Name: Protocolo de aislamiento de células dendríticas derivadas de monocitos de ratón y su activación posterior In Vitro con complejos inmunes Tumor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Aprende a aislar células dendríticas derivadas de monocitos de sangre y tumores de ratón para estudiar sus propiedades inmunostimuladoras. Este protocolo mantiene la esterilidad para evitar activación prematura y obtener resultados fiables.

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Los protocolos siguientes se refieren al aislamiento de ratón MoDC, sin embargo, los principios generales pueden aplicarse a otras células de subconjuntos de DC, así. 12 - ratones C57Bl/6j de 16-semanas de edad se mantuvieron en una asociación americana para la acreditación de laboratorio Animal Care – acreditado Animalario. Todos los protocolos fueron aprobados por la Universidad de Stanford y Universidad de Tel Aviv institucional Animal cuidado y uso.
1. aislamiento de Tumor asociados derivados de monocitos DC
<ol><li>En campana de flujo laminar, quitar tumores de CO2 eutanasia ratones y tumores en Medio RPMI sin suero fetal bovino (FBS). Nota: Se recomienda altamente los ratones y rociarlas con etanol al 70% antes de quitar los tumores, para minimizar la contaminación potencial de la piel. Asegúrese de que el tumor no supere los 25-40 mm2 puesto que los tumores más grandes tienen menos DC que tienden a ser frágiles y propensos a sufrir muerte celular. Si necesita un número mayor de DC, se puede inyectar cada ratón con células de tumores en múltiples sitios.</li>
	<li>Bajo una campana laminar estéril, picar los tumores utilizando tijeras de cirugía en pequeños pedazos (aproximadamente 1 x 1 mm2).<ol>
<li>Añadir todos los fragmentos del tumor de un ratón en un 30-mL fondo plano tubo estéril con barras de agitación magnética, que contiene 5 mL de Hank equilibrada solución de sal (HBSS), colagenasa IV de 2 mg/mL y 0.01 mg/mL DNasa I. PRECAUCIÓN: Células mieloides producen energía a través de glicosilación, incluso en estado estacionario. Por lo tanto, únicos medios de uso que contiene glucosa (HBSS, RPMI y DMEM), como hambre de glucosa para tan poco como 10-15 min resultará en la muerte celular y apoptosis en 24 h. uso sólo una colagenasa bajo endotoxina IV, como la colagenasa es producida por gram-positivos bacterias (Clostridium histolyticum).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Revuelva en cerca de 200-400 rpm en un incubador de 37 oC, con un agitador magnético durante 20-30 minutos.</li>
	<li>Añadir 5 mL de medio completo y resuspender vigorosamente.</li>
	<li>Filtro de las células a través de un tamiz celular de 70 μm. Centrifugar a 4 oC 400 rcf durante 5-10 minutos para que sedimenten las células. PRECAUCIÓN: No intente aislar las células inmediatamente después de la digestión enzimática, ya que algunos tumores necróticos contienen cantidades relativamente grandes de restos celulares o matriz extracelular. Aplicar células en 15% densidad gradiente medio para obtener únicamente las células.</li>
	<li>Suspender 9 mL de medio de gradiente de densidad con 1 mL de PBS de x 10 para ajustar la osmolalidad y obtener 100% solución de Percoll. Mezcla 1.5 mL densidad gradiente medio stock solución con 8,5 mL HBSS y mezcla vigorosamente con pellet de células tumorales. Suavemente de la capa 2 mL de DMEM en la parte superior 15% densidad gradiente medio y centrifugar a rcf 400 por 20 min a temperatura ambiente. Descartar los sobrenadantes, como las células formarán un balín en la parte inferior del tubo.<ol>
<li>Lavar las células pildoradas dos veces suspendiendo a los 10 ml que contiene 2% FBS, 1% de penicilina/estreptomicina y 10 mM EDTA (tampón de aislamiento) y centrifugar a 4 oC 400 rcf durante 5-10 minutos para que sedimenten las células HBSS.</li>
		<li>Contar las células en un hemocitómetro con trypan azul bajo un microscopio de luz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vuelva a suspender 1 x 108 células por separado 1 mL de búfer e incúbelos a 4 oC con 30 μL de CD11b conjugado de+ granos magnéticos durante 15 minutos. PRECAUCIÓN: Evite el uso de granos de CD11c conjugado, ya que esto activa el DC e inducir la muerte celular. No intente bloquear FcγRII y FcγRIII con anticuerpos anti-CD16/32. Bloqueo de anticuerpos ligar FcγR inducen fosforilación fuerte de MAP quinasas y cebar el DC.<ol>
<li>Quitar los granos exceso añadiendo 9 mL de tampón de aislamiento y centrifugar las células a rcf 400 5-10 min a 4oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 1 mL de tampón de aislamiento. Se aplican las celdas en una columna magnética prelavada. Lavar la columna dos veces con 3 mL de tampón de aislamiento.<ol>
<li>Retire la columna del imán. Pipeta de 6 mL de tampón de aislamiento a la columna y eliminar las células etiquetadas magnéticamente en un tubo estéril para recogida empujando el émbolo. Centrifugar las células en rcf 400 5-10 min a 4 oC.</li>
		<li>Resuspenda las células en 100 μL por 1 x 107 células y tinción con los anticuerpos conjugados fluoróforo siguientes: linaje negativo (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI y Ly6G), MHCII, Ly - 6C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ordenar celdas por que bloquean las células pequeñas, con dispersión lateral (SSC) y adelante scatter (FSC) y la cultura en completo suplementado con 5 ng/mL GM-CSF. Incube las células durante 1 hora a 3 7 oC para permitir que los macrófagos que se adhieren a la placa. Luego, transferir el libremente y no adherente células a un nuevo plato de cultura. Nota: MoDC de ratón se definen como CD11b+/CD11c+/MHCIIhi/Ly6Clo/int 7,26,27. Expresión de Ly6C puede variar dramáticamente entre modelos de tumores y en algunos modelos (por ejemplo, LMP) MoDCs carecen totalmente de expresión Ly6C. En general, un tumor de3 B16F10 de 100 mm por lo general contiene 5 x 104 de DC, lo que resulta en aproximadamente 4-5 x 106 células totales. De estas células, 10-15% son células inmunes y 8-10% MoDC. Aumento en el número de C.C. puede lograrse mediante la inyección a ratones con tumores en múltiples sitios. Las células SSC/FCS pequeña especie, como otras células mieloides pueden expresar marcadores como CD11c y Ly6C. Opcional: Tipo el monocito como pequeñas células SSC/FSC que expresar Ly6CHola y son negativos para MHCII infiltrantes de tumor. Después, la cultura monocitos en vitro con GM-CSF de 50 ng/mL para obtener DC.</li>
</ol>2. aislamiento de DC derivados de monocitos de sangre periférica
Nota: Desde MoDCs maduros son relativamente raras en la sangre de ratón, el protocolo que a continuación se refiere a su derivación en vitro de monocitos ordenados.
<ol><li>Para aumentar los niveles de monocitos en la sangre, anestesiar ratones con 4% de isoflurano y les inyecta por vía subcutánea (s.c.) con 1 μg de GM-CSF en 50 μL PBS.</li>
	<li>Después de 1-2 h, sacrificar ratones con CO2. PRECAUCIÓN: No sacrificar ratones por dislocación cervical, ya que esto causará hemorragia interna.</li>
	<li>Inmediatamente después euthanization, rocíe el ratón con etanol al 70% y quitar la piel que cubre el corazón con unas tijeras quirúrgicas, bajo campana de flujo laminar estéril. Limpiar las tijeras con etanol y cortar la aurícula derecha del corazón. Poco a poco, limpie el corazón por el ventrículo derecho con 20 mM EDTA HBSS utilizando una jeringa de 10 mL y aguja de 25 G.<ol>
<li>Recoger la sangre con una jeringa estéril de la cavidad pleural en un tubo estéril que contiene sulfato de heparán y EDTA. Seguir lavar el corazón hasta el hígado y rosa de los pulmones se convierten o blanco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aplicar sangre en una centrifugadora de americanos gradiente de densidad en rcf 400 a temperatura ambiente durante 15 minutos con poco freno. PRECAUCIÓN: Gradiente medio uso libre de endotoxina densidad (generalmente menos de 0.12 EU / mL).<ol>
<li>Recoger las células mononucleares en un tubo nuevo. Lavar las células suspendiendo nuevamente en 10 mL HBSS conteniendo 2% FBS, 1% de penicilina/estreptomicina 10 mM EDTA (tampón de aislamiento) y luego centrifugar a 4 oC 400 rcf durante 5-10 minutos para que sedimenten las células. PRECAUCIÓN: Utilice solamente los medios de comunicación que contiene al menos 1 g/L de glucosa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para la selección positiva de CD11b, vuelva a suspender 1 x 108 células en 1 mL de tampón de aislamiento e incubar por 15 min con 50 μL de granos magnéticos CD11b conjugado a 4 oC.<ol>
<li>Lavar granos exceso añadiendo 9 mL de tampón de aislamiento y centrifugación en rcf 400 5-10 min a 4 oC. aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 1 mL de tampón de aislamiento. Se aplican las celdas en una columna magnética prelavada según instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Quitar la columna del imán, pipeta de 6 mL de tampón de aislamiento a la columna y lave las células etiquetadas magnéticamente en un tubo estéril para recogida empujando el émbolo. Centrifugar las células a rcf 400 5-10 min a 4 oC. Wash la columna dos veces con 3 mL de tampón de aislamiento.</li>
		<li>Resuspenda las células en 1 x 107 células/100 μL aislamiento buffer y tinción con los anticuerpos conjugados fluoróforo siguientes: 0,1 μg CD115, 0.25 μg MHCII y 0.1 μg Ly-6C/1 x 106 células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ordenar celdas por compuerta en el lado pequeño scatter (SSC) y células pequeñas forward scatter (FSC). Nota: Monocitos inflamatorios ratón se definen generalmente como CD115+/MHCIIlo/neg/Ly6CHolay patrullaje monocitos se definen como CD115+/MHCII de /Ly6Clo/negneg 4,5. En casos donde no hay separación entre los dos subconjuntos es necesario, total SSClo/FCSlo/CD115+/MHCIIlo las células se pueden clasificar. Ingenuo y ratones con tumores contienen aproximadamente 5-8 x 104 MoDC por 1 mL de sangre y hasta 4-5 x 105 MoDC siguiente inyección de GM-CSF. De ellos, aproximadamente el 70% son monocitos inflamatorios y patrullando 30% monocitos.</li>
	<li>La placa de las células a una concentración de 1 x 106 células/mL en un medio completo suplementado con GM-CSF de 20 ng/mL. Después de 1 día, transferir las células no adherentes y adherentes libremente a una placa nueva y la cultura para 4-5 días adicionales. PRECAUCIÓN: Los medios de DC no deben suplementarse con piruvato.</li>
</ol>3. preparación de complejos inmunes de IgG de Tumor
<ol><li>Células tumorales de la cultura en frasco de cultura2 de 75 cm a la confluencia de 70% en medios DMEM completo.<ol>
<li>Añadir 2 mL de 0.25% tripsina/EDTA para separar las células de la cultura frasco y monitor de morfología de la célula bajo un microscopio de luz para evitar el exceso de la tripsinización.</li>
		<li>Añada 8 mL de medio de cultivo completo (por cada 2 mL de tripsina) para inhibir la digestión de la tripsina y centrifugar a 4 oC, rcf 400 para 5-10 minutos para que sedimenten las células. Nota: Asegúrese de chequear las células tumorales para Mycoplasma utilizando un kit comercial de PCR. Ensayo de prueba para la presencia de bacterias gramnegativas y endotoxinas hongos con Lisado de amebocitos de Limulus (LAL)28). Suero debe ser filtrado a través de 0.22 μM y testado para el 9 virus del código de regulaciones federales. Además, pruebe los medios de cultivo y sueros que cae 100-200 μL en LB-agar o caldo y cultura por 2 días a 37 oC.</li>
		<li>Células de lavado otra vez restos de tripsina y suero por volver a los suspensión en 10 mL de PBS y centrifugar a 400 rcf durante 5-10 min aspiración el sobrenadante y repetición el lavado 2 veces más.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fijar las células en 1,8% tamponada con paraformaldehido por 10 min a temperatura ambiente.<ol>
<li>Lavar las células volver a los suspensión en 10 mL de PBS y centrifugar a 4 oC 400 rcf durante 5-10 min.</li>
		<li>Sobrenadantes de aspirado y repetición de lavado dos veces más. Opcional: Para ensayos de captación del tumor, las células pueden ser etiquetadas por incubar 5 min a 37 oC en PBS con un éster de succinimidyl carboxyfluorescein de 1 μM (CFSE). CFSE se apaga entonces con medios completo para 10 min en hielo. Las células deben lavarse exhaustivamente en PBS con un 2% de suero para eliminar tinte residual.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspenda las células en tampón FACS (PBS complementado con 2% FCS + 5 mM EDTA) y 0,5 μg/mL de anti-CD16/32 para bloquear posibles interacciones de proteínas no específicas. Placa en una forma de U 96 pozos/de la placa en una concentración de 1 x 105 células por μL 100.<ol>
<li>Añadir diferentes diluciones de anticuerpos de unión a tumor que van desde 5 μg - 5 ng/1 x 105 células. Incubar la placa de hielo durante 15-20 min. Nota: IgG anticuerpos fueron aislados del suero de ratones hembra de 20-24 semanas de ingenuo en columnas de proteína A, como describe24.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavar las células añadiendo 150 μL de PBS y centrifugar la placa a 4 oC 400 rcf durante 5-10 minutos.<ol>
<li>Deseche el sobrenadante y repetir el lavado dos veces. Resuspenda las células en 100 tampón FACS de μL que contiene anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo. Incube la placa en el hielo por 20 min.</li>
		<li>Lavar las células mediante la adición de 200 μL de tampón FACS y centrifugar la placa a 400 rcf durante 5-10 minutos descartar los sobrenadantes y repetir el lavado.</li>
		<li>Analizar el enlace del tumor mediante citometría de flujo y determinar la concentración mínima necesaria para las células de la capa. Nota: Los anticuerpos que no aumenten intensidad de fluorescencia media (IFM) de células del tumor manchadas por al menos cinco veces por el control de isotipo no deben utilizarse en posteriores ensayos funcionales.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. activación de MoDC con IC Tumor-IgG
<ol><li>Capa de las células del tumor con la concentración mínima de IgG, como se describe en las secciones 3.1 a 3.4.3<ol>
<li>Un día antes de activar MoDC con tumor IC, reemplazar MoDC cultura media, que contiene el GM-CSF. Para ello, suavemente los medios de comunicación de aspirar y lavar las células una vez con medios de cultivo completo precalentado. Nota: Se debe cultivar aislado MoDC madura asociada a tumor de por lo menos 2-3 h (o incluso durante la noche) después de su clasificación en medios completo sin GM-CSF y antes de activar con el IC.</li>
		<li>Para el análisis de la captación del tumor, agregar en una proporción de 1:5 (IC:MoDC) el tumor marcado con CFSE IC a MoDC e incubar durante una noche para 12-16 h en 1 mL de medio completo por 1 x 106 DC.</li>
		<li>Para análisis FACS de experimentos de activación de MoDC, agregar IC tumor en proporción 1:1 (IC:MoDC) e incube durante la noche por 12-16 h. Nota: Se recomienda incluir un control positivo, en que MoDC son estimulados con 1 μg/mL de LPS o de otros agonistas TLR.</li>
		<li>Tras la activación, aspirar el sobrenadante y lave las células suavemente tres veces con tampón de aislamiento, o de 10 mM EDTA HBSS.</li>
		<li>Para desconectar el DC de la placa, incubar células de 2-3 minutos en 1 mL HBSS conteniendo 10 mM EDTA y separar las células mediante pipeteo vigoroso.</li>
		<li>Centrifugar las células a rcf 400 y resuspender 1 x 106 DC en 90 de μL de PBS suplementado con 2% FCS, 5 mM EDTA (tampón FACS) y 0,5 μg de bloqueo de los anticuerpos. Incubar en hielo durante 5-10 minutos.</li>
		<li>Añadir 10 μL de la mezcla de anticuerpos a las células de coloración e incubar en hielo por 15 min.</li>
		<li>Añadir FACS de 2 mL de tampón a las células y centrifugar a 4 oC 400 rcf durante 5-10 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspenda las células en solución tampón FACS de 200 μL.<ol>
<li>Agregar 0.5 - 1 μg/mL de DAPI 1-2 min antes de correr las muestras, para excluir las células muertas del análisis. No sobre-incubar DAPI, como MoDC se llevará dentro de 10-15 minutos.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Steinman, R. M., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+dendritic+cells+into+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Taking dendritic cells into medicine.</a> Nature. 449 (7161), 419-426 (2007).</li>
<li>Palucka, K., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic-cell-based+therapeutic+cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines.</a> Immunity. 39 (1), 38-48 (2013).</li>
<li>Mildner, A., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+function+of+dendritic+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Development and function of dendritic cell subsets.</a> Immunity. 40 (5), 642-656 (2014).</li>
<li>Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dendritic+cell+lineage%3A+ontogeny+and+function+of+dendritic+cells+and+their+subsets+in+the+steady+state+and+the+inflamed+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting.</a> Annual review of immunology. 31, 563-604 (2013).</li>
<li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells%2C+monocytes+and+macrophages%3A+a+unified+nomenclature+based+on+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny.</a> Nature reviews. Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).</li>
<li>Spitzer, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Immunity+Is+Required+for+Effective+Cancer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systemic Immunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy.</a> Cell. 168 (3), 487-502 (2017).</li>
<li>Guilliams, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unsupervised+High-Dimensional+Analysis+Aligns+Dendritic+Cells+across+Tissues+and+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Unsupervised High-Dimensional Analysis Aligns Dendritic Cells across Tissues and Species.</a> Immunity. 45 (3), 669-684 (2016).</li>
<li>Anguille, S., Smits, E. L., Lion, E., van Tendeloo, V. F., Berneman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+use+of+dendritic+cells+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinical use of dendritic cells for cancer therapy.</a> Lancet Oncol. 15 (7), e257-e267 (2014).</li>
<li>Wimmers, F., Schreibelt, G., Skold, A. E., Figdor, C. G., De Vries, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradigm+Shift+in+Dendritic+Cell-Based+Immunotherapy%3A+From+in+vitro+Generated+Monocyte-Derived+DCs+to+Naturally+Circulating+DC+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Paradigm Shift in Dendritic Cell-Based Immunotherapy: From in vitro Generated Monocyte-Derived DCs to Naturally Circulating DC Subsets.</a> Front Immunol. 5, 165(2014).</li>
<li>Banchereau, J., Palucka, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+as+therapeutic+vaccines+against+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer.</a> Nature reviews. Immunology. 5 (4), 296-306 (2005).</li>
<li>Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation of dendritic cells.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 3 Unit 3 7 (2001).</li>
<li>Greter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+controls+nonlymphoid+tissue+dendritic+cell+homeostasis+but+is+dispensable+for+the+differentiation+of+inflammatory+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">GM-CSF controls nonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for the differentiation of inflammatory dendritic cells.</a> Immunity. 36 (6), 1031-1046 (2012).</li>
<li>Vremec, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor+on+dendritic+cell+levels+in+mouse+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The influence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell levels in mouse lymphoid organs.</a> Eur J Immunol. 27 (1), 40-44 (1997).</li>
<li>Helft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+Mouse+Bone+Marrow+Cultures+Comprise+a+Heterogeneous+Population+of+CD11c%28%2B%29MHCII%28%2B%29+Macrophages+and+Dendritic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells.</a> Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).</li>
<li>Dong, M. B., Rahman, M. J., Tarbell, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+gating+for+spleen+monocyte+and+DC+subsets%3A+differences+in+autoimmune+NOD+mice+and+with+acute+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric gating for spleen monocyte and DC subsets: differences in autoimmune NOD mice and with acute inflammation.</a> J Immunol Methods. 432, 4-12 (2016).</li>
<li>Drutman, S. B., Kendall, J. C., Trombetta, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+spleen+monocytes+can+upregulate+CD11c+expression+without+converting+into+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory spleen monocytes can upregulate CD11c expression without converting into dendritic cells.</a> J Immunol. 188 (8), 3603-3610 (2012).</li>
<li>Hanada, K., Tsunoda, R., Hamada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF-induced+in+vivo+expansion+of+splenic+dendritic+cells+and+their+strong+costimulation+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">GM-CSF-induced in vivo expansion of splenic dendritic cells and their strong costimulation activity.</a> J Leukoc Biol. 60 (2), 181-190 (1996).</li>
<li>Gilboa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DC-based+cancer+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">DC-based cancer vaccines.</a> J Clin Invest. 117 (5), 1195-1203 (2007).</li>
<li>Melief, C. J., van der Burg, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotherapy+of+established+%28pre%29malignant+disease+by+synthetic+long+peptide+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines.</a> Nat Rev Cancer. 8 (5), 351-360 (2008).</li>
<li>Palucka, K., Banchereau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunotherapy+via+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer immunotherapy via dendritic cells.</a> Nat Rev Cancer. 12 (4), 265-277 (2012).</li>
<li>Bol, K. F., Schreibelt, G., Gerritsen, W. R., de Vries, I. J., Figdor, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Cell-Based+Immunotherapy%3A+State+of+the+Art+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Dendritic Cell-Based Immunotherapy: State of the Art and Beyond.</a> Clin Cancer Res. 22 (8), 1897-1906 (2016).</li>
<li>Rafiq, K., Bergtold, A., Clynes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+complex-mediated+antigen+presentation+induces+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Immune complex-mediated antigen presentation induces tumor immunity.</a> J Clin Invest. 110 (1), 71-79 (2002).</li>
<li>Schuurhuis, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+complex-loaded+dendritic+cells+are+superior+to+soluble+immune+complexes+as+antitumor+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune complex-loaded dendritic cells are superior to soluble immune complexes as antitumor vaccine.</a> J Immunol. 176 (8), 4573-4580 (2006).</li>
<li>Carmi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+IgG+combined+with+dendritic+cell+stimuli+induce+antitumour+T-cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Allogeneic IgG combined with dendritic cell stimuli induce antitumour T-cell immunity.</a> Nature. 521 (7550), 99-104 (2015).</li>
<li>Carmi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+and+SHP-1+are+DC-intrinsic+checkpoints+for+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Akt and SHP-1 are DC-intrinsic checkpoints for tumor immunity.</a> JCI Insight. 1 (18), e89020(2016).</li>
<li>Kenkel, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Immunosuppressive+Dendritic+Cell+Subset+Accumulates+at+Secondary+Sites+and+Promotes+Metastasis+in+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An Immunosuppressive Dendritic Cell Subset Accumulates at Secondary Sites and Promotes Metastasis in Pancreatic Cancer.</a> Cancer Res. 77 (15), 4158-4170 (2017).</li>
<li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+Activation+of+CD103%28%2B%29+Dendritic+Cell+Progenitors+at+the+Tumor+Site+Enhances+Tumor+Responses+to+Therapeutic+PD-L1+and+BRAF+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition.</a> Immunity. 44 (4), 924-938 (2016).</li>
<li>Roslansky, P. F., Novitsky, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+Limulus+amebocyte+lysate+%28LAL%29+to+LAL-reactive+glucans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of Limulus amebocyte lysate (LAL) to LAL-reactive glucans.</a> J Clin Microbiol. 29 (11), 2477-2483 (1991).</li>
<li>Jahr, H., Pfeiffer, G., Hering, B. J., Federlin, K., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endotoxin-mediated+activation+of+cytokine+production+in+human+PBMCs+by+collagenase+and+Ficoll%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll.</a> J Mol Med (Berl). 77 (1), 118-120 (1999).</li>
<li>Zhang, X., Morrison, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+selective+priming+effects+on+tumor+necrosis+factor+alpha+and+nitric+oxide+production+in+mouse+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced selective priming effects on tumor necrosis factor alpha and nitric oxide production in mouse peritoneal macrophages.</a> J Exp Med. 177 (2), 511-516 (1993).</li>
<li>Hirohashi, N., Morrison, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+lipopolysaccharide+%28LPS%29+pretreatment+of+mouse+macrophages+modulates+LPS-dependent+interleukin-6+production+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Low-dose lipopolysaccharide (LPS) pretreatment of mouse macrophages modulates LPS-dependent interleukin-6 production in vitro.</a> Infect Immun. 64 (3), 1011-1015 (1996).</li>
<li>Deng, H., Maitra, U., Morris, M., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+responsible+for+the+priming+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism responsible for the priming of macrophage activation.</a> J Biol Chem. 288 (6), 3897-3906 (2013).</li>
<li>Cella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inhibitory+receptor+%28ILT3%29+expressed+on+monocytes%2C+macrophages%2C+and+dendritic+cells+involved+in+antigen+processing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A novel inhibitory receptor (ILT3) expressed on monocytes, macrophages, and dendritic cells involved in antigen processing.</a> J Exp Med. 185 (10), 1743-1751 (1997).</li>
<li>Kramer, P. R., Winger, V., Reuben, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+limits+TNF-alpha+production+in+CD16-activated+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">PI3K limits TNF-alpha production in CD16-activated monocytes.</a> Eur J Immunol. 39 (2), 561-570 (2009).</li>
<li>Rose, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc+gamma+receptor+cross-linking+activates+p42%2C+p38%2C+and+JNK%2FSAPK+mitogen-activated+protein+kinases+in+murine+macrophages%3A+role+for+p42MAPK+in+Fc+gamma+receptor-stimulated+TNF-alpha+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fc gamma receptor cross-linking activates p42, p38, and JNK/SAPK mitogen-activated protein kinases in murine macrophages: role for p42MAPK in Fc gamma receptor-stimulated TNF-alpha synthesis.</a> J Immunol. 158 (7), 3433-3438 (1997).</li>
<li>Rezzonico, R., Imbert, V., Chicheportiche, R., Dayer, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation+of+CD11b+and+CD11c+beta%282%29+integrins+by+antibodies+or+soluble+CD23+induces+macrophage+inflammatory+protein+1alpha+%28MIP-1alpha%29+and+MIP-1beta+production+in+primary+human+monocytes+through+a+pathway+dependent+on+nuclear+factor-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ligation of CD11b and CD11c beta(2) integrins by antibodies or soluble CD23 induces macrophage inflammatory protein 1alpha (MIP-1alpha) and MIP-1beta production in primary human monocytes through a pathway dependent on nuclear factor-kappaB.</a> Blood. 97 (10), 2932-2940 (2001).</li>
</ol>

Todos los autores declaran no tienen ningún conflicto de interés y que no tienen nada que revelar.

Dada la gran cantidad de CC necesario para la vacunación de ratones (aproximadamente 2-4 x 106 DC por un ratón), la mayoría de la vacunación en ratones las estrategias se basan en aislamiento del DC de BM y bazo, seguido por su activación ex vivo . Sin embargo, intenta activar tumor DC en vivo, usando las mismas condiciones para activar bazo y BM DC, a menudo han tenido éxito en producir inmunidad efectiva. En dos publicaciones posteriores, Carmi et al. han encontrado que sangre y tu...

Desde su descubrimiento, las células dendríticas (DC) han sido un foco de investigación debido a su capacidad única para sesgar la diferenciación de células T1. En las últimas décadas, un esfuerzo de investigación ha tratado de definir los distintos subconjuntos de DC y su función durante la progresión del tumor y de la inmunidad 2. DCs se componen de poblaciones celulares heterogéneas que difieren entre sí en sus receptores de reconocimiento de patrones, distribución en los tejidos, y migratorias y antígeno presentación capacidades3,4,5. En comparación con otros subconjuntos de DC, DC derivados de monocitos (MoDC) son mucho más abundante en los tumores y se pueden generar fácilmente de circulación o infiltrantes de tumor monocitos6,7. Por lo tanto, muchos ensayos clínicos que buscan tomar ventaja de su prevalencia relativa se basan en la manipulación in vivo y ex vivo de MoDC autólogo para provocar inmunidad de células T 8,9.
Del mismo modo, vacunación basada en DC de modelos de tumores experimentales requiere inyecciones seriales 2-3, 5-7 días separados, de 1-2 x 106 activado DC pulsada con antígenos tumorales. Por lo tanto, para lograr este gran número de DC, más estudios con ratones han utiliza principalmente MoDC cultivada a partir de precursores de médula ósea (MO) en GM-CSF para 7-9 días (IL-4 no es necesario en la configuración del ratón)10,11. Sin embargo, nocaut de GM-CSF tienen ratones en general normal DC compartimiento 12,13y las poblaciones mixtas de esa cultura,14 la relevancia fisiológica de estos DC ha sido cuestionado.
Alternativamente, DC puede ser sistemáticamente aislada de células de bazo. Sin embargo, DC componen solamente cerca de 0.3-0.8% de células de bazo total (dando por resultado aproximadamente 7 x 105 DC esplénica) y de estas células, solamente CD103+ DC y MoDC pueden migrar hacia los órganos linfoides. Desde MoDCs comprenden aproximadamente el 10-15% de esplénico DC las poblaciones15,16, más protocolos de aislamiento producen aproximadamente 1 x 105 MoDC por bazo. Expansión de MoDC puede lograrse mediante la inyección de células B16 transfected que segregan GM-CSF, resultando en un 100-fold incremento en esplénica MoDC17. Sin embargo, el uso de MoDC para desarrollo de vacunas de la CC es limitado ya que este procedimiento no se puede hacer en los seres humanos y los obtenidos MoDC son ya altamente activa.
Además de obtener un número adecuado de DC, otro desafío para el desarrollo de vacunas efectivas de DC contra las células cancerosas autólogo consiste en la falta de suficientes señales de peligro en el entorno del tumor para activar completamente el DC. Inducción de señales coestimuladoras se logra a través de la activación de receptores de reconocimiento de patrones (PRR), o lectinas tipo c señalización vías18,19,20,21. Otro acercamiento para activar CC explota su capacidad para tomar los antígenos a través de interacciones con receptores Fcγ de la superficie (FcγR). De hecho, un número de manuscritos importantes han demostrado que inyección de MoDC de precursores BM activadas con tumor-IgG IC puede prevenir el crecimiento del tumor en configuración profiláctico y puede conducir a la erradicación de tumores establecidos22,23 .
En dos trabajos recientes, Carmi et al descubrieron que en contraste con BMDC y bazo DC, MoDC de la sangre y los tumores no puede responder a IC IgG sin estímulos adicionales. Esto fue encontrada para ser debido a la presencia de altos niveles intracelulares de tirosina fosfatasas regulación FcγR señalización24,25. Definiendo un punto de control crítico en DC, este trabajo proporciona una penetración importante en los requisitos de vacunación exitosa basada en DC. La necesidad de estímulos adicionales permitir FcγR señales y señalización de otros receptores de lectina utilizando una cascada de fosforilación similares, probablemente así subraya la necesidad de evitar el oscurecimiento de la C.C. durante su aislamiento.
Por lo tanto, el presente Protocolo describe el aislamiento de MoDC de sangre y tumores, que difieren marcadamente de BM y bazo DC, y destaca las precauciones dignas de consideración durante el proceso.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque PREMIUM</td><td>GE-Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep</td><td>StemCell Technologies</td><td>07820</td><td></td></tr><tr><td>CD45 MicroBeads</td><td>Miltenyi</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Kit de aislamiento de monocitos</td><td>StemCell Technologies</td><td>19861</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa IV</td><td>Sigma</td><td>C9697-50MG</td><td>Pruebe cada lote en busca de endotoxinas</td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Sigma</td><td>DN25-10MG</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher</td><td>16140071</td><td>Analice cada lote en busca de endotoxinas</td></tr><tr><td>PE-CD11c</td><td>Biolegend</td><td>117307</td><td></td></tr><tr><td>APC-CD11b</td><td>Biolegend</td><td>101211</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 650 MHCII</td><td>Biolegend</td><td>107641</td><td></td></tr><tr><td>AF48- CD86</td><td>Biolegend</td><td>105017</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7-Ly-C6</td><td>Biolegend</td><td>108423</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7-CD15</td><td>Biolegend</td><td>135523</td><td></td></tr></tbody></table>

protocolo de aislamiento de células dendríticas derivadas de monocitos de ratón y su activación posterior in vitro con complejos inmunes tumor

Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes

Células dendríticas (DC) son poblaciones celulares heterogéneas que difieren en sus marcadores de membrana de la célula, patrones de migración y distribución y en su presentación del antígeno y la capacidad de activación de la célula de T. Puesto que las vacunas la mayoría de modelos de tumores experimentales requieren millones de DC, son ampliamente aislados de la médula ósea o bazo. Sin embargo, estos DC significativamente diferentes de la sangre y tumor DC en sus respuestas a complejos inmunes (CI) y presumiblemente a otros receptores de lectina acoplados a Syk. Importante, dada la sensibilidad de la C.C. a moléculas asociadas de peligro, la presencia de endotoxinas o anticuerpos receptores de activación de la reticulación en uno de los aislantes que podría dar lugar en el oscurecimiento de la C.C. y así afectan los parámetros, o por lo menos el dosis, necesaria para activarlos. Por lo tanto, aquí se describe un protocolo detallado para aislar MoDC de sangre y los tumores mientras que evita su activación prematura. Además, un protocolo de activación de MoDC con tumor IC, y sus posterior análisis.

Inicialmente se comparó la capacidad de los anticuerpos de ratones syngeneic y allogeneic ingenuo para atar a las células del tumor. Para ello, B16F10 y LMP líneas de células tumorales fueron fijadas en paraformaldehido y lavadas ampliamente. B16F10 es una línea celular de melanoma, que fue originalmente aislada de las metástasis del pulmón en ratones C57Bl/6. LMP es una célula de tumor pancreático que fue aislada de KrasG12D / + ratones LSL-Trp53R172H / + y Pdx-1-Cre y crece constantemen...

Derivados de monocitos DC (MoDC) puede detectar pequeñas cantidades de moléculas asociadas de peligro y por lo tanto son fácilmente preparada. Proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento de MoDC de sangre y los tumores y su activación con complejos inmunes mientras destacando medidas claves que deben considerarse para evitar su activación prematura.

Protocolo de aislamiento de células dendríticas derivadas de monocitos de ratón y su activación posterior In Vitro con complejos inmunes Tumor

Dendritic cells (DC) are heterogeneous cell populations that differ in their cell membrane markers, migration patterns and distribution, and in their ...

Este método está diseñado para ayudar a los científicos a aislar las CD derivadas de monocitos de la sangre y los tumores de ratones portadores de tumores con el fin de estudiar sus propiedades inmunoestimulantes. Creo que la principal ventaja de este procedimiento en comparación con otros métodos es que las CD derivadas de monocitos obtenidas reflejan mejor su estado de activación en el tumor y en la sangre. Probablemente lo más difícil sea asegurarse de que todos sus reactivos y herramientas sean estériles y que no introduzca contaminación durante este procedimiento.Llevo más de 15 años aislando células mieloides y células dendríticas de tumores, y tuve la idea de este método cuando me di cuenta de que los diferentes protocolos de aislamiento daban lugar a diferentes patrones de activación celular. La Sra. Santana-Magal, que es una estudiante de posgrado en mi laboratorio, demostrará el procedimiento.Después de sacrificar a los ratones usando dióxido de carbono dentro de una campana de flujo laminar, extraiga los tumores y colóquelos en medio RPMI sin suero fetal bovino. Luego, use unas tijeras quirúrgicas para cortar el tumor en pedazos pequeños. Transfiera todas las piezas tumorales de un solo ratón a un tubo de fondo plano de 30 mililitros que contenga tampón HBSS suplementado con colagenasa IV y DNasa I junto con las barras de agitación magnéticas.Incubar el tubo con los trozos tumorales en un agitador a 37 grados centígrados con un agitador magnético en su interior a 200 a 400 revoluciones por minuto durante 20 a 30 minutos. A continuación, filtre las células a través de un colador de células de 70 micrómetros. Luego, centrifuga las células a 400 veces g durante cinco a 10 minutos a cuatro grados centígrados.Después de la centrifugación, agregue 1,5 mililitros de solución madre de medio de gradiente de densidad a 8,5 mililitros de HBSS. A continuación, mezcle vigorosamente el medio de gradiente de densidad. A continuación, pipetee la mezcla en el pellet.Centrifugar la suspensión celular a 400 veces g durante 20 minutos a temperatura ambiente. Decantar el sobrenadante una vez finalizada la centrifugación. Después de lavar las celdas peletizadas dos veces, vuelva a suspender en un mililitro de tampón de aislamiento.Agregue la suspensión celular a 30 microlitros de perlas magnéticas conjugadas CD11b. A continuación, incuba la mezcla a cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón de aislamiento.Aplique la suspensión de celdas sobre una columna magnética prelavada. A continuación, utilice tres mililitros de tampón de aislamiento para lavar la columna dos veces. A continuación, retire la columna del imán.A continuación, agregue seis mililitros de tampón de aislamiento en la columna. Empuje con un émbolo para enjuagar las células marcadas magnéticamente en un tubo de recolección estéril. Una vez más, centrifugar las células a 400 veces g durante cinco a 10 minutos a cuatro grados centígrados.Después de resuspender y teñir las células, clasifique las células por la compuerta de las células pequeñas, utilizando el lado pequeño y la dispersión hacia adelante pequeña. Después de sacrificar al ratón, rocíe etanol al 70% sobre él. Luego, use tijeras quirúrgicas para quitar la piel que cubre el corazón debajo del capuchón laminar.A continuación, limpie las tijeras con etanol. Lave la cavidad con EDTA HBSS de 20 milimolares y use las tijeras para cortar la aurícula derecha del corazón. Luego, use una jeringa de 10 mililitros con una aguja de calibre 25 para enjuagar lentamente el ventrículo derecho del corazón con EDTA HBSS de 20 milimolares.Luego, use una jeringa estéril para extraer sangre de la cavidad pleural. Transfiera la sangre en un tubo que contiene heparán sulfato y EDTA. A continuación, pipetee la sangre en el medio de gradiente de densidad.Centrifugar las células sanguíneas a 400 veces g durante 15 minutos a temperatura ambiente con freno bajo. Después de la centrifugación, recoja las células mononucleares en un tubo. Disuelva las células en 10 mililitros de tampón de aislamiento para lavar las células.Nuevamente, centrifuga las células a 400 veces g durante cinco a 10 minutos a cuatro grados centígrados. Para seleccionar las células CD11b, vuelva a suspender el pellet de la célula en un mililitro de tampón de aislamiento. Incubar durante 15 minutos con 50 microlitros de perlas magnéticas conjugadas CD11b a cuatro grados centígrados.Vuelva a centrifugar a 400 veces g durante cinco a 10 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, retira el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de tampón de aislamiento.A continuación, aplique la suspensión de celdas sobre una columna magnética prelavada. Lave la columna con el tampón de aislamiento dos veces. Retire la columna del imán y agregue seis mililitros de tampón de aislamiento en la columna.A continuación, enjuague las células marcadas magnéticamente en un tubo de recolección estéril empujando el émbolo. Centrifugar las células a 400 veces g durante cinco a 10 minutos a cuatro grados centígrados. Resuspender las células en tampón de aislamiento y teñir con anticuerpos conjugados con fluoróforos.Ordene las celdas por compuerta las celdas pequeñas usando el lado pequeño y la dispersión hacia adelante pequeña. Primero, fije las celdas en paraformaldehído tamponado al 1,8% durante 10 minutos a temperatura ambiente. Siembre la suspensión celular en cada pocillo de una placa de 96 pocillos en forma de U.A continuación, agregue diluciones variables de anticuerpos que se unen al tumor en cada pocillo. A continuación, incube las células en hielo durante 15 a 20 minutos. Después de la incubación, lavar las células con 150 microlitros de solución salina tamponada con fosfato.Luego, centrifugar a 400 veces g durante cinco a 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, expulse el sobrenadante y lave las células dos veces. Disolver las células en 100 microlitros de tampón FACS que contiene un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos.A continuación, incube la placa en hielo durante 15 a 20 minutos. Después de 15 a 20 minutos, agregue 200 microlitros de tampón FACS para lavar las células. Centrifugar la placa a 400 veces g durante cinco a 10 minutos.Decantar el sobrenadante. Realizar citometría de flujo para analizar la unión del tumor y determinar la concentración mínima de inmunoglobulina G necesaria para recubrir las células. Una vez que las células estén recubiertas con una concentración mínima de inmunoglobulina G, agregue el complejo inmune tumoral marcado con CFSE a las células dendríticas derivadas de monocitos en una proporción de uno a cinco.Luego, incube la mezcla durante 12 a 16 horas durante la noche en medio completo. Realizar análisis FACS de la activación de las células dendríticas derivadas de monocitos. La intensidad media de fluorescencia se calcula siguiendo un análisis de citometría de flujo para estudiar la presencia de anticuerpos IgG y M que se unen ex vivo a las células tumorales LMP.Los resultados muestran que los anticuerpos IgG de los ratones alogénicos C57-Black/6 se unen a las células tumorales mucho más fuertes que los anticuerpos de los ratones singénicos 129S1. A continuación, se calcula la intensidad de fluorescencia media de la capacidad de unión de las células tumorales B16F10 con la IgG. La IgG obtenida de ratones alogénicos 129S1 muestra una intensidad de tinción 10 veces mayor con el tumor B16F10 en comparación con la IgG singénica de ratones C57-Black/6.A continuación, se capturan imágenes microscópicas DIC para mostrar las células dendríticas derivadas de monocitos asociadas al tumor de los tumores B16F10. Aquí, se capturan imágenes DIC para mostrar las células dendríticas derivadas de monocitos inflamatorias y patrullas aisladas de la sangre de ratones portadores de tumores B16F10. El análisis de citometría de flujo también se realiza para comparar los patrones de activación de las células dendríticas derivadas de monocitos del bazo y la médula ósea con los del tumor y la sangre en la incubación con el complejo inmune.El resultado muestra un aumento de la expresión de CD86 y MHC II por parte de la médula ósea y las células dendríticas esplénicas con los complejos inmunes. Luego, se realiza la inmunohistoquímica confocal, que muestra la absorción tumoral y la expresión de MHC II cuando las células dendríticas se incuban con el complejo inmunitario tumoral marcado con CFSE. Una vez dominado, este procedimiento se puede realizar en unas pocas horas, dependiendo de la cantidad de ratones que esté utilizando.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe mantener todos sus reactivos y herramientas estériles en todo momento. El pelaje del ratón es una fuente importante de contaminación. Asegúrate de que ninguno de los pelos toque tus tejidos.Esperamos que después de ver este vídeo, comprenda bien cómo aislar las CD derivadas de monocitos de la sangre y los tumores de ratón y cómo activarlas posteriormente con células del complejo inmunitario evitando su activación prematura.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Este procedimiento describe la detección y aislamiento de los leucocitos de ratón TH17 que secretan activamente IL-17 a la estimulación.

Detección y aislamiento de células viables Ratón T IL-17 Secretoras

Una preparación altamente purificada de células dendríticas del pulmón del ratón se describe. Especial énfasis se da al aislamiento de subgrupo de células dendríticas convencionales.

Aislamiento de células dendríticas del pulmón de ratón

En este reporte se describe un protocolo para el aislamiento de las poblaciones altamente purificadas de leucocitos que se infiltran en los tumores. Este protocolo es una adaptación del protocolo de Miltenyi Biotech para mejorar el rendimiento y la pureza para el aislamiento de las células del tejido tumoral compleja.

El aislamiento de las células inmunes de tumores primarios

Este video muestra un protocolo para evaluar la activación de células dendríticas utilizando células tumorales recubiertas de inmunoglobulina G (IgG). Las células dendríticas internalizan las células tumorales recubiertas de IgG, procesan los antígenos tumorales y los presentan en la superficie a través de moléculas MHC-II, junto con la coexpresión de la molécula coestimuladora CD86. A continuación, estas células dendríticas se someten a inmunotinción dirigida a MHC-II y CD86 y a un análisis de...

Análisis basado en citometría de flujo de la activación de células dendríticas mediante complejos inmunitarios

Existen distintos subconjuntos de células dendríticas como poblaciones raras en los órganos linfoides y, por lo tanto, son difíciles de aislar en número y pureza suficientes para los experimentos inmunológicos. Aquí describimos un método de alta eficiencia y alto rendimiento para el aislamiento de todos los principales subconjuntos actualmente conocidos de células dendríticas esplénicas de ratón.

Un método de rendimiento eficiente y de alta para el aislamiento de ratón subconjuntos de células dendríticas

Los linfocitos son los principales actores en las respuestas inmunitarias adaptativas. En este trabajo se presenta un protocolo de purificación de linfocitos para determinar las funciones fisiológicas de las moléculas deseadas en la activación de linfocitos in vitro e in vivo. Los procedimientos experimentales descritos son adecuados para comparar las capacidades funcionales entre linfocitos control y modificados genéticamente.

Aislamiento y activación de los linfocitos murinos

Aquí, presentamos un protocolo para la determinación de en vivo de la activación de las células (células T) CD4 T ingenua, proliferación y diferenciación de Th1 inducida por el GM-CSF de la médula (BM)-derivado de las células dendríticas (DCs). Además, este protocolo describe aislamiento del BM y del T-cell, la generación de C.C. y transferencia adoptiva de DC y del T-cell.

Un modelo de ratón In Vivo a medida ingenuo CD4 células T activación, proliferación y diferenciación de Th1 inducida por las células dendríticas derivadas de la médula ósea

El dispositivo o placa de transimmunización (TI) y los protocolos relacionados se han desarrollado para replicar las características clave de la fotoquimioterapia extracorpórea (ECP), en un entorno experimental, lo que permite la producción de células (DCs) para la inmunoterapia oncológica.

Nuevo protocolo para la generación de células dendríticas inmunogénicas fisiológicas

Aquí, presentamos un método económico y eficiente para aislar y generar células dendríticas derivadas de la médula ósea de alta pureza a partir de ratones después de 7 días de cultivo con 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.

Protocolo económico y eficiente para aislar y cultivar células dendríticas derivadas de la médula ósea de ratones

Describimos un procedimiento para evaluar la capacidad de los agentes farmacológicos para generar células dendríticas tolerogénicas a partir de células dendríticas derivadas de monocitos naïve in vitro y validar su potencia mediante la generación de células T reguladoras autólogas.

Un método simple y eficiente para probar agentes inmunomoduladores para la generación de células dendríticas tolerogénicas a partir de monocitos CD14+ humanos

Aprende a aislar células dendríticas derivadas de monocitos de sangre y tumores de ratón para estudiar sus propiedades inmunostimuladoras. Este protocolo mantiene la esterilidad para evitar activación prematura y obtener resultados fiables.

Protocolo de aislamiento de células dendríticas derivadas de monocitos de ratón y su activación posterior In Vitro con complejos inmunes Tumor (Video) | JoVE Journal

Protocolo de aislamiento de células dendríticas derivadas de monocitos de ratón y su activación posterior In Vitro con complejos inmunes Tumor

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