Name: Caracterización de polímeros sintéticos vía matriz asistida por láser desorción de ionización tiempo de vuelo (MALDI-TOF) espectrometría de masas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Aprende a caracterizar polímeros sintéticos mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Este protocolo optimiza la preparación de muestras y adquisición de datos para determinar peso molecular y grupos terminales con precisión.

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Los autores reconocen que el consorcio Smart diseño de materiales, análisis y procesamiento (SMATDAP) financiado por la National Science Foundation bajo acuerdo cooperativo IIA-1430280 y la LA Junta de regentes de una beca de postgrado (MEP). Las muestras de polímero para estos experimentos fueron proporcionadas por MilliporeSigma (Sigma-Aldrich).  Publicación de acceso abierto de este artículo es patrocinado por MilliporeSigma.

PRECAUCIÓN: Todas las reacciones fueron funcionadas en una campana de humos. Por favor lea todo Material de seguridad datos hojas (MSDS) para cualquier producto químico utilizado y tomar las precauciones apropiadas.
1. preparación de la muestra
<ol><li>Preparación de las soluciones stock de matriz<ol>
<li>Disolver 20 mg de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (HCCA) en 1 mL de tetrahidrofurano-desestabilizaron (THF) y agitar hasta que se disuelva.</li>
		<li>Disolver 20 mg de ácido 2, 5-dihydroxybenzoic (DHB) en 1 mL de THF y agitar hasta que se disuelva.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de la solución madre de cationes alcalinos<ol>
<li>Disolver 2 mg de sodio trifluoroacetate (NaTFA) en 1 mL de THF y agitar hasta que se disuelva.</li>
		<li>Disolver 2 mg de potasio trifluoroacetate (KTFA) en 1 mL de THF y agitar hasta que se disuelva.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de soluciones stock de analito<ol>
<li>Muestra 1: Disolver 2 mg de poli (etilenglicol) 2-aminoetil éter acético (Mn = 5000) en 0.5 mL de THF y agitar hasta que se disuelva.</li>
		<li>Ejemplo 2: Disolver 2 mg de bis(azide) polioxietileno (Mn = 2000) en 0.5 mL de THF y agitar hasta que se disuelva.</li>
		<li>Muestra 3: Disolver 2 mg de poly(L-lactide), tiol terminado (Mn = 2500) en 0.5 mL de THF y agitar hasta que se disuelva.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de mezclas de muestra para análisis<ol>
<li>Preparar una serie de soluciones mediante la mezcla de matriz, analito y cationes de la solución y variando las proporciones relativas de los componentes que se hacen mezclas de nueve muestras únicas. Por ejemplo, mantener la cantidad constante de solución matriz agregada (e.g., 10 μl), variar la cantidad de solución del analito por un factor de tres (e.g., 45, 15 y 5 μl), mientras que también varía la cantidad de catión solución por un factor de tres (por ejemplo, ., 9, 3 y 1 μl). Estas muestras rendir con eficacia una cuadrícula de 3 x 3 de las muestras con las dos variables de diferente concentración en x e y ejes (figura 1).</li>
		<li>Para el ejemplo, combinar 15 μl de la solución de poly(L-lactide), con 15 μl de la solución DHB y 1 μl de la solución de NaTFA.</li>
		<li>Pipetee 1 μL de cada mezcla de la solución en una muestra individual en la placa de la blanco MALDI (figura 2). Añadir las muestras progresivamente en pequeñas porciones para evitar que la muestra fluya fuera del pozo de la muestra, permitiendo que cada alícuota se evapore a sequedad antes de agregar la muestra adicional. Nota: Para disolventes de punto de ebullición más alto, un rifle de aire puede ser necesario para acelerar la evaporación de solvente, aunque se debe tener precaución para evitar el calentamiento de la placa de la muestra, que pudo causar la placa a la deformación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de muestras estándar para calibración<ol>
<li>Preparar los estándares de calibración usando el protocolo del proveedor sugerido. Nota: Dendrímero calibradores se seleccionaron para este estudio y están disponibles como los dendrímeros puro o premezclan con matriz, calibrant y catión relaciones optimizadas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. optimización de la adquisición de datos
<ol><li>Iniciar la adquisición de datos<ol>
<li>Software de adquisición de datos "FlexControl".</li>
		<li>Expulsión de la plataforma para permitir la carga de la placa de objetivo pulsando el "<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57174/57174eq1v2.jpg">" botón.</li>
		<li>Coloque suavemente la placa objetivo con las muestras calibrant y analito cargadas en la plataforma en la orientación adecuada.</li>
		<li>Utilice el software de adquisición para inyectar la placa de la blanco en la plataforma presionando el "<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57174/57174eq1v2.jpg">" otra vez el botón.</li>
		<li>Seleccione un método de adquisición de datos adecuados (método de adquisición de modo positivo) pulsando archivo | Seleccione el método de. Nota: Para la mayoría de las muestras de polímero, incluyendo nuestros analitos representativos, ionización se espera que a través de la complejación con un catión y por lo tanto, es más apropiado un método de adquisición de modo positivo. Dependiendo del instrumento, para rangos de masa baja (500-10.000 Da) o cuando se desea una mayor resolución, seleccione un archivo de método de modo de reflector. De peso molecular más alto muestras o cuando mayor sensibilidad de la señal es necesaria y baja resolución es aceptable, seleccione un archivo de método de modo lineal.</li>
		<li>Antes de adquirir datos, asegúrese de que un rango de masa apropiado de recogida de datos está seleccionado-la gama total incluirá la mitad de la masa más baja en la distribución esperada así como doble la masa más alta en la distribución esperada. Comprobar esto haciendo clic en la ficha detección y Masa de gamade la visión. Nota: Esto ayuda a asegurar esa señal de fragmentos de degradación de bajo peso molecular o agregados de peso molecular más alto (dimer) que pueden estar presentes en la muestra se incluyen en el conjunto de datos. También, tenga en cuenta que los oligómeros de matriz se notan con frecuencia con intensidades de señal alta en mayoría espectros de masas de MALDI-TOF, con ruido de masas tan altas como 1.000 Da, que complica análisis por debajo de esta masa. Aunque la calibración se requerirá antes de obtener un conjunto de datos final, un archivo de calibración de precisión puede solamente ser adquirido si se usan parámetros de adquisición idénticos que optimizado para el analito particular. Por lo tanto, es necesaria una optimización preliminar del espectro de masa del analito antes de la calibración, seguida por la readquisición de un espectro de masa del analito calibrado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adquisición de datos preliminares<ol>
<li>El software de adquisición, seleccione la posición en la placa de la blanco que corresponde al analito deseado.</li>
		<li>Iniciar recolección de datos mientras se mueve el objetivo de láser alrededor de la muestra para maximizar la señal. Para iniciar la recolección de datos, presione Start. Nota: El láser puede agotar la matriz en un lugar determinado después del muestreo repetido.</li>
		<li>Utilizando la barra deslizante en el lado izquierdo de la ventana de la cámara, ajustar la potencia del láser tal que la energía mínima necesaria para lograr resolución isotópica se logra. Nota: Al analizar varias muestras para confirmar la relación óptima de analito, cación y matriz, utilice la misma energía del laser en cada una de las muestras del analito a determinar que muestra exhibe la mejor relación señal/ruido para los parámetros de adquisición. Continuar con la optimización de la adquisición en el futuro con la muestra que presentan la mejor relación señal a ruido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Optimización de la adquisición de datos<ol>
<li>Zoom un pico individual en medio de la gama total de interés, optimizar la resolución ajustando la diferencia de voltajes de aceleración (para los instrumentos en este estudio, se trata de ajustar el valor de «IS2»), que está en el espectrómetro tab. Nota: Esto es más rápido optimizado variando el valor de IS2 en grandes pasos, tomando nota de que el valor genera la mejor resolución (es decir., el más pequeño completo anchura del pico a media intensidad máxima de la señal) y luego optimizar más en pasos más pequeños de el valor de IS2. Normalmente, el valor óptimo de IS2 es mayor (cerca de IS1) polímeros de masa baja y baja de altos polímeros masa.</li>
		<li>Si lo desea, aumentar la resolución con modo reflectron. Nota: Modo Reflectron permite la compensación de las discrepancias en la velocidad inicial de iones de la misma m/z por obligar a los iones de velocidad más alto del mismo valor de m/z en un camino más largo para el detector. Este aumento en camino hacia el detector permite iones más lento del mismo valor de m/z para llegar al detector al mismo tiempo, centrándose con eficacia los iones de mayor resolución. Aunque el modo reflectron normalmente mejora la resolución de la señal, para muestras con intensidad de señal débil, modo lineal podría ser necesario para poder visualizar los datos.</li>
		<li>Por último, optimizar la energía láser reduciendo la potencia del láser tan baja como sea posible mientras que todavía genera una razonable relación señal a ruido (e.g., señal de ruido de aproximadamente 10). Nota: Debido a mayores potencias de láser generalmente reducen la resolución y pueden inducir fragmentación, los espectros de masas con la mejor calidad son adquiridos mediante láser de menor potencia pero mayor número de exploraciones.</li>
		<li>Una vez que se optimizan los parámetros de adquisición, guardar los espectros de masas sin calibrar seleccionando archivo y luego Guardar espectro archivo como. Para la calibración externa, una nueva adquisición de calibrant bajo estos parámetros idénticos, optimizados debe realizarse antes de inicia una nueva adquisición para generar el espectro de masas calibrado del analito.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. MALDI calibración
<ol><li>Adquisición de espectro de masas de calibración<ol>
<li>Utilizando los parámetros de adquisición ya optimizados para el analito, adquirir un espectro de masas optimizado de la muestra de masa estándares. Nota: Idealmente, el sistema de calibración debe incluir una norma por encima del rango de interés, uno por debajo y al menos uno en el rango de interés. La exactitud de la calibración es mejor si todos los parámetros de adquisición son idénticos para ambas muestras.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Crear un archivo de calibración<ol>
<li>Asegúrese de que cualquier calibración existente se anula o en una posición para sobrescribir presionando Calibración invalida en el espectrómetro de la lengüeta.</li>
		<li>Utilizando los mismos parámetros de adquisición (e.g., laser de potencia, voltaje de IS2), mueva el láser sobre para la muestra que contiene el calibrant (e.g., dendrímero estándar, péptido) seleccionando el correspondiente bien con el cursor y adquirir un espectro pulsando iniciar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una vez que se ha adquirido suficiente señal, presione iniciar para terminar adquiriendo datos.</li>
	<li>Una vez que se ha adquirido un espectro de masas de la calibrant, seleccione el menú desplegable de La lista de Control de masa en la ficha de calibración que corresponde a ese estándar de calibración. La lista de control de masa apropiada tendrán las masas referencia de calibrant seleccionado con el catión correspondiente. Nota: Estos deben ser directamente del proveedor de calibrant y asegúrese de utilizar los valores de masa de monoisotopic cuando se logra resolución isotópica (e.g., modo de reflector debajo de m/z = 5000), y una masa media valores cuando resolución isotópica no se puede lograr (por ejemplo, modo lineal sobre m/z = 5000),</li>
	<li>Antes de que el pico de referencia correspondiente a cada pico calibrant seleccionado, asegúrese de que se está utilizando un pico adecuado protocolo de selección seleccionando la ficha de proceso . Nota: Protocolos de recolección de pico pueden variar en base a la resolución espectral. Para un cálculo promedio de masa, el software debe tomar el promedio de masa a través de toda la serie de picos isotópicos. Para un cálculo de masa de monoisotopic, el software debe establecerse para calcular la masa exacta de sólo el primer pico isotópica.</li>
	<li>Aplicar la masa de referencia de la lista de control de masas a la señal correspondiente para el espectro de masas calibrant seleccionando el área a la izquierda del pico de interés y luego haciendo clic en la masa correspondiente en la lista de control a aplicar. Continuar con el proceso para las restantes cumbres calibrant. Nota: Para calibrar más exacto y preciso, coloque las muestras del analito y calibrant tan juntos como sea posible en la placa de la blanco, debido a sutiles variaciones de altura de placa de destino pueden afectar la exactitud de la calibración.</li>
	<li>Una vez que la escala masiva de los parámetros de adquisición optimizados han sido calibradas a adquirir el espectro del analito.</li>
</ol>4. interpretación y análisis de datos
<ol><li>Pico de cosecha<ol>
<li>Abrir el espectro del analito en el software de análisis de datos (FlexAnalysis).</li>
		<li>Ampliar un pico para identificar si resolución isotópica se ha conseguido seleccionando el botón de Zoom de X .</li>
		<li>Presione masa lista | Encontrar para seleccionar picos. Si el pico de monoisotopic se resuelve, seleccione este primer pico en la distribución isotópica para determinar su masa monoisotopic peak-picking en protocolos. Si no se resuelve el pico monoisotopic, utilizar un pico de masa media selección protocolo y determinar la masa media de toda la distribución isotópica.</li>
		<li>Continuar este pico recogiendo el proceso para cada n-mer en la distribución del polímero.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cálculos de análisis de polímero caracterización y final Grupo Nota: Cuando se usa correctamente, MALDI-TOF MS puede proporcionar datos valiosos y precisos para el cálculo de la distribución en masa de polímeros. Cabe señalar que datos de la distribución en masa sólo están exactos cuando la Dispersidad de la muestra de polímero es relativamente baja (por ej., aproximadamente Đ= 1.3 o inferior).<ol>
<li>Calcular el peso molecular promedio en número, la media masa con respecto al número de moles de cada fracción de masa, utilizando la fórmula: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57174/57174eq2v2.jpg"> donde N = número de moléculas de peso molecular específico y M = peso molecular específico de aquellas moléculas.</li>
		<li>Calcular el peso molecular promedio peso, la masa media en relación con el peso de cada fracción de masa, utilizando la fórmula: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57174/57174eq3v2.jpg"> donde N = número de moléculas de peso molecular específico y M = peso molecular específico de aquellas moléculas.</li>
		<li>Una vez que ha calculado la Mw y Mn , cuantificar la amplitud de la distribución de peso molecular usando la relación Mw/Mn que se llama dispersity, Đ.</li>
		<li>La característica más singular y potente de análisis de datos del MS de MALDI-TOF es la capacidad de determinar o confirmar los grupos finales de homopolímeros. Determinar el grupo final de reorganización de la siguiente fórmula para la masa observada de un n-mer en el espectro de masas (Mn-mer): Mn-mer = n (MRU ) + MEG1 + MEG2 + Mion donde n = grado de polimerización, MEG1 = masa del grupo α-final MEG2 = masa del grupo final de ω, MRU = masa de la unidad de repetición del polímero, y Mion = masa del ion que complejos con el polímero.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores tienen intereses financieros relacionados con los calibradores esférico utilizado en este estudio.

Espectrometría de masas MALDI-TOF es una valiosa herramienta analítica para la caracterización de polímeros debido a su capacidad para generar iones de polímero en el estado cargado por separado y con la mínima fragmentación. Esta técnica de ionización suave utiliza pulsos de láser corto para la desorción de las muestras de estado sólidas del analito polímero embebidas en una matriz compuesta para generar iones de polímero en la fase gaseosa. Típicamente, las macromoléculas se ionizan por formación de complejos con cationes que se agregan a la matriz para permitir su análisis por espectrometría de masas. Estos iones macromoleculares entonces son acelerados por un voltaje de extracción para llevar a la región libre de campo del tubo de vuelo que permita su m/z para determinarse basado en su tiempo de vuelo entre la fuente de iones y el detector5 , 32.
En comparación con otras técnicas de caracterización de polímeros, MALDI-TOF MS espectros calidad es fuertemente dependiente de los parámetros de adquisición de datos y preparación de la muestra. Aunque no hay ninguna determinada fórmula para preparación de muestras, comprender la función de cada componente de la preparación de la muestra permite optimización empírica más rápido. El factor más importante en la preparación de la muestra MALDI es selección de la matriz porque la compatibilidad de la matriz con el analito de polímero es crítica para permitir que la matriz emocionado generar macromoléculas desorbidas, solo en un estado ionizado5, 15,17,19. Una vez que han sido seleccionados agentes de matrix y embargo apropiados, debe determinarse la proporción correcta de agente de analito, matriz y embargo. Esto puede lograrse empíricamente mediante la creación de una rejilla de dos dimensiones de las muestras (figura 1) en la placa de la blanco del MALDI-TOF MS (figura 2) con aumento de la concentración de la matriz en un eje y aumento de la concentración de agente de embargo en la otros.
Similar a la preparación de la muestra MALDI, no hay determinada fórmula para la determinación de parámetros de adquisición de datos; sin embargo, deben considerarse ciertas tendencias para acelerar la optimización espectral. Modo Reflectron, que aumenta la resolución pero disminuye la señal global, por lo general es elegido para gamas más bajas masivas (en estos ejemplos, a continuación Da 4.000) donde se logra resolución isotópica. En estos casos, se utilizaron cálculos masa monoisotopic y pico recogiendo métodos. Para muestras de polímeros con masas por encima de 4.000, modo lineal se utilizó con cálculos de masa media y enarbolar los métodos de recolección. Para mejorar la resolución de la señal, se deben ajustar los voltajes de la fuente de iones poco a poco con la tendencia general de mayor masa polímeros teniendo un mayor voltaje diferencial (IS1 versus IS2).
Tiempo optimizado muestra preparación y adquisición de parámetros pueden ofrecer precisión, precisión de masa sólo puede lograrse a través de la calibración efectiva. El tiempo de vuelo para una masa dada puede variar sutilmente con respecto a los parámetros de adquisición variable y posiciones de la placa incluso, por lo tanto una calibración debe realizarse para cada conjunto de parámetros de adquisición optimizados para rendimiento de masa exacta determinaciones de5,30. Una vez que se han optimizado los parámetros de adquisición y preparación de la muestra, los espectros deben calibrarse utilizando estas mismas condiciones exactas.
Debido a la excepcional resolución y exactitud total observado en la espectrometría de masas MALDI-TOF optimizada de polímeros, esta técnica se ha convertido en una valiosa herramienta de conexión para la determinación de datos de distribución en masa de polímero. Sin embargo, su capacidad de resolver individuales unidades repetidas dentro de la distribución de masa de polímero proporciona una ventaja particular para el análisis final del grupo en comparación con otros polímeros técnicas de caracterización como cromatografía de gel permeación (GPC) y nuclear resonancia magnética (RMN). Esto es particularmente valioso para determinar la fidelidad de las reacciones de funcionalización de grupo final y la naturaleza cuantitativa de reacciones de conjugaciones de grupo final. Este manuscrito ha demostrado la capacidad para resolver la masa de unidades repetidas de polímero individuales con un máximo de dos puntos decimales de precisión total, lo que permite la confirmación de modificaciones de grupo final con un alto nivel de confianza. Con los avances sustanciales que se han hecho recientemente en el campo de la síntesis del polímero precisión, MALDI-TOF MS se está convirtiendo en una herramienta cada vez más importante para determinar la estructura macromolecular y funcionalidad.

Con mejoras en la vida de técnicas de polimerización, polímeros de precisión con grupos finales cuantitativamente funcionalizados son cada vez más disponibles1. El desarrollo concurrente de azida-alquino y thiolene haga clic en química ha permitido el acoplamiento casi cuantitativo de macromoléculas en otras partes, de facilitar el acceso a una gama de híbridos de materiales2,3,4 . Sin embargo, técnicas analíticas precisas están necesario caracterizar la partida materiales y productos de estas reacciones de conjugación de polímero. Tiempo de desorción/ionización láser asistida por matriz de espectrometría de masas de vuelo (MALDI-TOF MS) es una técnica analítica de ionización suave valiosos para la caracterización de polímeros porque puede generar iones de polímero en un estado de carga solo con un mínimo fragmentación5,6. MALDI-TOF MS tiene grandes ventajas sobre otros métodos convencionales de caracterización de polímeros porque puede proporcionar espectros de masas con la resolución del n-mers individual dentro de la distribución en masa del polímero. En consecuencia, tales espectros de masas puede proporcionar información precisa sobre el peso molecular promedio, repita la unidad de masa y peso molecular dispersity7, que a su vez puede dilucidar mecanismos de polimerización que compiten como transferencia de cadena8 . Sin embargo, MS de MALDI-TOF es particularmente potente en proporcionar información sobre el polímero final grupos9,10, que puede utilizarse para confirmar fin grupo modificaciones10,11 y otros transformaciones12 como polímero cyclizations11,13. Igualmente importante, la relativamente pequeña cantidad de analito (sub-microgramos) necesaria para la espectrometría de masa análisis hacen esta técnica útil para la caracterización cuando solamente cantidades de rastro de material están disponibles.
El análisis del MS de MALDI-TOF de polímeros se pueden dividir en cuatro pasos distintos: preparación, calibración del instrumento, adquisición espectral y análisis de los datos de la muestra. Preparación de la muestra es el paso más esencial para la generación optimizada de espectrometría de masas MALDI-TOF y se produce antes de la muestra se introduce en el instrumento14,15. La selección de una matriz correspondiente con los parámetros de solubilidad similares como el analito de polímero es fundamental para obtener espectros de masas de MALDI-TOF de alta calidad y las directrices para la selección de la matriz se han divulgado a otra parte14,15, 16,17. Una base de datos de polímero MALDI "recetas" para la preparación de la muestra también ha sido publicado en línea18. Para los nuevos polímeros, selección de matriz puede ser abordado entendiendo la solubilidad del polímero y selección de una matriz con similares parámetros de solubilidad14,19. Polímeros con afinidad alta protón pueden ser protonado por mayoría matrices14 (que con frecuencia contienen grupos de ácido carboxílico), pero para otros polímeros, un agente de embargo es necesario14. Los iones álcali aducción con oxígeno-que contienen especies (ej. poliésteres y poliéteres), mientras que hidrocarburos insaturados (por ejemplo. poliestireno) aducción con metales de transición como los iones de plata y cobre14, 19. porque las muestras de polímero en este experimento contenían átomos de oxígeno en la columna vertebral, trifluoroacetate del sodio o del potasio (TFA) fueron utilizados como el agente del embargo. Una vez que los agentes de matrix y el embargo han sido seleccionados, las proporciones relativas de analito, agente catiónico y matriz deben optimizarse cuidadosamente para asegurar alta señal a ruido. En este procedimiento, los parámetros para la preparación de la muestra ya se han optimizado, sin embargo un procedimiento de optimización empírica muestra (paso 1.4.1., figura 1) que varía sistemáticamente las concentraciones de los tres componentes (analito, matriz y el catión) es eficaz para determinar rápidamente su relación óptima.
Adquisición de datos también requiere la optimización de un número de parámetros. Los parámetros más importantes son el modo de iones positivos o negativos del espectrómetro, el modo de operación del instrumento (lineal versus reflector), el voltaje de aceleración y el tiempo de retardo de extracción. Otra forma que se puede aumentar la resolución es mediante la utilización de "reflectron" modo20,21,22,23. El modo Reflectron esencialmente duplica la trayectoria de los iones al detector reflejando los iones en el extremo del tubo de vuelo hacia un detector cerca de la fuente mientras que reenfoque iones con diferentes momentos, y por lo tanto aumentando la resolución aunque disminución de la intensidad de señal. Además, pueden obtenerse espectros de resolución mayor al disminuir la potencia del láser que reduce al mínimo la relación señal a ruido por disminuir el número y energía de las colisiones y por lo tanto reduciendo la fragmentación y la cinética inhomogeneidades24. Templando todos estos parámetros, los iones pueden ser enfocados para minimizar el efecto de cualquier inhomogeneidad en posición inicial o velocidad que se produce durante el proceso de desorción láser. Cuando se optimizan los parámetros de adquisición, resolución isotópica a menudo se logra para los iones con masas superiores a 10.000 Da, aunque también esto depende de la longitud del tubo de vuelo y el diseño del instrumento. Los compuestos más orgánicos que contienen al menos un heteroatom son propensos a la formación de complejos con cationes alcalinos tales como litio, sodio y potasio. Muchos de los metales alcalinos son monoisotopes o de isótopos limitadas y por lo tanto no ampliar la distribución.
Mientras que los parámetros del instrumento pueden ajustarse para optimizar la precisión de los datos, exactitud de los datos sólo se logra con una calibración adecuada11. Proteínas y péptidos fueron utilizados originalmente como calibradores debido a su monodispersity y disponibilidad, pero sufren de estabilidad variable y la prevalencia de las impurezas25. Alternativas más rentables y estables han incluido grupos inorgánicos y polidispersas polímeros26,27,28,29. Desafortunadamente, estas características alternativas dispersar a las masas, que complican las asignaciones totales, así como masas más pequeñas en general, haciéndolos útiles sólo para calibraciones por debajo de 10.000 Da. Para combatir estos problemas, Grayson et al. 25 desarrolló un sistema de calibración MS dendrímero-base de poliéster que es monodispersa y cuenta tanto matriz amplia y solvente compatibilidad, estabilidad de vida útil (> 8 años) y menor costo de producción. Basado en las fortalezas de este sistema, fue seleccionado como calibrant para estos experimentos.
Hay dos tipos de calibración: interna y externa30. Cuando calibrar externamente, un estándar con las masas que soporte que el analito se colocan en la placa MALDI de destino en condiciones diferentes de la muestra de analito para generar el espectro de masa separado de la que se puede generar un archivo de calibración. Por otro lado, a menudo puede conseguirse mayor precisión con una calibración interna, que consiste en mezclar el calibrant con el analito para obtener un espectro híbrido con señales calibrant y analito. En el procedimiento descrito a continuación, se aplicó una calibración externa. Después de la calibración adecuada de la escala total, pueden ser adquiridos datos masa de analito precisa. Para asegurar la calibración más precisa, es importante que la adquisición de datos se produce poco después de la calibración.
Finalmente, una vez calibrado el optimizado, los conjuntos de datos fueron adquiridos, y los datos fueron analizados para proporcionar información estructural sobre las muestras de polímero. La distancia entre n-mers dentro de la distribución del polímero puede proporcionar una medición precisa de la unidad de repetición masiva. Número peso molecular promedio (Mn) y otros cálculos de distribución de masa (p. ej., Mw (peso molecular promedio en peso) y Đ (dispersity)) también puede ser determinado de la distribución de señal en los espectros de masas ( Paso 4.2 para los cálculos). Tal vez más excepcionalmente, en el caso de los homopolímeros, la suma de las masas del grupo extremo puede confirmarse determinando el desplazamiento de la distribución de polímeros con respecto a la masa de las unidades que se repiten solo. Los espectros de masas de MALDI-TOF de ricos en información proporcionan datos de caracterización valiosa que son complementarios a los tradicionales técnicas de caracterización de polímeros como la cromatografía por exclusión de tamaño, espectroscopia infrarroja de transformada de Fourier, y resonancia magnética.

<table><tbody><tr><td>polioxietileno bis(azida) (Mn=2000)</td><td>MilliporeSigma (Aldrich)</td><td>689696</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/689696?lang=en&region=US</td></tr> ácido <tr><td>acético poli(etilenglicol) 2-amino-etil éter (Mn= 5000)</td><td>MilliporeSigma (Aldrich)</td><td>757918</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/757918?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>poli(L-lactida), tiol terminado (Mn=2500)</td><td>MilliporeSigma (Aldrich)</td><td>747386</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/747386?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>SpheriCal&reg; &nbsp; péptido bajo</td><td>MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)</td><td>PFS20</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs20?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>SpheriCal&reg; &nbsp; medio peptídico</td><td>MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)</td><td>PFS21</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs21?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>SpheriCal&reg; &nbsp; péptido alto</td><td>MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)</td><td>PFS22</td><td></td></tr><tr><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/pfs22?lang=en&region=US 2,4 dinitrofluorobenceno</td><td>TCI</td><td>A5512</td><td></td></tr><tr><td>maleimida</td><td>MilliporeSigma (Aldrich)</td><td>129585</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/129585?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>1-etinilfluorobenceno&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>766-98-3</td><td></td></tr><tr><td>trietilamina</td><td>MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)</td><td>471283</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/471283?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>N,N,N',N",N"-pentametildietilentriamina</td><td>MilliporeSigma (Aldrich)</td><td>369497</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/369497?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Millipore de cobre(I)BromuroSigma</td><td>(Aldrich)</td><td>254185</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/254185?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>ácido acético glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38212</td><td></td></tr><tr><td>metabisulfito de sodio</td><td>MilliporeSigma (Sigma-Aldrich)</td><td>13459</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/13459?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>trifluoroacetato de potasio</td><td>MilliporeSigma (Aldrich)</td><td>281883</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/281883?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>trans-2-[3-(terc-butilfenil)-2-metil-2-proparilidino]malononitrilo</td><td>MilliporeSigma (Aldrich)</td><td>727881 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/727881?lang=en&region=US</td><td></td></tr><tr><td>ácido a-ciano-4-hidroxicinámico</td><td>MilliporeSigma (Sigma)</td><td>C8982</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c8982?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>tetrahidrofurano</td><td>Fisher Scientific</td><td>T425-1</td><td></td></tr><tr><td>diclorometano</td><td>VWR Analítico</td><td>BDH1113-4LG</td><td></td></tr></tbody></table>

caracterización de polímeros sintéticos vía matriz asistida por láser desorción de ionización tiempo de vuelo (maldi-tof) espectrometría de masas

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry

Hay muchas técnicas que pueden emplearse en la caracterización de los homopolímeros sintéticos, pero pocos proporcionan útiles de información para el análisis de grupo final como el tiempo de ionización de desorción láser asistida por matriz de espectrometría de masas de vuelo (MALDI-TOF MS). Este tutorial muestra los métodos para la optimización de la preparación de muestras, adquisición espectral, y análisis de datos de polímeros sintéticos utilizando parámetros de MALDI-TOF MS. crítico durante la preparación de la muestra incluyen la selección de la matriz, identificación de una sal de embargo correspondiente y ajuste las proporciones relativas de la matriz, el catión y el analito. Los parámetros de adquisición, como el modo (lineal o reflector), polarización (positivo o negativo), voltaje de aceleración y tiempo de retardo, también son importantes. Teniendo en cuenta algunos conocimientos de la química para sintetizar el polímero y la optimización de los parámetros de adquisición de datos y las condiciones de preparación de muestra, espectros deben obtenerse con suficiente resolución y exactitud total para permitir la clara determinación de los grupos de final de la mayoría homopolímeros (masas por debajo de 10.000) además de la unidad de repetición masa y la distribución de peso molecular general. Aunque demostró en un conjunto limitado de polímeros, estas técnicas generales son aplicables a una gama mucho más amplia de polímeros sintéticos para determinar distribuciones de masa, aunque final Grupo determinación sólo es posible para los homopolímeros con estrechas dispersity.

Un protocolo para el tiempo de ionización desorción láser asistida por matriz de caracterización de la espectrometría de masas (MALDI-TOF MS) de los polímeros sintéticos se describe como la optimización de la preparación de muestras, adquisición espectral y análisis de datos de vuelo.

Caracterización de polímeros sintéticos vía matriz asistida por láser desorción de ionización tiempo de vuelo (MALDI-TOF) espectrometría de masas

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group ...

El objetivo general de este tutorial de MALDI-TOF MS es enseñar a los usuarios sobre la preparación, adquisición y análisis de muestras de polímeros durante la caracterización por MALDI-TOF MS. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la caracterización de polímeros, como el peso molecular del polímero, la dispersión y la identidad del grupo final. La principal ventaja de esta técnica es que permite determinar los grupos finales de los homopolímeros. En primer lugar, se prepara una serie de soluciones mezclando soluciones de matriz, analito y catión previamente preparadas, variando las proporciones relativas de los componentes, de modo que se hagan nueve mezclas de muestras únicas.Para este experimento, combine 15 microlitros de solución de poli(L-lactida) con 15 microlitros de solución de ácido 2,5-dihidroxibenzoico y un microlitro de solución de tricloroacetato de sodio. Pipetear un microlitro de cada mezcla de solución en un pocillo de muestra individual en una placa objetivo MALDI. Agregue las muestras de forma incremental en porciones pequeñas para evitar que la muestra fluya fuera del pocillo de muestra, permitiendo que cada alícuota se evapore hasta la sequedad antes de agregar muestra adicional.Para iniciar la adquisición de datos, primero abra el software de adquisición de datos, Flexcontrol. Expulse la plataforma para permitir la carga de la placa objetivo presionando el botón de expulsión. Coloque suavemente la placa objetivo con el calibrador cargado y las muestras de analito en la plataforma en la orientación adecuada.A continuación, utilice el software de adquisición para inyectar la placa objetivo en la plataforma pulsando de nuevo el botón de expulsión. Seleccione un método de adquisición de datos adecuado pulsando Archivo y eligiendo Seleccionar método. Antes de adquirir datos, asegúrese de seleccionar un rango de masa adecuado para recopilar datos haciendo clic en la pestaña Detección y viendo Rango de masa.En el software de adquisición, seleccione la posición en la placa objetivo que corresponda al analito deseado. Para iniciar la recopilación de datos, presione Inicio y mueva el objetivo láser alrededor de la muestra para maximizar la señal. Usando la barra deslizante en el lado izquierdo de la ventana de la cámara, ajuste la potencia del láser de manera que se logre la potencia mínima necesaria para lograr la resolución isotópica.Al acercarse a un pico individual en el centro del rango de masa de interés, optimice la resolución ajustando la diferencia en los voltajes de aceleración variando el valor IS2 en la pestaña Espectrómetro. Por último, optimice la potencia del láser reduciéndola lo más posible sin dejar de generar una relación señal-ruido razonable. Una vez optimizados los parámetros de adquisición, guarde el método seleccionando Archivo y, a continuación, Guardar método como.Asegúrese de que cualquier calibración existente esté anulada o en posición de sobrescribirse pulsando Invalidar calibración en la pestaña Espectrómetro.Utilizando los mismos parámetros de adquisición, mueva el láser sobre el pocillo de muestra que contiene el calibrante seleccionando el pocillo correspondiente con el cursor y adquiera un espectro pulsando Inicio. Una vez que se haya adquirido una señal suficiente, presione Iniciar para finalizar la adquisición de los datos. Una vez que se haya adquirido un espectro de masas del calibrante, seleccione el menú desplegable Lista de control de masa en la pestaña Calibración que corresponda a ese estándar de calibración.Antes de hacer coincidir el pico de referencia correspondiente con cada pico de calibrador seleccionado, asegúrese de que se está utilizando un protocolo de selección de picos adecuado seleccionando la pestaña Procesamiento. Aplique la masa de referencia de la lista de control de masa a la señal correspondiente para el espectro de masas del calibrador seleccionando el área a la izquierda del pico de interés y luego haciendo clic en la masa correspondiente en la lista de control para aplicar. Continúe este proceso para los picos de calibrador restantes.Vuelva a adquirir el espectro del analito una vez que se haya calibrado la escala de masa para los parámetros de adquisición optimizados. Abra el espectro de analito en el software de análisis de datos. Acérquese a un pico para identificar si se ha logrado una resolución isotópica seleccionando el botón Acercar rango X.Ahora, presione Lista de masas y elija Buscar para seleccionar picos. Si el pico monoisotópico se resuelve, seleccione este primer pico en la distribución isotópica para determinar su masa utilizando un protocolo de selección de picos monoisotópicos. MALDI-TOF MS confirma la distribución estrecha de poli(L-lactida)tiol terminado y se utilizó un software de análisis para calcular las características del polímero que se muestran aquí.La masa observada para el 26-mer es de 1973,62, que es menos 0,07 daltons diferente del valor teórico. Una señal más pequeña en 2045.74 es indicativa de transesterificación durante la polimerización del ácido láctico en la apertura del anillo. Un pequeño pico en 2057.73 es probablemente la consecuencia de la iniciación del agua durante la polimerización de apertura del anillo del monómero lactídico.MALDI-TOF MS confirma la estrecha distribución del poli(L-lactida)tiol terminado después de una reacción de tiol-eno con maleimida y se utilizó un software de análisis para calcular las características del polímero que se muestran aquí. La masa teórica del 26-mer de poli(L-lactida)tiol terminado corresponde a 2070,56891, que es 0,03 daltons diferente de la masa observada. La misma especie ionizante con potasio también se observa en 2086.49.Un pequeño pico en 2167.58 es indicativo de la misma impureza de la iniciación del agua que se observó en el material de partida. No se produce el mismo cambio de masa observado para los productos de la reacción tiol-eno, lo que indica que este compuesto terminado en ácido carboxílico carecía del grupo final tiol para someterse a la reacción de funcionalización. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo optimizar la preparación de muestras y los parámetros de adquisición de datos, así como analizar los datos generados por la caracterización de polímeros por espectrometría de masas MALDI-TOF.

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Caracterización de polímeros sintéticos vía matriz asistida por láser desorción de ionización tiempo de vuelo (MALDI-TOF) espectrometría de masas

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