Un rápido plata tinción protocolo permite Simple y detección eficiente de marcadores SSR utilizando un Gel de poliacrilamida no desnaturalizantes

El objetivo general de este protocolo es introducir un método optimizado de tinción de plata para la detección rápida, fácil y de bajo costo de marcadores SSR en geles de poliacrilamida no desnaturalizantes. El genotipado rápido de marcadores SSR puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación y la aplicación genética, como el análisis de la diversidad genética y la selección asistida por marcadores en programas de mejoramiento molecular. Las principales ventajas de esta técnica es que es fácil de llevar a cabo, requiere menos tiempo y utiliza menos reactivos químicos que otros protocolos para la detección de marcadores SSR.

Este método evita la fijación, la parada y varios pasos de lavado que se encuentran en los protocolos convencionales. Y solo requiere los dos pasos principales de impregnación y desarrollo. Se pueden producir imágenes claras utilizando este protocolo, ya que no hay ruido de fondo para la detección inequívoca de patrones de bandas SSR.

Se pueden examinar aproximadamente 800 muestras de ADN por día utilizando esta técnica y se ha utilizado con éxito en la investigación del tabaco y la col china en floración. Después de preparar los productos de PCR y las soluciones de gel de acuerdo con el protocolo de texto, use detergente en agua del grifo para lavar un juego de placas de vidrio y espaciadores, seguido de un enjuague completo con agua destilada. Coloque las placas en una rejilla de secado de placas para que se sequen al aire.

Disperse un mililitro de solución de aglutinante de silano en la superficie interna de una placa de vidrio rectangular y séquela durante cinco minutos. A continuación, disperse un mililitro de repel-silano en la superficie interior de una placa de vidrio con muescas con un hisopo y utilice un pañuelo de papel para limpiar el exceso de solución antes de dejar que la placa se seque al aire durante cinco minutos. Ensamble las placas de vidrio con espaciadores con la placa con muescas en la parte superior.

Y use abrazaderas de fundición para sujetar ambos lados del ensamblaje. A continuación, vierta una cantidad adecuada de solución de gel de poliacrilamida no desnaturalizante al 6% en un vaso de precipitados para el juego de platos. Agregue 20 microlitros de TEMED y 200 microlitros de 20%APS fresco y mezcle suavemente.

Vierta inmediata y cuidadosamente la solución en las placas de vidrio ensambladas a lo largo del borde de la placa con muescas, llenando el espacio casi hasta la parte superior. E inserte el peine. Luego agregue un pequeño volumen de solución de gel sobre el peine y deje que el gel se asiente a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Cuando el gel esté completamente polimerizado, retire las abrazaderas de fundición y coloque el juego de placas en la unidad del tanque de electroforesis con la placa dentada hacia el depósito tampón superior. Utilice abrazaderas grandes para sujetar el juego de placas a la unidad del tanque. Vierta un litro de tampón 0,5 X TBE en cada una de las cámaras superior e inferior.

A continuación, retire el peine y utilice una pipeta o jeringa llena de tampón para enjuagar a fondo todos los pocillos. Para hacer funcionar el gel de poliacrilamida, cargue aproximadamente un microlitro de producto PCR en cada pocillo. Además, cargue una escalera de ADN en cada extremo.

A continuación, fije la cubierta de seguridad a la cámara intermedia superior. Conecte los cables a la fuente de alimentación, haciendo coincidir el código de color rojo con rojo y negro con negro. Ejecute el gel a un voltaje constante de 110 voltios hasta que el tinte alcance una posición definida.

Normalmente, durante unos 70 minutos aproximadamente. Después de la electroforesis, abra la válvula y drene el tampón de la cámara superior en un vaso de precipitados grande. Separe las abrazaderas laterales y retire la placa del aparato.

Luego, use una espátula para separar cuidadosamente la placa de vidrio con muescas a lo largo de un lado y asegúrese de que el gel permanezca unido a la otra placa de vidrio recubierta con Bind-silano. A continuación, prepare un litro de solución de impregnación fresca disolviendo 1,5 gramos de nitrato de plata en un litro de agua destilada. Luego prepare un litro de solución de desarrollo fresco disolviendo 10 gramos de hidróxido de sodio en 900 mililitros de agua destilada.

Agregue un mililitro de formaldehído al 37% y use agua destilada para ajustar a un volumen final de un litro. Con abundante agua destilada, enjuague cuidadosamente el gel y la placa de vidrio para eliminar el tampón de electroforesis. A continuación, coloque la placa con el gel hacia arriba en una bandeja de plástico y sumerja el gel en un litro de solución de impregnación.

Agite suavemente la bandeja en una coctelera a 60 RPM durante tres o cuatro minutos. Transfiera la placa de la solución de impregnación a otra bandeja. Luego, use abundante agua destilada para enjuagar la solución de impregnación residual de la superficie de la placa y el gel dos veces durante tres a cinco segundos cada una.

El paso de lavado en gel después de la impregnación es crítico. El lavado insuficiente causa la eliminación incompleta de la solución de impregnación. Y el resultado es un fondo oscuro.

Coloque el lugar con el gel hacia arriba en otra bandeja. Sumerja la placa en un litro de solución de revelado, luego agite suavemente la bandeja a 50 RPM durante aproximadamente tres minutos. Monitoree la apariencia de los fragmentos de ADN y detenga el desarrollo cuando se observe la relación más alta entre la señal de los fragmentos de ADN y el ruido de fondo.

El tiempo de desarrollo adecuado es otro paso clave. El desarrollo excesivo puede dar lugar a un fondo marrón oscuro con una imagen de bajo contraste de fragmentos de ADN. Enjuague la placa y el gel con abundante agua destilada dos veces y use papel de seda para secar la placa de gel.

A continuación, utilice un escáner y el software adecuado para escanear el gel a 300 DPI y ajustar el brillo y el contraste para obtener una visualización clara de las bandas de ADN. Por último, marque el patrón de bandas de los marcadores SSR en función del tamaño de los fragmentos de ADN de la imagen. Los amplicones de PCR presentados aquí se produjeron utilizando los correspondientes pares de cebadores SSR en col china en flor y tabaco.

Después de la electroforesis, los geles de poliacrilamida se tiñeron utilizando el protocolo de tinción de plata que se muestra en este video. Que detectó sin ambigüedades los patrones de bandas de los marcadores SSR. Para comparar la eficiencia de detección de diferentes protocolos de tinción de plata, los productos de PCR de los marcadores de SSR se separaron mediante PAGE y se visualizaron utilizando cinco protocolos de tinción de plata publicados y un sexto método que se muestra en este video.

El protocolo demostrado aquí tenía el ruido de fondo más bajo y el contraste más alto de fragmentos de ADN, de modo que produjo la mayor claridad de imagen. De los seis protocolos probados, el método demostrado aquí toma la menor cantidad de tiempo y requiere la menor cantidad de reactivos químicos y pasos de proceso. Por último, esta figura muestra la sensibilidad del protocolo medida utilizando una dilución en serie de un marcador de ADN de 50 a 2000 pb en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante de 10 nanogramos por banda en el carril uno a 9,8 picogramos por banda de ADN en el carril 11.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en siete minutos si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe evitar la contaminación cruzada de las soluciones de impregnación y revelado. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores genotiparan rápidamente los marcadores SSR.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo detectar de manera simple y eficiente los marcadores SSR en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante utilizando tinción de plata. No olvide que trabajar con reactivos químicos puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben usar precauciones como guantes mientras se realiza este procedimiento.