Protocolo de aislamiento de células dendríticas derivadas de monocitos de ratón y su activación posterior In Vitro con complejos inmunes Tumor

Este método está diseñado para ayudar a los científicos a aislar las CD derivadas de monocitos de la sangre y los tumores de ratones portadores de tumores con el fin de estudiar sus propiedades inmunoestimulantes. Creo que la principal ventaja de este procedimiento en comparación con otros métodos es que las CD derivadas de monocitos obtenidas reflejan mejor su estado de activación en el tumor y en la sangre. Probablemente lo más difícil sea asegurarse de que todos sus reactivos y herramientas sean estériles y que no introduzca contaminación durante este procedimiento.

Llevo más de 15 años aislando células mieloides y células dendríticas de tumores, y tuve la idea de este método cuando me di cuenta de que los diferentes protocolos de aislamiento daban lugar a diferentes patrones de activación celular. La Sra. Santana-Magal, que es una estudiante de posgrado en mi laboratorio, demostrará el procedimiento.

Después de sacrificar a los ratones usando dióxido de carbono dentro de una campana de flujo laminar, extraiga los tumores y colóquelos en medio RPMI sin suero fetal bovino. Luego, use unas tijeras quirúrgicas para cortar el tumor en pedazos pequeños. Transfiera todas las piezas tumorales de un solo ratón a un tubo de fondo plano de 30 mililitros que contenga tampón HBSS suplementado con colagenasa IV y DNasa I junto con las barras de agitación magnéticas.

Incubar el tubo con los trozos tumorales en un agitador a 37 grados centígrados con un agitador magnético en su interior a 200 a 400 revoluciones por minuto durante 20 a 30 minutos. A continuación, filtre las células a través de un colador de células de 70 micrómetros. Luego, centrifuga las células a 400 veces g durante cinco a 10 minutos a cuatro grados centígrados.

Después de la centrifugación, agregue 1,5 mililitros de solución madre de medio de gradiente de densidad a 8,5 mililitros de HBSS. A continuación, mezcle vigorosamente el medio de gradiente de densidad. A continuación, pipetee la mezcla en el pellet.

Centrifugar la suspensión celular a 400 veces g durante 20 minutos a temperatura ambiente. Decantar el sobrenadante una vez finalizada la centrifugación. Después de lavar las celdas peletizadas dos veces, vuelva a suspender en un mililitro de tampón de aislamiento.

Agregue la suspensión celular a 30 microlitros de perlas magnéticas conjugadas CD11b. A continuación, incuba la mezcla a cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón de aislamiento.

Aplique la suspensión de celdas sobre una columna magnética prelavada. A continuación, utilice tres mililitros de tampón de aislamiento para lavar la columna dos veces. A continuación, retire la columna del imán.

A continuación, agregue seis mililitros de tampón de aislamiento en la columna. Empuje con un émbolo para enjuagar las células marcadas magnéticamente en un tubo de recolección estéril. Una vez más, centrifugar las células a 400 veces g durante cinco a 10 minutos a cuatro grados centígrados.

Después de resuspender y teñir las células, clasifique las células por la compuerta de las células pequeñas, utilizando el lado pequeño y la dispersión hacia adelante pequeña. Después de sacrificar al ratón, rocíe etanol al 70% sobre él. Luego, use tijeras quirúrgicas para quitar la piel que cubre el corazón debajo del capuchón laminar.

A continuación, limpie las tijeras con etanol. Lave la cavidad con EDTA HBSS de 20 milimolares y use las tijeras para cortar la aurícula derecha del corazón. Luego, use una jeringa de 10 mililitros con una aguja de calibre 25 para enjuagar lentamente el ventrículo derecho del corazón con EDTA HBSS de 20 milimolares.

Luego, use una jeringa estéril para extraer sangre de la cavidad pleural. Transfiera la sangre en un tubo que contiene heparán sulfato y EDTA. A continuación, pipetee la sangre en el medio de gradiente de densidad.

Centrifugar las células sanguíneas a 400 veces g durante 15 minutos a temperatura ambiente con freno bajo. Después de la centrifugación, recoja las células mononucleares en un tubo. Disuelva las células en 10 mililitros de tampón de aislamiento para lavar las células.

Nuevamente, centrifuga las células a 400 veces g durante cinco a 10 minutos a cuatro grados centígrados. Para seleccionar las células CD11b, vuelva a suspender el pellet de la célula en un mililitro de tampón de aislamiento. Incubar durante 15 minutos con 50 microlitros de perlas magnéticas conjugadas CD11b a cuatro grados centígrados.

Vuelva a centrifugar a 400 veces g durante cinco a 10 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, retira el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón de aislamiento.

A continuación, aplique la suspensión de celdas sobre una columna magnética prelavada. Lave la columna con el tampón de aislamiento dos veces. Retire la columna del imán y agregue seis mililitros de tampón de aislamiento en la columna.

A continuación, enjuague las células marcadas magnéticamente en un tubo de recolección estéril empujando el émbolo. Centrifugar las células a 400 veces g durante cinco a 10 minutos a cuatro grados centígrados. Resuspender las células en tampón de aislamiento y teñir con anticuerpos conjugados con fluoróforos.

Ordene las celdas por compuerta las celdas pequeñas usando el lado pequeño y la dispersión hacia adelante pequeña. Primero, fije las celdas en paraformaldehído tamponado al 1,8% durante 10 minutos a temperatura ambiente. Siembre la suspensión celular en cada pocillo de una placa de 96 pocillos en forma de U.

A continuación, agregue diluciones variables de anticuerpos que se unen al tumor en cada pocillo. A continuación, incube las células en hielo durante 15 a 20 minutos. Después de la incubación, lavar las células con 150 microlitros de solución salina tamponada con fosfato.

Luego, centrifugar a 400 veces g durante cinco a 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, expulse el sobrenadante y lave las células dos veces. Disolver las células en 100 microlitros de tampón FACS que contiene un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos.

A continuación, incube la placa en hielo durante 15 a 20 minutos. Después de 15 a 20 minutos, agregue 200 microlitros de tampón FACS para lavar las células. Centrifugar la placa a 400 veces g durante cinco a 10 minutos.

Decantar el sobrenadante. Realizar citometría de flujo para analizar la unión del tumor y determinar la concentración mínima de inmunoglobulina G necesaria para recubrir las células. Una vez que las células estén recubiertas con una concentración mínima de inmunoglobulina G, agregue el complejo inmune tumoral marcado con CFSE a las células dendríticas derivadas de monocitos en una proporción de uno a cinco.

Luego, incube la mezcla durante 12 a 16 horas durante la noche en medio completo. Realizar análisis FACS de la activación de las células dendríticas derivadas de monocitos. La intensidad media de fluorescencia se calcula siguiendo un análisis de citometría de flujo para estudiar la presencia de anticuerpos IgG y M que se unen ex vivo a las células tumorales LMP.

Los resultados muestran que los anticuerpos IgG de los ratones alogénicos C57-Black/6 se unen a las células tumorales mucho más fuertes que los anticuerpos de los ratones singénicos 129S1. A continuación, se calcula la intensidad de fluorescencia media de la capacidad de unión de las células tumorales B16F10 con la IgG. La IgG obtenida de ratones alogénicos 129S1 muestra una intensidad de tinción 10 veces mayor con el tumor B16F10 en comparación con la IgG singénica de ratones C57-Black/6

A continuación, se capturan imágenes microscópicas DIC para mostrar las células dendríticas derivadas de monocitos asociadas al tumor de los tumores B16F10. Aquí, se capturan imágenes DIC para mostrar las células dendríticas derivadas de monocitos inflamatorias y patrullas aisladas de la sangre de ratones portadores de tumores B16F10. El análisis de citometría de flujo también se realiza para comparar los patrones de activación de las células dendríticas derivadas de monocitos del bazo y la médula ósea con los del tumor y la sangre en la incubación con el complejo inmune.

El resultado muestra un aumento de la expresión de CD86 y MHC II por parte de la médula ósea y las células dendríticas esplénicas con los complejos inmunes. Luego, se realiza la inmunohistoquímica confocal, que muestra la absorción tumoral y la expresión de MHC II cuando las células dendríticas se incuban con el complejo inmunitario tumoral marcado con CFSE. Una vez dominado, este procedimiento se puede realizar en unas pocas horas, dependiendo de la cantidad de ratones que esté utilizando.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe mantener todos sus reactivos y herramientas estériles en todo momento. El pelaje del ratón es una fuente importante de contaminación. Asegúrate de que ninguno de los pelos toque tus tejidos.

Esperamos que después de ver este vídeo, comprenda bien cómo aislar las CD derivadas de monocitos de la sangre y los tumores de ratón y cómo activarlas posteriormente con células del complejo inmunitario evitando su activación prematura.