Química la amputación y la regeneración de la faringe en el Planarian Schmidtea mediterranea

El objetivo general de este procedimiento de amputación es extirpar selectiva y completamente la faringe de las planarias sin dañar otros órganos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regeneración. Por ejemplo, cómo las células madre reconocen los órganos faltantes e inician su regeneración.

La principal ventaja de esta técnica es que es muy precisa y que otros órganos no se dañan durante el proceso. La primera vez que tuve la idea de este método fue cuando estaba anestesiando planarias con azida de sodio. Me di cuenta de que la exposición a la azida de sodio hacía que la faringe se saliera.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que la amputación requiere la selección adecuada de los animales, así como una observación cuidadosa del movimiento y la morfología de los animales. La demostración del procedimiento estará a cargo de Divya Shiroor, estudiante graduada de mi laboratorio. Antes de comenzar el procedimiento, use una pipeta de transferencia de plástico para seleccionar las lombrices que se alimentaron de cinco a siete días antes en una placa de Petri limpia.

Coloque una regla plana debajo de la placa de Petri para confirmar que cada planaria tenga al menos 6 milímetros de largo mientras se arrastran por la placa. A continuación, transfiera hasta 20 gusanos seleccionados a una placa de Petri de 35 milímetros y utilice una pipeta de transferencia para eliminar toda el agua planaria de la placa. Coloque el plato bajo un microscopio estereoscópico y ajuste el aumento de manera que se puedan ver varios animales.

Agregue cinco mililitros de solución de azida de sodio de 100 milimolares recién preparada al plato. Vigilar a los animales sin mover la placa durante tres o cuatro minutos para observar la extrusión de la faringe. Cuando al menos la mitad de los animales en el plato hayan extendido completamente una faringe, use una pipeta de transferencia de plástico para aspirar y dispensar a la fuerza los gusanos alrededor del plato varias veces.

Si alguna faringa se extendió por completo, este pipeteo vigoroso hará que se desprenda. Alternativamente, use un par de pinzas finas para agarrar la faringe mientras levanta la planaria hacia arriba hacia el menisco. A medida que el animal se eleva, la tensión superficial hará que la faringe se desprenda.

Mientras mueves la faringe, ten cuidado de no causar lesiones accidentales a los animales. Las planarias son de cuerpo muy blando y se dañan fácilmente, especialmente cuando están en azida de sodio. Utilice una pipeta de transferencia para trasladar unos 15 animales amputados a un nuevo plato que contenga agua planaria fresca y enjuague las lombrices con agua planaria fresca tres veces.

Asegúrate de lavar completamente la azida de sodio. Incluso los rastros del químico podrían hacer que los animales se lisen. Luego incuba los gusanos a 20 grados centígrados durante siete días.

El día después de la amputación, vuelva a colocar los gusanos bajo el microscopio para determinar si hay una mancha oscura visible en el lado dorsal del gusano. Para alimentar a los gusanos, transfiera un volumen adecuado de pasta de hígado a un tubo de microcentrífuga y centrifugue el tubo brevemente para eliminar las burbujas de aire. Después de estimar el volumen del pellet de pasta, agregue agua planaria hasta una quinta parte de su volumen.

Según el volumen total del tubo, agregue un dos por ciento de colorante rojo para alimentos. Mezcle bien la muestra de alimento hasta que el tinte se distribuya uniformemente por toda la pasta y vuelva a centrifugar brevemente el tubo. Transfiera los animales amputados a una nueva placa de Petri y colóquelos en la oscuridad durante aproximadamente una hora.

Al final de la incubación, recorte aproximadamente medio centímetro del extremo de una punta de pipeta P200 y use la punta modificada para transferir 25 microlitros de pasta de hígado rojo al plato. Deje que los animales se alimenten durante 30 minutos. A continuación, coloca los gusanos sobre un fondo blanco para marcar el número de animales que aparecen rojos.

Después de aproximadamente 6 minutos en solución de azida sódica, se puede ver la punta blanca de la faringe. Unos minutos más tarde, los animales se contraen activamente y expulsan con fuerza la faringe de sus cuerpos. Después de aproximadamente 11 minutos de exposición a la azida, los animales se relajan, momento en el que la característica forma de campana de la faringe se hace claramente visible.

Ahora está listo para la amputación. La eliminación de esta gran masa de tejido no pigmentado da como resultado la aparición de una mancha oscura en el lado dorsal de los animales amputados. Para controlar la regeneración de la faringe con mayor precisión, los animales se pueden teñir con estreptavidina conjugada con fluorescencia durante la noche.

Al combinar el colorante alimentario con la pasta de hígado, los animales que comen se pueden distinguir de los animales que no comen. A continuación, se puede cuantificar el número de animales rojos para evaluar el porcentaje de animales con una faringe funcional. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en 20 o 30 minutos.

Al intentar este procedimiento, recuerde observar cuidadosamente el movimiento de las planarias para determinar cuándo debe comenzar la amputación. Las amputaciones selectivas pueden ayudar a abordar preguntas como cómo las células madre inician las decisiones de linaje apropiadas para lograr la regeneración. Este video debería proporcionar una buena comprensión de cómo realizar la extirpación selectiva de la faringe con azida de sodio.

Trabajar con azida de sodio puede ser extremadamente peligroso. Recuerda manipularlo siempre con guantes, desechar los residuos adecuadamente y limpiar tu espacio de trabajo después del experimento.