Un método para definir los efectos del enriquecimiento ambiental sobre la biodiversidad de microbioma de Colon en un modelo de Tumor de Colon murino

El objetivo principal de esta publicación es presentar un método para normalizar el microbioma de los roedores. En esta demostración, se analiza el efecto del enriquecimiento ambiental en el microbioma durante la génesis del tumor de colon. Este protocolo muestra cómo la normalización del microbioma antes de una intervención de enriquecimiento ambiental mejora la reproducibilidad experimental.

También mostramos cómo reducir el estrés de los animales y mejorar las interacciones utilizando un entorno enriquecido. Aunque nos hemos centrado en el efecto del enriquecimiento ambiental en un modelo de tumor de colon, el método se puede aplicar fácilmente para comprender mejor el papel del microbioma en la etiología de la enfermedad. Coloque las jaulas en condiciones estériles trabajando bajo una campana ventilada.

Los controles para este experimento consisten en jaulas convencionales con ropa de cama y tejido de laboratorio para anidar, pero por lo demás carecen de dispositivos de enriquecimiento. Para configurar las jaulas de cría de cachorros o enriquecidas ambientalmente, conecte dos jaulas grandes esterilizadas en autoclave con un túnel asegurado con ojal esterilizado e incluya una plataforma esterilizada en cada jaula para aumentar el espacio en el piso. Para EE, también proporcione ruedas para correr, túneles, iglús, cabañas, pelotas de arrastre y material de anidación esterilizados.

Coloque las jaulas enriquecidas y las jaulas de control en el mismo bastidor para proporcionar una ventilación uniforme. Para la cría, combine un padre y dos madres potenciales en jaulas normales. Todas las mañanas, compruebe si hay tapones vaginales que indiquen que el animal se ha apareado durante la noche.

Si no se ve un tapón, la resistencia al sondaje vaginal puede detectar un tapón internalizado. Si una hembra tiene un tapón vaginal, transfiérala a una jaula grande para criar cachorros. Hasta 12 madres preñadas pueden ser alojadas en las jaulas con plataformas enriquecidas ambientalmente, siempre que se espere que todas den a luz durante la misma semana.

Cuando las crías tengan entre 21 y 28 días de edad, distribuya los machos y las hembras por genotipo en ambientes de control o ambientes enriquecidos. Asegúrate de mantener una proporción de cada genotipo en cada jaula. Las jaulas no enriquecidas pueden soportar hasta cinco ratones, mientras que las jaulas enriquecidas requieren al menos 20 ratones para la estimulación social y pueden soportar hasta 41 ratones.

Comience a recolectar heces uno o dos días antes de sacrificar a los ratones. Recoja siempre a la misma hora del día. Para recoger las heces de los animales vivos, frote cuidadosamente el animal sobre una jaula limpia.

A continuación, recoja las heces defecadas con pinzas estériles y transfiéralas a un tubo de microfuga estéril. Si un animal no defeca inmediatamente, colóquelo en una jaula limpia y espere a que el animal defece, lo que puede tardar hasta una hora. Para recolectar heces de un animal sacrificado, diseccionarlas para acceder al colon.

A continuación, corta el colon justo debajo del ciego y colócalo sobre un trozo de papel de filtro. Luego, use fórceps para levantar la parte superior del tubo del colon y abrir el lumen con unas tijeras. Corte longitudinalmente distal a proximal para abrir el colon a lo largo.

A continuación, recoja las heces del colon distal en un tubo de microfuga estéril con pinzas estériles. Almacene las muestras de heces a menos 80 grados centígrados. Además de las heces, recoja otras muestras de tejido del colon y el intestino delgado, microsomas, tejido adiposo, etc.

Utilice un kit comercial para aislar el ADN microbiano de las heces siguiendo un protocolo de detección de patógenos en las heces. Al hacerlo, transfiera las muestras del congelador a menos 80 grados Celsius sobre hielo seco y péselas. A continuación, configure una PCR que amplifique el ADN microbiano como se describe en el protocolo de texto.

A continuación, limpie los productos de reacción con perlas magnéticas. Para la limpieza, primero centrifugar brevemente la placa de PCR amplicon para agrupar los productos de reacción. A continuación, agite las perlas magnéticas para dispersarlas uniformemente y transfiera 20 alícuotas de microlitros a cada pozo de reacción.

Mezcle bien las perlas con la solución pipeteando todo el volumen lentamente 10 veces. Luego deje que las cuentas se asienten durante cinco minutos. A continuación, coloque la placa de PCR en un soporte magnético y espere dos minutos a que los sobrenadantes se eliminen después de la recolección magnética de perlas.

A continuación, retire y deseche los sobrenadantes. A continuación, con la placa todavía en el imán, llene cada pocillo de perlas con 200 microlitros de etanol fresco al 80% y espere 30 segundos. A continuación, retire con cuidado el sobrenadante.

Repite este paso de lavado una vez y deja que las cuentas se sequen al aire durante 10 minutos. Ahora eluya los productos de reacción de las perlas retirando la placa del soporte magnético y añadiendo 52,5 microlitros de Tris a cada pocillo. Mezcle completamente las perlas en la solución pipeteando todo el volumen lentamente 10 veces.

A continuación, recoja las perlas en el soporte magnético como antes y transfiera 50 microlitros del sobrenadante a una placa PCR limpia. Cubra la placa con un adhesivo transparente y guárdela a menos 20 grados centígrados hasta por una semana. Utilice el sobrenadante recolectado para realizar una PCR de índice para adjuntar códigos de barras a la secuencia del adaptador.

A continuación, purifique los productos y prepare la biblioteca indexada para la secuenciación. En ratones, se sabe que el enriquecimiento ambiental mejora la esperanza de vida y la reparación de heridas tumorales. Para definir el papel de la microbiota en este fenotipo, se integraron animales reproductores en la colonia de ratones durante al menos un mes para normalizar la microbiota.

Luego se criaron y su progenie se crió en un ambiente enriquecido o en un ambiente normal. La progenie también era portadora de tumores o de tipo salvaje. Después de 16 semanas, los animales fueron sacrificados y se recolectaron muestras de heces para aislar el ADN microbiano.

A continuación, se utilizó la PCR para amplificar la subunidad ribosómica 16S en las muestras para estudiar los componentes del microbioma. A continuación, los productos de reacción se identificaron mediante la indexación de códigos de barras. Curiosamente, los ambientes mejorados no mejoran la biodiversidad en los animales de tipo salvaje, pero aumentan enormemente la biodiversidad en los animales portadores de tumores.

Esto demuestra la sensibilidad del método. Este aumento de la biodiversidad se atribuyó a una mayor presencia del filo Proteobacteria con aumentos significativos en las clases alfaproteobacterias y betaproteobacterias y una disminución de las gammaproteobacterias patógenas. El mayor aumento en la clase de betaproteobacterias se produjo en el género Sutterella, un probable comensal implicado en la degradación de la inmunoglobulina A secretada.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo modificar las prácticas de cría para normalizar el microbioma entre animales de experimentación antes de comenzar con sus intervenciones de interés. Al realizar este procedimiento, recuerde que los animales han establecido su territorio dentro del medio ambiente. Debido a esto, los cambios en el medio ambiente pueden causar estrés que afectará el microbioma del animal.

Un cambio repentino en el comportamiento del animal es un signo físico de estrés. Siguiendo este procedimiento, se pueden aislar microbios específicos y caracterizarlos aún más para probar la suficiencia del microbio identificado en la progresión de la enfermedad.