madre mesenquimales es un gran avance en la odontología de la última década. Se han aislado y cultivado con éxito a partir de muchas partes del tejido dental.

Sin embargo, el objetivo es aislar y cultivar células madre mesenquimales del periostio alveolar e investigar el potencial osteoinductivo del compuesto de vitamina D. En términos generales, las personas nuevas en este asunto tendrán dificultades debido a la nueva idea de la formación de hueso en las células madre mesenquimales derivadas del periostio alveolar. La demostración del procedimiento por parte del personal del laboratorio será la señorita Hsin-Wen Chi.Ella

es una asistente de investigación de mi laboratorio. Para empezar, recoja los tejidos periósticos de los pacientes durante la cirugía dental utilizando un separador perióstico. Recoja rodajas de aproximadamente dos por cinco milímetros.

Guarde las rodajas de tejido en DPBS con antibióticos. En el laboratorio, use un bisturí para picar completamente los fragmentos de tejido perióstico alveolar dentro de las 24 horas posteriores a la recolección. A continuación, cultive el tejido en placas de Petri de 35 milímetros en el medio de cultivo adecuado.

Utilice una incubadora humidificada a 37 grados centígrados con un 5% de gas de dióxido de carbono. Tres días después, deseche los tejidos periósticos recolectados y cambie el medio. Cuando las células hayan proliferado hasta aproximadamente el 80% de confluencia, separe las células cultivadas agregando tripsina.

E incubar el cultivo durante tres minutos. Después de esto, agregue 0,8 mililitros de medio para terminar el desprendimiento. Después de recolectar y contar, distribuya 5,000 células en un mililitro por plato.

Marque las celdas plateadas como el pasaje uno en esta etapa. Cultive estas células y sepárelas de nuevo después de que hayan proliferado hasta un 80% de confluencia. El medio con el paso uno es inicialmente de color naranja/rojo.

Cuando el medio comience a ponerse naranja tres días después, cámbialo. Cuando las células de paso uno alcanzan el 80% de confluencia, cree las células de la segunda a la quinta generación repitiendo los mismos procedimientos utilizados para preparar la generación cero a la primera generación. Cambie el medio dos veces por semana.

Cuatro semanas más tarde, evalúe el potencial de las células para diferenciarse en un linaje osteogénico observando la morfología de las células bajo un microscopio. Extraer las células mediante un ensayo de von kossa. Este ensayo distingue la presencia de depósitos calcificados en su cultivo.

Lavar las células con PBS y fijarlas durante 30 minutos en un mililitro de 10% de formalina. Después de esto, retire la formalina y luego lave las células y trátelas con nitrato de plata al 5%. Exponga las células a la luz ultravioleta durante una hora.

A continuación, retire el nitrato de plata y trate las células con dos mililitros de sulfato de sodio al 5% cuatro veces durante tres minutos cada vez. Reemplace la solución entre tratamientos. Finalmente, lave las celdas dos veces con agua destilada.

20 de las 34 muestras de tejido perióstico produjeron con éxito colonias de células madre derivadas de la médula. No se encontraron factores en relación con los donantes que afectaran significativamente el éxito del cultivo. Inicialmente, las PDC formaron colonias y grupos esféricos con una mezcla de células redondas y en forma de huso.

Después del primer paso, las células eran homogéneamente similares a fibroblastos con forma de huso. Al final de la diferenciación osteogénica, el ensayo de von kossa indicó la posible presencia de depósitos de calcio y diferenciación osteogénica. Estos resultados indican fuertemente que entre las poblaciones de células periósticas, las células progenitoras poseen el potencial de diferenciarse en células osteogénicas.

Las células precursoras osteogénicas también se trataron con calcitriol y se examinaron mediante RTPCR para evaluar el nivel de expresión de la fosfatasa alcalina, que es un fuerte indicador de la diferenciación osteogénica temprana de las células. Tanto el tratamiento de la vitamina C como el calcitriol, un metabolito activo de la vitamina D, aumentaron la expresión de fosfatasa alcalina. Además, la expresión de los niveles de ARNm de colágeno uno aumentó en respuesta a los mismos tratamientos.

Se encontró que la expresión de ARNm de sialoproteína ósea aumentaba para las células tratadas con una mayor concentración de calcitriol. Sin embargo, la expresión de CBFA uno y ARNm ostocálcico no respondió a los tratamientos. Después de ver este video, la audiencia debe tener una buena comprensión del protocolo de mineralización y cultivo del periostio alveolar humano.

Una vez dominado, esta búsqueda se puede realizar en cuatro o cinco semanas si se realiza correctamente. Al intentar este experimento, es importante utilizar una técnica cuidadosa y estéril para evitar la contaminación de la célula.