Detección de detergente-sensible a las interacciones entre proteínas de la membrana
March 7th, 2018
Se describe un protocolo para la detección de detergente-sensible a las interacciones entre proteínas de la membrana mediante la Unión del receptor de la clasificación, sortilina, para el primer bucle luminal de la proteína del transportador de glucosa, GLUT4, como ejemplo.
El objetivo general de este procedimiento es detectar interacciones sensibles al detergente entre proteínas de membrana u otras proteínas. Este procedimiento requiere que una proteína sea marcada con histidina y sobreexpresada en las células, mientras que la otra es un péptido marcado con myc. Este método puede ayudar a responder preguntas en el campo de la bioquímica importantes estudios de interacción de proteínas.
La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de detectar la interacción entre las proteínas de membrana de una manera sensible al detergente. El procedimiento es rápido y sencillo. Aunque este método puede proporcionar información sobre las interacciones de las proteínas de membrana, también se puede utilizar para estudiar las interacciones débiles de las proteínas.
La idea de este método fue cuando quisimos comprobar la interacción entre las proteínas de membrana, Saltilin y GLUT4, pero los intentos de co-inmunoprecipitarlas a partir de la lisis de mamíferos siguen siendo infructuosos. Para realizar un pedido del péptido, seleccione la secuencia objetivo del péptido crítico para la interacción y agregue un epítopo myc al final o al extremo C de la secuencia. Una vez que el péptido haya llegado, pepare 100 microgramos por mililitro de solución de trabajo del péptido en agua ultra pura.
Siembre tres células preadipocitos 3T3-L1 en cuatro placas de cultivo de 10 centímetros y manténgalas en la incubadora. A continuación, transfecte dos placas de cultivo con la proteína objetivo marcada con histodina 6X y marque como HISP en las otras dos placas con dos plásmidos de control y etiquete como WT. Después de la transfección, deje las células en la incubadora durante 48 horas para alcanzar una confluencia del 80 al 90%. Para preparar el lisado celular, lave las células con hielo tres veces con 10 mililitros de solución salina tamponada 1X enfriada cuatro grados centígrados.
A continuación, añade 500 microlitros de tampón de lisis a cada uno de ellos. Luego, separe las células de los platos con un raspador de células para preparar el lisado. Transfiera el lisado celular preparado de cada placa de cultivo a cuatro tubos separados de 1,5 milímetros y etiquete todos los tubos.
Luego, pase el lisado celular a través de una jeringa con aguja de calibre 26 hacia arriba y hacia abajo cinco veces para una lisis celular total. A continuación, centrifugar los lisados celulares a 16000xg durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera los sobrenadantes a cuatro tubos nuevos etiquetados de manera idéntica.
Para futuros experimentos de control y resolución de problemas, alícuota 20 microlitros del lisado celular y almacenarlo a 20 grados centígrados. Para su uso posterior, titule el tampón de lavado a PH8 con ácido clorhídrico para obtener PH6 y almacene el tampón a cuatro grados centígrados. A continuación, para preparar una suspensión homogénea de las perlas de cobalto, agite con cuidado la botella.
Luego, transfiera 40 microlitros de suspensión de perlas de cobalto a los cuatro tubos marcados individualmente. Después de agregar las perlas de cobalto, agregue un mililitro de tampón de lisis a los tubos. Luego, centrifuga los tubos a 1000xg durante cinco segundos.
Deseche el sobrenadante y pipetee 40 microlitros de tampón de lisis a las perlas sedimentadas. A continuación, transfiera el lisado celular a los tubos correspondientes e incube a cuatro grados centígrados durante 90 minutos en un rotador de tubos. Después de 90 minutos, centrifugar las muestras a 1000xg durante cinco segundos.
Luego, recoja el sobrenadante etiquetado como Flowthrough-1 y guárdelo a 20 grados centígrados. A continuación, añada 500 microlitros del tampón de lavado con PH8 a los tubos individuales y vuelva a suspender las perlas suavemente. Centrifugar los tubos a 1000xg durante cinco segundos y expulsar los sobrenadantes.
A continuación, añada tampón de lavado con PH8 con o seis a los tubos, según las etiquetas y vuelva a suspender bien las perlas. Centrifugar los tubos a 1000xg durante cinco segundos y expulsar los sobrenadantes. Prepare un microgramo por mililitro de solución de trabajo del péptido y tampón de agua con PH6 u ocho.
A continuación, añada 100 microlitros de la solución peptídica a las perlas lavadas correspondientes a un PH similar. Luego, incube las perlas a cuatro grados centígrados en un tubo giratorio durante 30 minutos. Luego, tome cuatro microcolumnas, etiquételas y colóquelas en tubos de recolección etiquetados como Flowthrough-2. Una vez finalizada la incubación, agregue la mezcla de incubación a las columnas.
Deje que la solución pase a través de la fuerza gravitacional y recoja la muestra del flujo. Coloque las columnas en tubos de recolección nuevos y guárdelas a 20 grados centígrados. Luego, pase 500 microlitros de tampón de lavado con PH6 u ocho por flujo gravitacional a través de las columnas individuales y deseche el flujo.
Repita este paso cuatro veces. Centrifuga los tubos a 1000xg durante cinco segundos. Coloque la columna en el nuevo tubo de recolección etiquetado como Elución.
Es importante lavar las perlas en todos los tubos con mucho cuidado e igualdad para deshacerse del péptido no unido. A las perlas lavadas, agregue 40 microlitros de tampón de muestra de tricina con beta mercaptoetanol. Déjalo reposar durante 20 minutos a temperatura ambiente.
Centrifugar la columna a 8000xg durante dos minutos. Deseche las columnas y caliente los tubos colectores a 100 grados centígrados durante 10 minutos. Y luego, centrifugarlo a 1000xg durante cinco segundos.
Alternativamente, agregue 40 microlitros de tampón de elución imidazol a las perlas lavadas e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos. Una vez finalizada la incubación, centrifugar los tubos a 8000xg durante dos minutos. Deseche las columnas y agregue 40 microlitros de muestra de tricina.
Caliente los tubos colectores a 100 grados centígrados durante 10 minutos y luego centrifugue a 1000xg durante cinco segundos. Utilice los geles de gradiente de tricina al 10-20% disponibles en el mercado. Utilice el tampón de ejecución Tris/Tricine/SDS, luego cargue 20 microlitros de cada una de las muestras eluidas y lisados totales en el gel y comience a ejecutar la unidad de electroforesis.
Una vez finalizada la electroforesis, utilice un tampón de transferencia complementado con un 20% de metanol para transferir el material del gel a una membrana de nitrocelulosa de 0,45 micrómetros. Después de bloquear la membrana, córtela horizontalmente. A continuación, pruebe la parte superior de la membrana con el anticuerpo Anti His P en la mitad inferior de la membrana con anti myc.
Para estudiar la interacción entre la sortilina inmovilizada sobre las perlas de cobalto en GLUT4, se realizó un análisis de inmunotransferencia. Los lisados celulares y eluidos se obtuvieron de tipo salvaje y células 3T3-L1 transfectadas con Sortilin-myc/His-tagged y luego se cargaron en la página SDS. El blot se probó con anticuerpo anti-myc.
El blot muestra un bucle luminal de 110 kilodotina Sortili-myc/marcado con His y cinco kilotinas myc-primer bucle luminal-GLUT4 de los eluidos transfectados. A continuación, para estudiar la importancia del PH y la interacción entre Sortilin inmovilizado en perlas de cobalto y GLUT4, se realizó un análisis de inmunoblot. En este ensayo, el bucle luminal Myc-first GLUT4 se incubó con perlas inmovilizadas con proteínas marcadas con Sortilin-myc/His tanto en PH6 como en ocho.
El blot muestra una clara interacción entre Sortilin-myc/His y el bucle luminal myc-first GLUT4, ambos en PH6 y ocho de los eluidos obtenidos de las células 3T3-L1 transfectadas con Sortilin-myc/His. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres o cuatro horas hasta que las muestras estén listas para el análisis de sangre occidental. Al intentar este procedimiento, es importante recordar diseñar un péptido que sea soluble, preferiblemente en agua.
Para fortalecer sus resultados, se pueden realizar otros métodos como la inmunoprecipitación después de la reticulación. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo detectar proteínas de membrana, interacciones de proteínas en un procedimiento sensible al detergente. También permite explorar la interacción entre fragmentos de proteínas.
Jazz rítmico suave.
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Visión general
Este artículo describe un protocolo para detectar interacciones sensibles a detergentes entre proteínas de membrana, utilizando como ejemplo la unión del receptor de clasificación, sortilin, a la proteína transportadora de glucosa, GLUT4. El método está diseñado para facilitar estudios de interacciones de proteínas en un contexto bioquímicamente relevante.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Bioquímica
- Interacciones de proteínas de membrana
- Técnicas de etiquetado de proteínas
Fundamentos
- Entender las interacciones de proteínas es crucial en bioquímica.
- Las proteínas de membrana a menudo requieren condiciones específicas para estudiar sus interacciones.
- Los métodos sensibles a detergentes proporcionan información sobre la dinámica de estas interacciones.
- El etiquetado de histidina y myc son técnicas comunes utilizadas para la detección de proteínas.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método confiable para detectar interacciones entre proteínas de membrana.
- Destacar las ventajas de usar técnicas sensibles a detergentes.
- Proporcionar un protocolo rápido y fácil para los investigadores en el campo.
Métodos utilizados
- Sobreexpresión de proteínas etiquetadas con histidina en células.
- Uso de un péptido etiquetado con myc para estudios de interacción.
- Aplicación de ensayos sensibles a detergentes para detectar interacciones de proteínas.
- Análisis de las interacciones de unión entre sortilin y GLUT4.
Principales resultados
- El protocolo detecta exitosamente interacciones entre proteínas de membrana.
- La sensibilidad al detergente permite el estudio de interacciones débiles de proteínas.
- Los resultados demuestran la efectividad del método de etiquetado.
- El procedimiento es eficiente y reproducible para los investigadores.
Conclusiones
- Este método proporciona información valiosa sobre las interacciones de proteínas de membrana.
- Puede aplicarse a varios estudios de interacción de proteínas.
- La investigación futura puede construir sobre esta técnica para una comprensión más profunda.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Detection of detergent-sensitive interactions between membrane proteins addresses a critical gap in early discovery, where conventional co-immunoprecipitation fails to capture weak or transient luminal contacts. This assay enables biopharma teams to validate protein-protein interactions under native-like conditions, supporting mechanistic de-risking and target confidence at the portfolio triage stage. The method's adaptability to other membrane protein systems enhances its strategic value for enterprise R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of weak or transient membrane protein interactions that are detergent-sensitive.
- Supports functional target validation by confirming direct binding events in a controlled biochemical context.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing true biological interactions from artifacts of harsh extraction conditions.
- Improves predictive confidence for advancing targets into downstream screening or validation workflows.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein interaction systems for downstream quantitative assays and screening platforms.
- Standardizes detection of protein-protein interactions using tagged constructs and reproducible Western blot readouts.
- Enables reproducible and scalable workflows for evaluating compound effects on membrane protein complexes.
- Supports reliable assay development for membrane protein interaction studies where detergent sensitivity is a concern.
Translational & Preclinical Research
- Provides mechanistic insight into disease-relevant membrane protein interactions when aligned with translational biomarker strategies.
- Ensures continuity from discovery-stage validation to preclinical model selection by confirming interaction specificity.
- Reduces risk of late-stage attrition due to undetected weak or context-dependent protein interactions.
Pipeline & Workflow Integration
This assay fits at the interface of early discovery and lead identification, enabling teams to validate membrane protein interactions before committing resources to large-scale screening or preclinical studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by confirming direct protein-protein contacts under native-like conditions.
- Screening: Provides a reproducible, quantitative readout for interaction strength and specificity using Western blot analysis.
- Analytics: Delivers measurable outputs (e.g., band intensity, presence/absence) to compare interaction conditions such as pH sensitivity.
- Translational Research: Aligns with biomarker strategies when membrane protein interactions are implicated in disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable workflow for diverse membrane protein systems beyond the initial sortilin-GLUT4 example.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in membrane protein target validation.
- Operational Value: Delivers a standardized, rapid, and reproducible protocol for interaction detection.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by de-risking targets early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of membrane protein targets with validated interactions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein tagging, cell culture, and Western blot analysis.
- Needs access to mammalian expression systems, peptide synthesis, and analytical instrumentation for immunoblotting.
- Demands rigorous cross-team standardization of buffer conditions and tagging strategies for reproducibility.
- Adaptable to various membrane protein systems but may require optimization for peptide solubility and tag placement.
- Limited to interactions detectable under the chosen biochemical conditions; may not capture all physiologically relevant contacts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:05
Handling of the Peptide and Cells
3:02
Binding of His-tagged Proteins to the HisPur Cobalt Beads
4:39
Binding of the Peptide to the His-tagged Protein Immobilized on the Beads
5:59
Elution from Cobalt Beads
7:07
Electrophoresis, Western Blotting, and Analysis of Results
7:58
Results: Use of Immunoblot Assay to Study the Interaction between Sortilin Immobilized on Cobalt Beads and myc-tagged Peptide
9:18
Conclusion
