Usando humanos inducida por células de hepatocito-como derivado de células madre pluripotentes de descubrimiento de fármacos

El objetivo general de este experimento es diferenciar las células madre pluripotentes inducidas humanas en células similares a los hepatocitos de una manera que sea adecuada para el cribado de alto rendimiento. Las células hepáticas son difíciles de cultivar en el laboratorio, sin embargo, se pueden generar a partir de células madre pluripotentes inducidas, lo que proporciona una plataforma de detección para identificar tratamientos para la enfermedad hepática. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden generar cantidades ilimitadas de hepatocitos a partir de cualquier paciente con enfermedad hepática que recapitulan la enfermedad en el laboratorio.

El procedimiento es relativamente fácil de establecer, incluso sin un amplio conocimiento de la biología de las células madre. Su reproducibilidad permite a los investigadores cribar miles de compuestos sin necesidad de una robótica compleja. Ray Liu, becario postdoctoral, y Paige Lamprecht, estudiante de posgrado, demostrarán el procedimiento hoy.

Primero, diluya la proteína de fusión Ecad a 15 microgramos por mililitro con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, o DPBS, que contiene calcio y magnesio. Cubra las placas de cultivo de tejidos en suspensión de 100 milímetros con cinco mililitros de matriz diluida e incube a 37 grados centígrados durante al menos una hora. Después de la incubación, retire el sustrato y reemplácelo con cinco mililitros de medio de cultivo iPSC.

Recuperar un vial de células madre pluripotentes inducidas humanas criopreservadas a partir de nitrógeno líquido. Descongele a 37 grados centígrados hasta que quede un pequeño cristal de hielo. A continuación, pipetee suavemente las células en un tubo cónico estéril de 15 mililitros que contenga cuatro mililitros del medio de cultivo.

Centrifugar las células a 300 g durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender suavemente las células con cinco mililitros de medio suplementado con diez micromolares de Y-27632, un inhibidor selectivo de una proteína quinasa asociada a Rho que contiene bobinas enrolladas. Ahora, retire el medio de cultivo de las placas de cultivo de tejidos en suspensión de diez milímetros recubiertas de Ecd y agregue cinco mililitros de las células.

Una vez que las iPSC alcancen alrededor del 80% de confluencia, retire el medio de cultivo y lávese una vez con DPBS sin calcio y magnesio. Aspire el DPBS y agregue una cantidad suficiente de solución de EDTA al 0,02% para cubrir los platos. Luego, incuba las células durante un máximo de tres minutos a temperatura ambiente.

Tan pronto como las células comiencen a liberarse, retire la solución de EDTA al 0,02% e inunde el plato con diez mililitros de medio M para liberar las células. Ayuda al desprendimiento de iPSC mediante un pipeteo suave. Transfiera 1/10 de las células suspendidas por placa de cultivo de tejido fresca recubierta de Ecad que contenga cinco mililitros de medio M.

Incubar los cultivos a 37 grados centígrados bajo 4% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono, cambiando el medio diariamente. Recupere un vial de 250 microlitros de caldo de matriz helada con una concentración de dos miligramos por mililitro y descongélelo en hielo. A continuación, combine la matriz descongelada con diez mililitros de DMEM/F12 frío mezclando suavemente con una pipeta preenfriada para obtener una concentración final de 0,05 miligramos por mililitro.

Transfiera 100 microlitros de la matriz diluida a cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Incubar la placa a 37 grados centígrados bajo un 4% de oxígeno y un 5% de dióxido de carbono durante al menos una hora. Después de la incubación, deseche la matriz y reemplácela con 50 microlitros de medio M por pocillo, repitiendo el mismo procedimiento de recubrimiento con el resto de las placas.

Ahora, cultive las iPSC en placas de 100 milímetros hasta que las células se acerquen al 80% de confluencia. Para recolectar las iPSC de cada placa de 100 milímetros, aspire el medio de cultivo y enjuague con cinco mililitros de DPBS. Reemplace el enjuague con tres mililitros de solución de desprendimiento de celdas, como Accutase.

A continuación, incubar durante unos dos minutos a 37 grados centígrados con un 4% de oxígeno y un 5% de dióxido de carbono. Tan pronto como las células comiencen a desprenderse, coseche agregando siete mililitros de medio M. Pipetear varias veces para disociar las colonias celulares en pequeños grupos de alrededor de tres a seis células.

A continuación, recoja las iPSC en un tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros y centrifugue a 300 g durante cinco minutos. Al terminar, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de celda en cinco mililitros de medio M. Distribuya uniformemente las celdas en placas recubiertas de matriz de 96 pocillos pipeteando 50 microlitros de celdas de suspensión en cada pocillo con una pipeta multicanal.

Luego, cultive las células durante la noche a 37 grados centígrados con 4% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono y repita los procedimientos de siembra celular con el resto de las placas. Examine las placas de 96 pocillos mediante microscopía para asegurarse de que las células cubran al menos el 70% de la superficie de cada pocillo individual. Para el primer y segundo día de diferenciación, reemplace el medio de cultivo con 100 microlitros de medio de diferenciación basado en RPMI por pocillo.

Luego, incube las células a 37 grados centígrados en oxígeno ambiente y 5% de dióxido de carbono durante dos días con un cambio diario de medio. Para el día tres al quinto de diferenciación, reemplace el medio de cultivo con 100 microlitros de medio de diferenciación basado en RPMI suplementado con 2% de B27 y 100 nanogramos por mililitro de NA activo. Cultive las células a 37 grados centígrados en oxígeno ambiente y 5% de dióxido de carbono durante tres días con un cambio diario de medio. En el quinto día de diferenciación, trate cada pocillo con 100 microlitros de solución de EDTA al 0,02% durante 30 segundos y retire la solución inmediatamente.

Agregue 100 microlitros de medio de diferenciación fresco a base de RPMI y repita el mismo procedimiento para el resto de las placas. Para la diferenciación entre los días seis a diez, reemplace el medio de cultivo con 100 microlitros de medio de diferenciación basado en RPMI. Incubar las células a 37 grados centígrados bajo un 4% de oxígeno y un 5% de dióxido de carbono durante cinco días con un cambio diario de medio.

Para la diferenciación entre los días 11 a 15, reemplace el medio de cultivo con 100 microlitros de medio de diferenciación basado en RPMI, complementado con 2% de B27 y 20 nanogramos por mililitro de HGF. Incubar las células a 37 grados centígrados bajo un 4% de oxígeno y un 5% de dióxido de carbono durante cinco días con un cambio diario de medio. Para la diferenciación entre los días 16 y 20, sustituya el medio de cultivo por un medio de cultivo de células de hepatocitos suplementado con 20 nanogramos por mililitro de oncostatina-M.

Incubar las células a 37 grados centígrados en oxígeno ambiente y 5% de dióxido de carbono durante cinco días con un cambio diario de medio. Al finalizar la diferenciación en el día 20, reemplace el medio de cultivo con 100 microlitros de medio de cultivo de células de hepatocitos frescos suplementado con 20 nanogramos por mililitro de oncostatina-M. Después de incubar durante 24 horas, recupere el medio de cultivo en una placa fresca de 96 pocillos y guárdelo a 20 grados centígrados.

Repita el mismo procedimiento de recolección para el resto de las placas. Agregue 90 microlitros de medio de cultivo de células de hepatocitos frescos suplementado con oncostatin-M en cada pocillo de la placa de 96 pocillos. Agregue diez microlitros de cada compuesto elegido de una solución madre de trabajo previamente preparada.

Agregue DMSO al 0,2% a los pocillos de control para que coincida con la concentración final en las muestras tratadas. Después de incubar durante 24 horas, recoja el medio de cultivo en una placa fresca de 96 pocillos y guárdelo a 20 grados centígrados. Repita el mismo procedimiento de recolección para el resto de las placas.

Después de cinco días de tratamiento, las células expresan proteínas que se expresan característicamente en el Endodermo Definitivo. Después de cinco días más de diferenciación, el endodermo se convierte en un destino hepático y las células expresan FOXA2 y HNF 4a. Después de la adición de HGF, las células expresan proteínas que se encuentran en los hepatocitos fetales y, al completar la diferenciación, las células adoptan una morfología cuboidal con un núcleo que contiene nucléolos prominentes y un citoplasma grande con múltiples gotas de lípidos.

La inmunotinción para detectar HNF 4a y albúmina en el día 20 de la diferenciación muestra que la distribución de estas proteínas de hepatocitos es similar en todos los pocillos. Se utilizaron iPSC para el cribado de compuestos reductores de APOB, por lo que se proporciona un ejemplo del uso de hepatocitos derivados de iPSC para el cribado de moléculas pequeñas. El factor z del ensayo APOB es de 0,73, lo que confirma la idoneidad del uso de la plataforma para el descubrimiento de fármacos.

Se determinó la proporción de APOB después y antes de la droga para cada compuesto. La identificación de los aciertos se logró mediante el análisis de z-score. Se identificaron 24 aciertos potenciales con una relación APOB de 0,86 a 0,44.

Después de excluir los compuestos que tenían un impacto negativo en la viabilidad celular, se encontró que dos compuestos eran reproducibles para reducir el APOB. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 25 días si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar preparar un medio fresco todos los días.

La concentración incorrecta de componentes debido a la degradación cambiará la capacidad de las células para diferenciarse. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del descubrimiento de fármacos exploraran el tratamiento terapéutico de la enfermedad hepática utilizando células madre pluripotentes inducidas humanas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo cultivar y mantener células madre pluripotentes inducidas humanas y realizar la diferenciación hepática en una forma prensada de superficie pequeña para el cribado de alto rendimiento.

No olvide que trabajar con células madre pluripotentes inducidas por humanos puede ser extremadamente peligroso y el equipo de protección personal, como guantes y una bata de laboratorio, siempre debe usarse mientras se realiza este procedimiento.