Tamaño importa: Medición del diámetro de la cápsula de Cryptococcus neoformans

El objetivo general de este procedimiento es teñir la cápsula de polisacárido de las cepas de C. neoformans para la visualización y medición del diámetro de la cápsula. Estos métodos pueden ayudar a los investigadores con la inducción, la obtención de imágenes y la medición del tamaño de la cápsula en Cryptococcus neoformans. La principal ventaja de las técnicas de tinción e imagen es que son sencillas, rápidas y permiten una medición precisa del diámetro de la cápsula.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos del software pueden resultar confusos la primera vez que se utiliza. El diámetro de la cápsula de Cryptococcus neoformans se utiliza a menudo como medida de virulencia. La capacidad de automatizar este proceso puede ahorrar un tiempo de análisis significativo.

Para inducir la producción de cápsulas, primero se incuba una colonia de C. neoformans en caldo de levadura peptona dextrosa a 37 grados centígrados con agitación durante 18-36 horas hasta que el cultivo esté en fase logarítmica. Al final del cultivo, peletice la levadura por centrifugación y lave la levadura tres veces en PBS. Después del último lavado, resuspender la levadura a dos veces 10 a la quinta celda por dos mililitros de concentración de DMEM e incubar el cultivo a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 18 horas.

Al día siguiente, recoja las células por centrifugación y elimine todos los microlitros del sobrenadante, excepto los últimos 10. Para teñir la levadura con tinta china, vuelva a suspender el pellet en el sobrenadante restante y transfiera cuatro microlitros de la suspensión celular y cuatro microlitros de tinta china a un portaobjetos de microscopio de vidrio. Mezcle suavemente la solución resultante sin crear burbujas.

A continuación, coloque un cubreobjetos de vidrio de 1,5 milímetros de grosor sobre la muestra de células y selle los bordes con un sellador no tóxico. Para teñir la levadura con un colorante fluorescente, vuelva a suspender el pellet de cultivo nocturno en 50 microlitros de PBS suplementado con suero bovino al 1% e incube las células en 55-60 microlitros de anticuerpo monoclonal 18B7 de calcofluor-blanco blanco y cápsula conjugada Alexa Fluor 488 durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en 10 microlitros de PBS más albúmina sérica bovina.

A continuación, transfiera ocho microlitros de células a un portaobjetos de microscopio de vidrio, cubra la muestra de células con un cubreobjetos de vidrio de 1,5 milímetros de espesor y selle los bordes con un sellador no tóxico. Para teñir la levadura con ambos colorantes, primero incube las células con una cápsula fluorescente y teña la pared celular como se acaba de demostrar. A continuación, añada cuatro microlitros de células teñidas con fluorescente y cuatro microlitros de tinta china en un portaobjetos de vidrio y coloque un cubreobjetos sellado sobre la muestra de células fúngicas como se demuestra.

Para obtener imágenes de las células mediante microscopía óptica, seleccione el objetivo 100X e imagine al menos 50 células no superpuestas por condición con tiempos de exposición optimizados para maximizar el contraste de la imagen y minimizar el desenfoque causado por los movimientos de las células pequeñas. Para obtener imágenes de las células mediante microscopía de fluorescencia, abra el software de imágenes del microscopio y seleccione las longitudes de onda de excitación y emisión adecuadas para los fluoróforos utilizados. En el panel de control de la pila Z, seleccione la primera y última opción.

Usando el control de enfoque fino en el microscopio, primero enfoque por debajo del punto más ancho del cuerpo celular de una sola célula de levadura y las cápsulas para todas las celdas dentro del campo de visión actual y haga clic en establecer primero. A continuación, utilice el control de enfoque fino para enfocar por encima del punto más ancho del cuerpo celular de la misma célula y de la cápsula para todas las celdas dentro del campo de visión actual y haga clic en establecer en último lugar. A continuación, abra la pestaña de adquisición y haga clic en iniciar experimento para adquirir la pila Z para la posición actual.

Para medir manualmente los diámetros de la cápsula y de la célula, abra un programa de medición de células adecuado y seleccione la imagen que se va a medir. Seleccione medir y use el cursor para dibujar una línea recta a través del punto más ancho de toda la celda para medir el diámetro total de la celda. Haga clic en medir de nuevo y dibuje una línea recta a través del cuerpo de la célula para medir el diámetro del cuerpo de la célula y abrir la siguiente celda.

Cuando se hayan medido todas las celdas, guarde las imágenes. Para la medición automatizada de los diámetros de la cápsula y de la celda, primero abra un programa de edición de imágenes adecuado e invierta todas las imágenes de células teñidas con tinta china. A continuación, para importar tanto la imagen original como la invertida en el software de medición de celdas, abra el menú de archivos en el programa de medición y seleccione importar secuencia, cargar imagen, definir secuencia manualmente, dimensionar el canal, importar y aplicar.

Para detectar y enmascarar el cuerpo de la célula, seleccione el protocolo de fluorescencia del analizador de colonias para la primera imagen invertida de interés y haga clic en aplicar. Seleccione de nuevo el protocolo de fluorescencia del analizador de colonias para segmentar las imágenes del cuerpo de las células C. neoformans invertidas de sus cápsulas y haga clic en aplicar de nuevo para crear una máscara de recuento. Haga clic con el botón derecho para cambiar el nombre del cuerpo de la célula de máscara de recuento y use el protocolo de proliferación celular en la imagen original para detectar y enmascarar la cápsula.

Haga clic en aplicar para crear una máscara de recuento para la imagen original y cambie el nombre de la cápsula de máscara de recuento. Para crear una nueva máscara sobre la imagen original para dividir las cápsulas adyacentes entre sí, seleccione partición de cápsula y cápsula para la región de la cápsula. Para exportar los datos, haga clic en la hoja de cálculo y luego haga clic en el icono de exportar a la hoja de cálculo.

Seleccione las medidas que desea exportar y, finalmente, guarde los datos. Un aumento del tamaño de la cápsula es evidente en la mayoría de las cepas después de la inducción, aunque algunas cepas exhiben cápsulas naturalmente pequeñas. En este experimento representativo, se observó consistentemente una diferencia significativa en el tamaño de la cápsula entre la cepa más grande y las dos cepas más pequeñas.

Las diferencias en el tamaño de la cápsula también se pueden detectar utilizando tintes fluorescentes. La captura de imágenes de la pila Z garantiza que se adquiera el diámetro máximo de la cápsula y del cuerpo de la célula para cada célula. A continuación, las pilas pueden procesarse para producir proyecciones de intensidad máxima para la medición manual de la cápsula de células de levadura y el diámetro de la célula.

No hay diferencias significativas dentro del experimento entre las mediciones de cápsulas utilizando cualquiera de los métodos de tinción, aunque se observa una mayor variabilidad entre experimentos cuando se utiliza tinta china para medir los diámetros de las cápsulas en comparación con la tinción con colorante fluorescente. Las diferencias significativas en las mediciones del diámetro de la cápsula entre diferentes investigadores no suelen observarse, independientemente del método utilizado, mientras que las diferencias pequeñas pero significativas en el tamaño de la cápsula pueden detectarse utilizando el método de medición automatizado. Para que la medición automatizada tenga éxito, las células deben estar enfocadas, tener una cápsula de tamaño mediano a grande y no estar demasiado agrupadas.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo inducir la cápsula en Cryptococcus neoformans, teñirla con tinta china o tinción fluorescente, obtener imágenes de la cápsula y medirla a través de un software automatizado.