Name: Recogida y tratamiento de los ganglios linfáticos de animales grandes para el análisis de ARN: preparación para estudios de nodo de linfa transcriptómicos de grandes especies animales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Aprenda a recolectar y procesar ganglios linfáticos de animales grandes para análisis de ARN. Este protocolo estandarizado garantiza calidad en estudios transcriptómicos de ganado y fauna silvestre.

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Los autores desean agradecer a James Fosse por su excelente trabajo sobre todo videografía y procesamiento de vídeo; Michael Marti por su excelente trabajo en la generación de imágenes digitalizadas de ganado; Lilia Walther por su ayuda con la extracción de RNA y Bioanalyzer funciona; Mitch Palmer y Carly Kanipe por su útil informe y comentarios en imágenes de nodo de linfa; y el cuidado de los animales y el personal veterinario del Centro Nacional de enfermedades animales por todo su trabajo duro y ayuda con la cría de animales y la preparación para necropsias.

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar. Toda la investigación es financiada con fondos intramuros del Departamento de agricultura de Estados Unidos, servicio de investigación agrícola. Todas las referencias a productos específicos se proporcionan con el fin de reproducibilidad experimental y no representan ningún endoso de estos productos por el gobierno federal.

La mayoría de estudios transcriptómico y los protocolos asociados se centran en ratón, rata o post-mortem de muestras humanas. Sin embargo, investigaciones en ganadería y fauna proporcionan una amplia gama de oportunidades para la caracterización de la respuesta inmune a la enfermedad, como aplicable a la medicina veterinaria y, en relación con las enfermedades zoonóticas, de salud pública. Este protocolo proporciona un resumen de las más importantes consideraciones para la extracción de RNA de alta integridad de los tej...

Secuenciación del RNA análisis del transcriptoma de los ganglios linfáticos proporciona la oportunidad de caracterizar la respuesta inmune de los animales a una variedad de patógenos. Si bien esta metodología se ha utilizado extensivamente en ratones, análisis han ampliado recientemente en grandes mamíferos1,2. Ganadería y grandes ganglios animal puede utilizarse para caracterizar las respuestas de host a una infección, no sólo para su uso en vacunas o estudios de susceptibilidad genética y para la identificación de dianas para el desarrollo de fármacos, sino también como sistemas modelo para estudios en seres humanos en las enfermedades zoonóticas. Por ejemplo, en el caso de brucelosis (una enfermedad bacteriana zoonótica que impactos de medio millón personas alrededor del mundo cada año), a pesar de aumentó significativamente los costos de estudios en ovejas o cabras son más relevantes a la infección humana y vacunas humanas desarrollo de modelos animales de laboratorio. Modelos de infección del ratón recapitulan la infección del sistema reticuloendotelial, pero no los signos clínicos característicos3.
En experimentos con animales grandes en comparación con los estudios animales de laboratorio, el proceso de tejido recolección necesariamente implica un retraso largo entre la eutanasia y la colección de tejidos, que presenta un desafío potencial para la conservación de ARN de alta calidad. ARN intacto es esencial para la generación de datos transcriptómicos biológicamente relevantes. La generación de ARN de alta calidad de las muestras de tejido es particularmente crítica para estudios de patógeno animal grande llevó a cabo en las instalaciones de contención. Tales estudios son inherentemente más difíciles de realizar ya que no sólo requieren aprobado instalaciones y con personal altamente capacitado, sino también llevan costos financieros significativos, que, dependiendo de la obra, pueden variar desde decenas hasta cientos de miles de dólares. Este tipo de estudios también implica una colaboración interdisciplinaria y conocimiento interdisciplinario para su terminación, añadiendo a su complejidad. Por lo tanto, entrenamiento, desarrollo de y la adherencia a un sistema simplificado para la recogida de muestras y conservación proporciona ventajas significativas para posteriores estudios moleculares de los tejidos de animales infectados.
La colección más grandes de nodos de linfa presenta retos adicionales para la colección de tejido en comparación con la toma de muestras similar de ganglios murinos. La preparación para la supresión de la muestra requiere un entendimiento básico de la anatomía de los ganglios linfáticos, incluyendo las estructuras internas pertinentes. La estructura de un nodo de linfa se compone de lobulillos linfoides rodeados por senos llenados de linfa. Estas estructuras están encerradas dentro de una cápsula resistente, fibrosa. 4 un lóbulo linfoide es la "base anatómica y funcional unidad del ganglio linfático" y se compone de folículos, una unidad profunda cortical y cordones medulares y senos paranasales4 (figura 1A). Los linfocitos B y T son el hogar de los folículos y profundidad corticales unidades, respectivamente. Estas estructuras proporcionan un andamio 3D y facilitan la interacción entre los linfocitos y el antígeno o células presentadoras de antígeno.
Grueso, folículos y unidades de profundidad corticales pueden ser identificadas en superficie del corte ya que contienen una red reticular densa y aparecen más oscuros que los senos paranasales, que están compuestos por una red reticular más delicada y aparecen más ligeros (figura 1B). Por Convención, patólogos se refieren a las regiones de los ganglios linfáticos como la corteza superficial (folículos), el paracortex (unidades de profundidad corticales) y la médula (cordones medulares y los senos paranasales). Un examen adecuado de las tres regiones se ha considerado como la mejor práctica en pautas de rutina examinación patológica de ganglios5. Tenga en cuenta que existe una considerable variación en la consistencia, tamaño y color de los ganglios linfáticos, incluso dentro de un solo animal. Edad de los animales, sus nodos de linfa tenderá a disminuir en tamaño y ser más firme que los de animales más jóvenes, generalmente debido a un aumento en su tejido conectivo y una reducción del linfoide normal estructura6,7.
<img alt="Sección transversal del diagrama de ganglios linfáticos y tejido real que muestra corteza, paracorteza, médula, folículos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Sección transversal del diagrama de ganglios linfáticos y tejido real que muestra corteza, paracorteza, médula, folículos."> Figura 1. Anatomía de los ganglios linfáticos. (A) esta caricatura muestra la anatomía de los ganglios linfáticos, estructuras claves. (B) todavía la imagen muestra un nodo de linfa bovino cortado transversalmente. Se destacan las estructuras pertinentes/capas que son visibles a simple vista. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57195/57195fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Dependiendo de la pregunta experimental, diversos ganglios linfáticos será de interés para la recolección y análisis. Los ganglios linfáticos periféricos son los situados profundamente en el tejido subcutáneo. En el ganado, los ganglios linfáticos periféricos o superficiales de uso frecuente en la práctica clínica y experimental incluyen parótida, submaxilar, retrofaríngeo, preescapular, prefemoral (precrural) y superficial inguinal (supramamaria en escrotal en los machos de las hembras) () Figura 2). En la tabla 1, las propiedades de los principales ganglios linfáticos superficiales, como se describe en el sistema de ganados8, se describen. A continuación, se presentan algunas posibles planes de colección de nodo de linfa para enfermedades infecciosas bacterianas del ganado como punto de partida para la investigación.
Brucella abortus/Brucella melitensis: estándar de necropsias para B. abortus-infectado ganados y B. melitensis-cabras infectadas en el Centro Nacional de enfermedad Animal recuperan supramamaria prescapular y tejido ganglionar parotidea , tanto para la molienda para la enumeración bacteriana y para la preparación de RNA para los perfiles de expresión de RNA del anfitrión. B. abortus puede recuperarse regularmente en cada uno de estos nodos de linfa en bovinos experimentalmente infectados9. La presencia de bacterias en cada uno de estos tipos de nodo de linfa puede detectarse en B. melitensis-infectados cabras hasta infección posterior por lo menos nueve meses usando las metodologías basadas en RNA de nuestros estudios (Boggiatto et al., inédito). Salmonella SP.: prescapular, subiliac (prefemoral), y nodos de linfa mesentéricos han sido útiles durante la elaboración de perfiles de las canales de ganado para una prevalencia de Salmonella 10,11,12 y sería de interés potencial para estudios transcriptómico. E. coli O157: H7: nodos de linfa mesentéricos (en el intestino medio e intestino delgado distal) pueden ser los sitios de una recuperación ocasional de la bacterias en terneros infectados (pero no en ganado adulto infectado)13. Leptospirosis (Leptospira SP.): una crónica persistencia de la bacteria se ha observado en los ganglios linfáticos que drenan la glándula mamaria14. Mycobacterium bovis : En el ganado, las bacterias han sido recuperada post experimental infección de los ganglios linfáticos mediastínicos y traqueobronquiales de becerros15. Además, RNA del nodo de linfa se ha utilizado para examinar las respuestas de gran anfitrión animal al virus, como la del virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino2. Figura 2 muestra la ubicación de un subconjunto de estos grandes nodos de linfa en el cuerpo del ganado.
<img alt="Ubicaciones de los ganglios linfáticos en el diagrama de la vaca: parótida, submandibular, retrofaríngea, preescapular." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Ubicaciones de los ganglios linfáticos en el diagrama de la vaca: parótida, submandibular, retrofaríngea, preescapular."> Figura 2: Dibujos que representan lugares seleccionados del nodo de linfa en Bos taurus . Los nodos de linfa números anotados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57195/57195fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
En este artículo y el video asociado, se presenta un protocolo para el aislamiento de grandes ganglios animal para estudios de RNA, diseñados para ser informativa para biólogos moleculares involucrados en estudios transcriptómicos de infecciones animales grandes. En primer lugar, ofrecemos un resumen del procedimiento de aislamiento para los nodos de linfa, usando el muestreo de tejidos bovinos y Bisonte como ejemplos. Junto con esta demostración, como se muestra en el video, es un flujo de trabajo para una muestra de tejido reproductivo para el aislamiento de RNA. A continuación, se describen consideraciones importantes para el procesamiento de un ganglio infectado, con un enfoque en calidad de RNA, consistencia y seguridad.
La preparación del ARN del tejido con un reactivo de isotiocianato de guanidina de fenol acidificado se basa en el original método de Chomczynski y Sacchi16,17, con una purificación sobre columnas spin basados en sílice en presencia de caotrópico agentes basados en la obra original de Vogelstein y Gillespie18. También examinamos el potencial para la recuperación del ARN para transcriptómica de los ganglios linfáticos de vacas conservada por métodos alternativos. Finalmente, exploramos el impacto de la variable tiempo en la calidad del RNA en necropsias de animales grandes, incluyendo un experimento representativo que representa el efecto de un aumento en el tiempo entre la eutanasia y el muestreo del perfil de RNA recuperado de bisonte y bovina de los nodos de linfa. Este artículo será útil no sólo para biólogos moleculares, pero también para veterinarios investigadores comenzar estudios transcriptómico.

<table><tbody><tr><td>Solución de conservación de ARN (utilizamos RNALater para todos los experimentos)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>tubos de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 ml o 2 ml&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Bisturíes desechables</td><td>Daigger Scientific</td><td>EF7281</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de tejido, diente de rata</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-117</td><td>Otras pinzas de tejido disponibles, incluidas las de punta curva, borde cónico, etc., dependiendo de las preferencias</td></tr><tr><td>del usuario Agujas de biopsia con punzón de 3 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9949469</td><td></td></tr><tr><td>Contenedor de objetos punzocortantes (pequeño y transportable para la necropsia)</td><td>Stericycle</td><td>8900SA</td> Se <td>muestra el tamaño de 1 cuarto de galón</td></tr><tr><td>aquí Tablas de cortar o bandejas desechables</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-002-24A</td><td>Disponible en una variedad de tamaños, según las preferencias del usuario</td></tr><tr><td>Equipo</td><td></td><td></td> de protección personal <td>Varía según el patógeno (guantes, máscaras respiratorias, gafas, etc.)</td></tr><tr><td>Reactivo de extracción de ARN a base de fenol (utilizamos el reactivo TRIzol para todos los experimentos)</td><td>ThermoFisher</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>kit de extracción de ARN basado en columna de sílice (utilizamos el kit PureLink RNA Mini para todos los experimentos)</td><td>ThermoFisher</td><td>12183018A</td><td>Diseñado para hasta 100 mg</td></tr> de <tr><td>etanol 100% de etanol en tejido (200 pruebas para biología molecular)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de tejidos con tubos de homogeneización cerrados (utilizamos el disociador gentleMACS para todos los experimentos)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa (General, para electroforesis en gel)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>1X TBE</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24301</td><td>También se puede hacer desde cero en el laboratorio</td></tr><tr><td>Formamida desionizada</td><td>EMD Millipore</td><td>S4117</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>Xilenol cianol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (ácido etilendiaminotetraacético)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV-Vis (utilizamos el espectrofotómetro NanoDrop)</td><td>Dispositivo ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>para la evaluación cuantitativa de ARN (utilizamos el Bioanalyzer, con componentes y protocolos asociados)</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extracción de ARN FFPE (utilizamos el kit de aislamiento de ácido nucleico total RecoverAll para tejido fijado en formol e integrado en parafina)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1975</td><td></td></tr><tr><td>Esparcidor de plástico (esparcidor en forma de L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-665-231</td><td>Solo necesario para pruebas de esterilidad para muestras de animales infectados</td></tr><tr><td>Cuchillos de necropsia</td><td>Conceptos de ganadería</td><td>WI-0009209</td><td></td></tr></tbody></table>

recogida y tratamiento de los ganglios linfáticos de animales grandes para el análisis de arn: preparación para estudios de nodo de linfa transcriptómicos de grandes especies animales

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Animales grandes (ganado y vida silvestre) sirven como importantes reservorios de patógenos, incluyendo Brucella, Salmonella, Mycobacterium bovisy e. coliy son útiles para el estudio de la patogenia y diseminación de las bacterias en hospederos naturales. Con la función clave de la respuesta inmune del huésped de los ganglios linfáticos, ganglios linfáticos tejidos sirven como una fuente potencial de RNA para análisis transcriptómico aguas abajo, para evaluar los cambios temporales en la expresión génica en las células en el transcurso de una infección. Este artículo presenta un resumen del proceso de la colección de nodos de linfa, tejido muestreo y posterior procesamiento del ARN en ganadería, con ganado bovino (Bos taurus) como un modelo, ejemplos adicionales de bisonte americano (bisonte del bisonte de ). El protocolo incluye información sobre la ubicación, identificación y extirpación de ganglios linfáticos de múltiples sitios claves en el cuerpo. Además, se presenta una metodología de toma de muestras de biopsia que permite una consistencia de muestreo a través de múltiples animales. Se discuten varias consideraciones para la preservación de la muestra, incluyendo la generación de ARN adecuado para aguas abajo metodologías como la secuencia de RNA y RT-PCR. Debido a los retrasos inherentes en grandes animales vs ratón tiempo estudia, se presentan los resultados representativos de bisonte y los tejidos bovinos del nodo de linfa para describir el curso temporal de la degradación en este tipo de tejido, en el contexto de una revisión de anterior trabajo metodológico en la degradación del RNA en otros tejidos. En general, este protocolo servirá a ambos investigadores veterinarios comenzando proyectos de transcriptoma en muestras de animales grandes y a biólogos moleculares interesados en aprender técnicas para el muestreo de tejido en vivo y en vitro procesamiento.

El uso de las consideraciones presentadas en este artículo (pasos 1-4 del Protocolo) ayudará a la recuperación del ARN de muestras animales grandes que es conveniente para un análisis posterior en estudios de expresión génica de host. Se evaluó la calidad de RNA para aplicaciones posteriores mediante varias medidas estándar. Para espectrofotometría, un260/A280 ratio proporciona una medida de la contaminación de la proteína, y un260/A230 ratio proporciona otra forma de evaluació...

Este protocolo proporciona un resumen de los procedimientos para el aislamiento de ARN para los perfiles transcriptómicos de nodo de linfa tejidos de animales grandes, incluyendo pasos en la identificación y extirpación de los ganglios linfáticos de ganado y la fauna, métodos de muestreo para proporcionar consistencia en varios animales y consideraciones más resultados representativos para la conservación de la colección y procesamiento de análisis de ARN.

Recogida y tratamiento de los ganglios linfáticos de animales grandes para el análisis de ARN: preparación para estudios de nodo de linfa transcriptómicos de grandes especies animales

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

Hola, mi nombre es Dr. Robert Schaut y soy científico en el Centro Nacional de Enfermedades Animales en Ames, Iowa. En este video de JoVE, compartiremos con usted información sobre la recolección y el procesamiento de ganglios linfáticos de animales grandes para su uso en experimentos posteriores de ARN. Por ejemplo, estos experimentos podrían incluir PCR cuantitativa en productos transcritos inversos o estudios de secuenciación de ARN de transcriptomas.Los ganglios linfáticos son muestras útiles para la evaluación de las respuestas inmunitarias del huésped, pero también pueden proporcionar una fuente de ARN de patógenos para su estudio, como en el caso de los patógenos intracelulares presentes en las células inmunitarias dentro de los ganglios linfáticos. Las muestras de animales grandes, incluyendo tanto especies de ganado como de fauna silvestre, son de interés en el estudio de las enfermedades zoonóticas. Aquí, en el Centro Nacional de Enfermedades Animales, estudiamos las infecciones del ganado con especies como la brucella abortus, que causa brucelosis en el ganado y el bisonte, y la E. Coli O157:H7 que se desprende de las huellas intestinales del ganado.También recuperaremos

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Aprenda a recolectar y procesar ganglios linfáticos de animales grandes para análisis de ARN. Este protocolo estandarizado garantiza calidad en estudios transcriptómicos de ganado y fauna silvestre.

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