Dos fotones Intravital proyección de imagen de leucocitos durante la respuesta inmunitaria en hígado de ratón tratados con lipopolisacárido

El objetivo general de este procedimiento es observar la morfología y funcionalidad de los leucocitos dentro del hígado durante el shock séptico. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden obtener vídeos directos de los leucocitos dentro del hígado. Antes de la cirugía, use etanol al 70% para desinfectar la mesa de cirugía y todos los instrumentos.

A continuación, configure las herramientas para la cirugía hepática y ajuste la placa calefactora a 37 grados centígrados. Después de anestesiar a los ratones inyectados con LPS o PBS de acuerdo con el protocolo de texto, aplique una pequeña cantidad de ungüento para los ojos para evitar que la retina se seque. Use una maquinilla de afeitar y una crema depilatoria para eliminar el vello alrededor del abdomen.

Luego use una gasa húmeda para limpiar el abdomen. Mientras realiza una inyección retroorbital con una jeringa de insulina, inyecte 200 microlitros de solución de dextrano rojo de Texas. Use un marcador para marcar el área subcostal derecha desde la apófisis xifoidea hasta el final de la costilla.

A continuación, aplique povidona yodada en el abdomen del ratón para prevenir una infección secundaria. Use fórceps y tijeras para cortar la epidermis. A continuación, con microtijeras y pinzas, abra la cavidad abdominal y exponga cuidadosamente el hígado.

Use hisopos de algodón para extender el lóbulo lateral izquierdo. A continuación, vierta 500 microlitros de PBS estéril en la cavidad abdominal para evitar que el hígado se seque. Coloque el ratón en la posición correcta de decúbito en una cámara diseñada a medida y aplique una pequeña cantidad de pegamento tisular al lecho de silicona.

Luego, use hisopos de algodón para unir cuidadosamente el hígado. El tejido hepático es extremadamente friable. Nunca use herramientas afiladas o pesadas cuando exponga y sostenga el hígado.

Unos segundos después, vuelva a humedecer el hígado con 500 microlitros de PBS estéril para evitar que se seque. Luego coloque el marco de metal en el hígado y use tuercas para fijarlo firmemente. Coloque siempre tuercas de soporte antes de colocar el marco de metal.

Esto ayudará a reducir la presión del marco de metal. Para llevar a cabo imágenes intravitales del hígado, ejecute el software Zen para encender el láser. Establezca la longitud de onda en 880 nanómetros y configure los canales verde y rojo.

A continuación, ajuste la potencia del láser según la intensidad de la fluorescencia. Coloque la cámara en la platina de imagen y coloque la lente del objetivo de inmersión en agua de 20 potencias cerca de la cubierta. Fije el calentador de caucho de silicona debajo del cuerpo del mouse para mantener su temperatura corporal.

A continuación, extraiga 500 microlitros de agua destilada en el marco de metal. Y luego coloque la lente del objetivo cerca del hígado. Ajuste el enfoque y determine la profundidad y el tiempo del área de imagen.

Para la obtención de imágenes a largo plazo, inyecte media dosis de la mezcla anestésica Zoletil y Rompun preparada previamente por cada hora durante la obtención de imágenes por razones éticas. Mantenga la temperatura corporal a 37 grados centígrados y siempre esté atento al ratón, ya que los tiempos de anestesia difieren para cada ratón. Para analizar los datos, abra Velocity e importe los datos sin procesar de la biblioteca.

A continuación, elimine el ruido de la imagen y tome una instantánea. Finalmente, ajuste los elementos editados al 100% y exporte los archivos como archivos JPEG o TIF para imágenes instantáneas y archivos AVI para películas. El análisis de imágenes intravitales de ratones de control mostró que una pequeña cantidad de neutrófilos circulaban en el vaso sanguíneo.

Mientras que el número de neutrófilos aumentó significativamente en los ratones tratados con LPS. En la condición de LPS, una gran cantidad de neutrófilos circulaban dentro del torrente sanguíneo, pero no migraban fuera del vaso. Como se ve en estas películas, en comparación con los ratones de control, los neutrófilos en los ratones tratados con LPS estaban más firmemente adheridos a la superficie luminal del vaso, lo que hizo que los neutrófilos se detectaran con mayor frecuencia en el vaso.

Además de la motilidad de los neutrófilos, se observaron macrófagos capsulares hepáticos, o LCM, en ratones CX3CR1-GFP en la superficie del tejido hepático en lugar de en la profundidad del tejido. Además, los LCM mostraron poco movimiento o activación en el hígado, incluso en ratones tratados con LPS. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 30 minutos si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar establecer la línea de incisión desde el proceso xifoides hasta el final del abdomen subcostal derecho. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la inyección de tratamiento, para responder preguntas adicionales, como cómo se recupera el hígado del daño y la infección. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la medicina exploraran la reacción del leucocito durante la sepsis y probaran posibles medicamentos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo exponer un hígado con una incisión mínima en el abdomen. No olvide que trabajar con lipopolisacárido puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como la esterilización y el lavado de manos al realizar este procedimiento.