Recogida y tratamiento de los ganglios linfáticos de animales grandes para el análisis de ARN: preparación para estudios de nodo de linfa transcriptómicos de grandes especies animales

Hola, mi nombre es Dr. Robert Schaut y soy científico en el Centro Nacional de Enfermedades Animales en Ames, Iowa. En este video de JoVE, compartiremos con usted información sobre la recolección y el procesamiento de ganglios linfáticos de animales grandes para su uso en experimentos posteriores de ARN. Por ejemplo, estos experimentos podrían incluir PCR cuantitativa en productos transcritos inversos o estudios de secuenciación de ARN de transcriptomas.

Los ganglios linfáticos son muestras útiles para la evaluación de las respuestas inmunitarias del huésped, pero también pueden proporcionar una fuente de ARN de patógenos para su estudio, como en el caso de los patógenos intracelulares presentes en las células inmunitarias dentro de los ganglios linfáticos. Las muestras de animales grandes, incluyendo tanto especies de ganado como de fauna silvestre, son de interés en el estudio de las enfermedades zoonóticas. Aquí, en el Centro Nacional de Enfermedades Animales, estudiamos las infecciones del ganado con especies como la brucella abortus, que causa brucelosis en el ganado y el bisonte, y la E. Coli O157:H7 que se desprende de las huellas intestinales del ganado.

También recuperaremos muestras de tejido de especies de vida silvestre, como ciervos y alces. Se puede recolectar una variedad de ganglios linfáticos de animales infectados con diferentes enfermedades. Los estudios de los tejidos de estas especies hospedadoras naturales son generalmente más relevantes para la progresión natural de la enfermedad que los modelos de ratón.

Sin embargo, el proceso de recolección de tejidos de especies grandes es necesariamente más complicado que el de ratones, incluyendo el mayor retraso entre la eutanasia y la recolección de tejidos, y un mayor tamaño de los ganglios linfáticos. Aquí, presentaremos un protocolo para el aislamiento de ganglios linfáticos de animales grandes para el estudio de ARN que será informativo para los biólogos moleculares involucrados en los estudios transcriptómicos de infecciones de animales grandes, así como para los investigadores veterinarios que comienzan estudios transcriptómicos. En este video, demostraremos los procedimientos en los ganglios linfáticos para el ganado.

Antes de la necropsia, recomendamos reunir los siguientes suministros específicos para el procedimiento de aislamiento de tejidos. Tubos de microfuga llenos de aproximadamente 1 ml de conservante de tejido de ARN, como RNAlater, bisturíes desechables, pinzas limpias y de autoclave, agujas de biopsia, un recipiente para objetos punzantes para bisturíes y agujas usadas, y una tabla de cortar o una bandeja desechable, según el nivel de infectividad de los materiales involucrados. En este caso, demostraremos los elementos clave del procedimiento mediante el uso de ganglios linfáticos que generalmente recolectamos del ganado.

Están infectados con bacterias que causan la brucelosis. Estos son los ganglios linfáticos prescapulares y el ganglio linfático parótido. Al realizar una necropsia de animales grandes para la recuperación de ARN, es útil tener al menos tres participantes trabajando en tejidos animales.

El disector uno se encargará de seccionar diferentes piezas del animal, el disector dos recuperará los ganglios linfáticos de diferentes secciones de animales en la mesa de necropsia principal, y el disector tres trabajará en una mesa separada para aislar secciones de cada ganglio linfático y transferirlas a tubos con solución conservante. Comenzaremos con la identificación y extirpación del ganglio linfático prescapular. Idealmente, la palpación de un ganglio linfático, antes de la disección, ayudará a identificar la ubicación del ganglio linfático.

Aunque no siempre es posible detectarlo, el ganglio linfático prescapular suele ser palpable en un animal sano. Comience colocando al animal en decúbito lateral. Extienda el hombro moviendo la extremidad delantera hacia atrás a la altura de la rodilla.

Este movimiento llevará el hombro hacia atrás y permitirá una fácil palpación del ganglio linfático. Palpa la presencia del ganglio linfático como se muestra. Una vez localizado, y con el hombro aún extendido, utiliza un bisturí o un cuchillo de necropsia para hacer una incisión en la piel a lo largo del contorno del hombro.

Retrae la piel para revelar la punta de la musculatura del hombro y el cuello. A veces se observa una sección de grasa subcutánea, especialmente en animales sobrecondicionados. El ganglio linfático prescapular a menudo se encuentra con secciones de grasa subcutánea.

Aquí se pueden ver las tres capas de la piel, el músculo y la grasa subcutánea. Una vez más, palpa la ubicación de un ganglio linfático. A diferencia de la grasa subcutánea, el ganglio linfático mantendrá su forma cuando se palpa.

Después de localizar el ganglio linfático prescapular, diseccione cuidadosamente la grasa subcutánea y diseccione el ganglio linfático. La apariencia de estos ganglios linfáticos en el bisonte, que utilizamos en estudios de brucelosis debido a la susceptibilidad de los bisontes en el área metropolitana de Yellowstone a la brucella, es similar. Aquí, demostramos la apariencia del ganglio linfático prescapular, diseccionado del hombro derecho de un bisonte americano.

A continuación pasaremos al aislamiento del ganglio linfático parótido. Con el animal en decúbito lateral, localice la articulación temporomandibular. Con un bisturí o un cuchillo de necropsia, haga con cuidado una incisión en la piel.

Comience dorsal a la articulación y extiéndase verticalmente a lo largo de la línea de la mandíbula. Disecciona la piel para revelar el tejido subcutáneo. La glándula salival parótida será visible, en primer lugar, debido a su gran tamaño, apariencia superficial lobulada y coloración roja.

Con fórceps y bisturí, mueva la glándula salival parótida a un lado para encontrar el ganglio linfático parótido que se encuentra justo craneal y medial a la glándula salival. Al aislar el ganglio linfático parótido, es fundamental separar el tejido de los ganglios linfáticos del tejido de la glándula salival parótida. Los tipos de tejido se ven distintos, incluso dentro de la sección transversal del tejido.

Esto se puede observar aquí, con el ganglio linfático parotídeo a la izquierda y la glándula salival parótida a la derecha. Asegúrese de examinar cuidadosamente el tejido de los ganglios linfáticos parótidos para ver si tiene textura antes de continuar con el procesamiento. En algunos casos, puede ser necesario extirpar la glándula salival parótida para localizar el ganglio linfático parótido.

Aquí hay un ejemplo de una glándula parótida extirpada de un novillo, en la que el ganglio linfático estaba incrustado dentro de la glándula salival y no era visible antes de la extracción de la glándula. En el manuscrito principal se proporciona información adicional sobre la identificación de los ganglios linfáticos seleccionados. Una vez que se hayan recolectado los ganglios linfáticos, estará listo para extirpar secciones para su preservación.

Con un bisturí o un bisturí de necropsia, extirpa una sección del ganglio linfático y haz una incisión sagital para abrir el ganglio linfático. Examinar el interior del ganglio linfático, especialmente en ejemplares de animales infectados, buscando asimetrías, lesiones, diferencias de color, etc. En este ganglio linfático prescapular bovino, múltiples características son visibles a simple vista.

Estos incluyen folículos, que albergan linfocitos B, y unidades corticales profundas, que albergan linfocitos T. Estas razones parecen más oscuras que los senos medulares, que son más claros. Aquí, se muestra otro ejemplo de un ganglio linfático no infectado.

Este ganglio linfático es de un bisonte más joven. Tenga en cuenta que los folículos son menos distintos en este ejemplo. Con el fin de seccionar los tejidos para su procesamiento, una opción es recolectar pequeños trozos de tejido de cada ganglio linfático con un bisturí para la posterior recuperación del ARN.

Sin embargo, uno de los principales desafíos al comparar los perfiles de expresión entre muestras es el gran tamaño de los ganglios linfáticos de animales grandes, en comparación con un ganglio linfático de ratón, que se puede extraer fácilmente entero para la extracción de ARN. Como resultado, las secciones pequeñas de tejido no capturarán uniformemente el perfil de las células a través de un ganglio linfático. En su lugar, para capturar células a través del perfil de un ganglio linfático, se extirpa una cuña en forma de pastel del ganglio linfático, se corta en trozos pequeños de no más de 5 mm de grosor y se coloca, con pinzas, en tubos que contienen ARNlater.

Alternativamente, utilice metodologías de biopsia para extirpar secciones de tejido de cada ganglio linfático. Seleccione la herramienta de biopsia por punción si desea recolectar secciones específicas, como folículos específicos del ganglio, y luego transferirlos, con fórceps, a RNAlater. Una vez que las muestras se hayan transferido a RNAlater, transfiéralas nuevamente al laboratorio y almacene a 4 grados centígrados durante la noche para permitir la penetración en el tejido.

Después, elimine el exceso de ARN y almacene las muestras de tejido a 80 grados centígrados. Una ventaja de usar una solución conservante de ARN es que no se requiere nitrógeno líquido en la necropsia, ni en la recolección de muestras en el campo. Antes de acceder a las muestras, pre-alícuota el reactivo de Trizol a tubos para su homogeneización.

Después de que las muestras se retiren del congelador, transfiéralas inmediatamente al reactivo Trizol para su procesamiento posterior, según las recomendaciones del fabricante. Aquí, una pieza de 50-100 mg de tejido se transfiere al reactivo Trizol. Limite la descongelación antes de la adición de Trizol tanto como sea posible.

El almacenamiento en hielo seco se puede utilizar cuando se retiran varias muestras del congelador para su procesamiento. Coloque los tubos en el homogeneizador y homogeneice en el reactivo Trizol. En este caso, se utiliza un ajuste de extracción de ARN de dos minutos.

Cuando termine, verifique si tiene una apariencia turbia. Repita si es necesario. Siga el protocolo del fabricante para generar capas acuosas y orgánicas para cada muestra.

Retire la fase acuosa clara superior con una punta de pipeta. Transfiera a un nuevo tubo de microcentrífuga. A continuación, mezcle con un volumen igual de etanol al 100%.

Homogeneizar. A menudo, el tubo se verá turbio. Con una punta de micropipeta, transfiera el líquido a una columna de centrifugación comercial a base de sílice para purificar aún más y luego eluir su ARN.

Para evaluar la calidad del ARN, cargue uno o dos l de la muestra de ARN eluido en un espectrofotómetro para su análisis. Después de completar el procedimiento, observamos relaciones de absorbancia de aproximadamente dos para la relación 260-280 y la relación 260-230, lo que indica una alta pureza con un arrastre químico mínimo. La contaminación por fenol sería observable a partir de una disminución en la relación de absorbancia de 260-230 nm.

Durante el procedimiento de necropsia, en el caso de animales como el bisonte, observamos un período de tiempo de al menos 20 minutos entre la eutanasia y la transferencia de la primera muestra de tejido al conservante. Por el contrario, los ganglios linfáticos de ratón pueden extirparse y conservarse después de la eutanasia en cuestión de minutos. Por lo tanto, nos interesaba caracterizar el perfil de degradación de los ganglios linfáticos a lo largo del tiempo.

En el manuscrito principal también compilamos un resumen de los perfiles de estabilidad del ARN en una variedad de otros tipos de tejidos que han sido probados en otras publicaciones. En experimentos representativos, realizados con ganglios linfáticos de bisonte, la estabilidad del ARN fue relativamente constante en el transcurso de una hora después de la eutanasia. Aquí, representamos una imagen en gel de ARN total purificado a partir de trozos de tejido de ganglios linfáticos supramamarios de un bisonte americano.

Este hallazgo es consistente con datos previos para otros tipos de tejidos compilados a partir de la literatura. Esto sugiere que se pueden recolectar muestras de calidad aceptable para el análisis posterior de la expresión génica incluso de especies más desafiantes como el bisonte y el alce. Sin embargo, es importante tener en cuenta que los tiempos más largos entre la muerte y la conservación de la muestra pueden dar lugar a cambios en los perfiles de expresión de ARN, incluido el aumento de la degradación de tres extremos principales de las transcripciones de ARNm.

Por lo tanto, sigue siendo importante utilizar un flujo de trabajo rápido y optimizado para la recuperación de tejidos con el fin de reducir más retrasos una vez que el animal está disponible para la necropsia, con el fin de lograr los perfiles de ARN más válidos biológicamente. Además, señalamos que se debe tener cuidado durante todo el procedimiento para evitar la introducción de contaminantes de ARN en las muestras durante todo el proceso, más allá de los que ya están presentes dentro de los tejidos. Esto incluye el uso de guantes como parte del resto del equipo de protección personal requerido.

También alícuotas el producto final de ARN en múltiples tubos para limitar el estancamiento libre de las muestras de ARN tanto como sea posible. Por ejemplo, se pueden almacenar alícuotas separadas para su uso en pruebas de control de calidad. En resumen, en este video hemos proporcionado información importante para su uso en la identificación, recolección, muestreo representativo y procesamiento de ganglios linfáticos para el análisis de expresión génica posterior.

Si bien nuestro video representativo se ha demostrado con ejemplos de ganado y bisonte, también hemos trabajado con ganglios linfáticos de otras especies grandes, incluidas cabras y alces. Esperamos que este video le resulte útil en su trabajo, ya sea que sea un científico veterinario que está considerando el uso de métodos transcriptómicos en su trabajo o un biólogo molecular interesado en aventurarse en el campo de la ciencia de los grandes animales.