Name: Recogida y tratamiento de los ganglios linfáticos de animales grandes para el análisis de ARN: preparación para estudios de nodo de linfa transcriptómicos de grandes especies animales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 53 s
Description: Aprenda a recolectar y procesar ganglios linfáticos de animales grandes para análisis de ARN. Este protocolo estandarizado garantiza calidad en estudios transcriptómicos de ganado y fauna silvestre.

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Los autores desean agradecer a James Fosse por su excelente trabajo sobre todo videografía y procesamiento de vídeo; Michael Marti por su excelente trabajo en la generación de imágenes digitalizadas de ganado; Lilia Walther por su ayuda con la extracción de RNA y Bioanalyzer funciona; Mitch Palmer y Carly Kanipe por su útil informe y comentarios en imágenes de nodo de linfa; y el cuidado de los animales y el personal veterinario del Centro Nacional de enfermedades animales por todo su trabajo duro y ayuda con la cría de animales y la preparación para necropsias.

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar. Toda la investigación es financiada con fondos intramuros del Departamento de agricultura de Estados Unidos, servicio de investigación agrícola. Todas las referencias a productos específicos se proporcionan con el fin de reproducibilidad experimental y no representan ningún endoso de estos productos por el gobierno federal.

La mayoría de estudios transcriptómico y los protocolos asociados se centran en ratón, rata o post-mortem de muestras humanas. Sin embargo, investigaciones en ganadería y fauna proporcionan una amplia gama de oportunidades para la caracterización de la respuesta inmune a la enfermedad, como aplicable a la medicina veterinaria y, en relación con las enfermedades zoonóticas, de salud pública. Este protocolo proporciona un resumen de las más importantes consideraciones para la extracción de RNA de alta integridad de los tej...

Secuenciación del RNA análisis del transcriptoma de los ganglios linfáticos proporciona la oportunidad de caracterizar la respuesta inmune de los animales a una variedad de patógenos. Si bien esta metodología se ha utilizado extensivamente en ratones, análisis han ampliado recientemente en grandes mamíferos1,2. Ganadería y grandes ganglios animal puede utilizarse para caracterizar las respuestas de host a una infección, no sólo para su uso en vacunas o estudios de susceptibilidad genética y para la identificación de dianas para el desarrollo de fármacos, sino también como sistemas modelo para estudios en seres humanos en las enfermedades zoonóticas. Por ejemplo, en el caso de brucelosis (una enfermedad bacteriana zoonótica que impactos de medio millón personas alrededor del mundo cada año), a pesar de aumentó significativamente los costos de estudios en ovejas o cabras son más relevantes a la infección humana y vacunas humanas desarrollo de modelos animales de laboratorio. Modelos de infección del ratón recapitulan la infección del sistema reticuloendotelial, pero no los signos clínicos característicos3.
En experimentos con animales grandes en comparación con los estudios animales de laboratorio, el proceso de tejido recolección necesariamente implica un retraso largo entre la eutanasia y la colección de tejidos, que presenta un desafío potencial para la conservación de ARN de alta calidad. ARN intacto es esencial para la generación de datos transcriptómicos biológicamente relevantes. La generación de ARN de alta calidad de las muestras de tejido es particularmente crítica para estudios de patógeno animal grande llevó a cabo en las instalaciones de contención. Tales estudios son inherentemente más difíciles de realizar ya que no sólo requieren aprobado instalaciones y con personal altamente capacitado, sino también llevan costos financieros significativos, que, dependiendo de la obra, pueden variar desde decenas hasta cientos de miles de dólares. Este tipo de estudios también implica una colaboración interdisciplinaria y conocimiento interdisciplinario para su terminación, añadiendo a su complejidad. Por lo tanto, entrenamiento, desarrollo de y la adherencia a un sistema simplificado para la recogida de muestras y conservación proporciona ventajas significativas para posteriores estudios moleculares de los tejidos de animales infectados.
La colección más grandes de nodos de linfa presenta retos adicionales para la colección de tejido en comparación con la toma de muestras similar de ganglios murinos. La preparación para la supresión de la muestra requiere un entendimiento básico de la anatomía de los ganglios linfáticos, incluyendo las estructuras internas pertinentes. La estructura de un nodo de linfa se compone de lobulillos linfoides rodeados por senos llenados de linfa. Estas estructuras están encerradas dentro de una cápsula resistente, fibrosa. 4 un lóbulo linfoide es la "base anatómica y funcional unidad del ganglio linfático" y se compone de folículos, una unidad profunda cortical y cordones medulares y senos paranasales4 (figura 1A). Los linfocitos B y T son el hogar de los folículos y profundidad corticales unidades, respectivamente. Estas estructuras proporcionan un andamio 3D y facilitan la interacción entre los linfocitos y el antígeno o células presentadoras de antígeno.
Grueso, folículos y unidades de profundidad corticales pueden ser identificadas en superficie del corte ya que contienen una red reticular densa y aparecen más oscuros que los senos paranasales, que están compuestos por una red reticular más delicada y aparecen más ligeros (figura 1B). Por Convención, patólogos se refieren a las regiones de los ganglios linfáticos como la corteza superficial (folículos), el paracortex (unidades de profundidad corticales) y la médula (cordones medulares y los senos paranasales). Un examen adecuado de las tres regiones se ha considerado como la mejor práctica en pautas de rutina examinación patológica de ganglios5. Tenga en cuenta que existe una considerable variación en la consistencia, tamaño y color de los ganglios linfáticos, incluso dentro de un solo animal. Edad de los animales, sus nodos de linfa tenderá a disminuir en tamaño y ser más firme que los de animales más jóvenes, generalmente debido a un aumento en su tejido conectivo y una reducción del linfoide normal estructura6,7.
<img alt="Sección transversal del diagrama de ganglios linfáticos y tejido real que muestra corteza, paracorteza, médula, folículos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Sección transversal del diagrama de ganglios linfáticos y tejido real que muestra corteza, paracorteza, médula, folículos."> Figura 1. Anatomía de los ganglios linfáticos. (A) esta caricatura muestra la anatomía de los ganglios linfáticos, estructuras claves. (B) todavía la imagen muestra un nodo de linfa bovino cortado transversalmente. Se destacan las estructuras pertinentes/capas que son visibles a simple vista. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57195/57195fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Dependiendo de la pregunta experimental, diversos ganglios linfáticos será de interés para la recolección y análisis. Los ganglios linfáticos periféricos son los situados profundamente en el tejido subcutáneo. En el ganado, los ganglios linfáticos periféricos o superficiales de uso frecuente en la práctica clínica y experimental incluyen parótida, submaxilar, retrofaríngeo, preescapular, prefemoral (precrural) y superficial inguinal (supramamaria en escrotal en los machos de las hembras) () Figura 2). En la tabla 1, las propiedades de los principales ganglios linfáticos superficiales, como se describe en el sistema de ganados8, se describen. A continuación, se presentan algunas posibles planes de colección de nodo de linfa para enfermedades infecciosas bacterianas del ganado como punto de partida para la investigación.
Brucella abortus/Brucella melitensis: estándar de necropsias para B. abortus-infectado ganados y B. melitensis-cabras infectadas en el Centro Nacional de enfermedad Animal recuperan supramamaria prescapular y tejido ganglionar parotidea , tanto para la molienda para la enumeración bacteriana y para la preparación de RNA para los perfiles de expresión de RNA del anfitrión. B. abortus puede recuperarse regularmente en cada uno de estos nodos de linfa en bovinos experimentalmente infectados9. La presencia de bacterias en cada uno de estos tipos de nodo de linfa puede detectarse en B. melitensis-infectados cabras hasta infección posterior por lo menos nueve meses usando las metodologías basadas en RNA de nuestros estudios (Boggiatto et al., inédito). Salmonella SP.: prescapular, subiliac (prefemoral), y nodos de linfa mesentéricos han sido útiles durante la elaboración de perfiles de las canales de ganado para una prevalencia de Salmonella 10,11,12 y sería de interés potencial para estudios transcriptómico. E. coli O157: H7: nodos de linfa mesentéricos (en el intestino medio e intestino delgado distal) pueden ser los sitios de una recuperación ocasional de la bacterias en terneros infectados (pero no en ganado adulto infectado)13. Leptospirosis (Leptospira SP.): una crónica persistencia de la bacteria se ha observado en los ganglios linfáticos que drenan la glándula mamaria14. Mycobacterium bovis : En el ganado, las bacterias han sido recuperada post experimental infección de los ganglios linfáticos mediastínicos y traqueobronquiales de becerros15. Además, RNA del nodo de linfa se ha utilizado para examinar las respuestas de gran anfitrión animal al virus, como la del virus del síndrome reproductor y respiratorio porcino2. Figura 2 muestra la ubicación de un subconjunto de estos grandes nodos de linfa en el cuerpo del ganado.
<img alt="Ubicaciones de los ganglios linfáticos en el diagrama de la vaca: parótida, submandibular, retrofaríngea, preescapular." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57195/57195fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Ubicaciones de los ganglios linfáticos en el diagrama de la vaca: parótida, submandibular, retrofaríngea, preescapular."> Figura 2: Dibujos que representan lugares seleccionados del nodo de linfa en Bos taurus . Los nodos de linfa números anotados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57195/57195fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
En este artículo y el video asociado, se presenta un protocolo para el aislamiento de grandes ganglios animal para estudios de RNA, diseñados para ser informativa para biólogos moleculares involucrados en estudios transcriptómicos de infecciones animales grandes. En primer lugar, ofrecemos un resumen del procedimiento de aislamiento para los nodos de linfa, usando el muestreo de tejidos bovinos y Bisonte como ejemplos. Junto con esta demostración, como se muestra en el video, es un flujo de trabajo para una muestra de tejido reproductivo para el aislamiento de RNA. A continuación, se describen consideraciones importantes para el procesamiento de un ganglio infectado, con un enfoque en calidad de RNA, consistencia y seguridad.
La preparación del ARN del tejido con un reactivo de isotiocianato de guanidina de fenol acidificado se basa en el original método de Chomczynski y Sacchi16,17, con una purificación sobre columnas spin basados en sílice en presencia de caotrópico agentes basados en la obra original de Vogelstein y Gillespie18. También examinamos el potencial para la recuperación del ARN para transcriptómica de los ganglios linfáticos de vacas conservada por métodos alternativos. Finalmente, exploramos el impacto de la variable tiempo en la calidad del RNA en necropsias de animales grandes, incluyendo un experimento representativo que representa el efecto de un aumento en el tiempo entre la eutanasia y el muestreo del perfil de RNA recuperado de bisonte y bovina de los nodos de linfa. Este artículo será útil no sólo para biólogos moleculares, pero también para veterinarios investigadores comenzar estudios transcriptómico.

<table><tbody><tr><td>Solución de conservación de ARN (utilizamos RNALater para todos los experimentos)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>tubos de microcentrífuga de polipropileno de 1,5 ml o 2 ml&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Bisturíes desechables</td><td>Daigger Scientific</td><td>EF7281</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de tejido, diente de rata</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-117</td><td>Otras pinzas de tejido disponibles, incluidas las de punta curva, borde cónico, etc., dependiendo de las preferencias</td></tr><tr><td>del usuario Agujas de biopsia con punzón de 3 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9949469</td><td></td></tr><tr><td>Contenedor de objetos punzocortantes (pequeño y transportable para la necropsia)</td><td>Stericycle</td><td>8900SA</td> Se <td>muestra el tamaño de 1 cuarto de galón</td></tr><tr><td>aquí Tablas de cortar o bandejas desechables</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-002-24A</td><td>Disponible en una variedad de tamaños, según las preferencias del usuario</td></tr><tr><td>Equipo</td><td></td><td></td> de protección personal <td>Varía según el patógeno (guantes, máscaras respiratorias, gafas, etc.)</td></tr><tr><td>Reactivo de extracción de ARN a base de fenol (utilizamos el reactivo TRIzol para todos los experimentos)</td><td>ThermoFisher</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>kit de extracción de ARN basado en columna de sílice (utilizamos el kit PureLink RNA Mini para todos los experimentos)</td><td>ThermoFisher</td><td>12183018A</td><td>Diseñado para hasta 100 mg</td></tr> de <tr><td>etanol 100% de etanol en tejido (200 pruebas para biología molecular)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de tejidos con tubos de homogeneización cerrados (utilizamos el disociador gentleMACS para todos los experimentos)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa (General, para electroforesis en gel)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>1X TBE</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP24301</td><td>También se puede hacer desde cero en el laboratorio</td></tr><tr><td>Formamida desionizada</td><td>EMD Millipore</td><td>S4117</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>Xilenol cianol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (ácido etilendiaminotetraacético)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV-Vis (utilizamos el espectrofotómetro NanoDrop)</td><td>Dispositivo ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>para la evaluación cuantitativa de ARN (utilizamos el Bioanalyzer, con componentes y protocolos asociados)</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extracción de ARN FFPE (utilizamos el kit de aislamiento de ácido nucleico total RecoverAll para tejido fijado en formol e integrado en parafina)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1975</td><td></td></tr><tr><td>Esparcidor de plástico (esparcidor en forma de L)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-665-231</td><td>Solo necesario para pruebas de esterilidad para muestras de animales infectados</td></tr><tr><td>Cuchillos de necropsia</td><td>Conceptos de ganadería</td><td>WI-0009209</td><td></td></tr></tbody></table>

recogida y tratamiento de los ganglios linfáticos de animales grandes para el análisis de arn: preparación para estudios de nodo de linfa transcriptómicos de grandes especies animales

Collection and Processing of Lymph Nodes from Large Animals for RNA Analysis: Preparing for Lymph Node Transcriptomic Studies of Large Animal Species

Animales grandes (ganado y vida silvestre) sirven como importantes reservorios de patógenos, incluyendo Brucella, Salmonella, Mycobacterium bovisy e. coliy son útiles para el estudio de la patogenia y diseminación de las bacterias en hospederos naturales. Con la función clave de la respuesta inmune del huésped de los ganglios linfáticos, ganglios linfáticos tejidos sirven como una fuente potencial de RNA para análisis transcriptómico aguas abajo, para evaluar los cambios temporales en la expresión génica en las células en el transcurso de una infección. Este artículo presenta un resumen del proceso de la colección de nodos de linfa, tejido muestreo y posterior procesamiento del ARN en ganadería, con ganado bovino (Bos taurus) como un modelo, ejemplos adicionales de bisonte americano (bisonte del bisonte de ). El protocolo incluye información sobre la ubicación, identificación y extirpación de ganglios linfáticos de múltiples sitios claves en el cuerpo. Además, se presenta una metodología de toma de muestras de biopsia que permite una consistencia de muestreo a través de múltiples animales. Se discuten varias consideraciones para la preservación de la muestra, incluyendo la generación de ARN adecuado para aguas abajo metodologías como la secuencia de RNA y RT-PCR. Debido a los retrasos inherentes en grandes animales vs ratón tiempo estudia, se presentan los resultados representativos de bisonte y los tejidos bovinos del nodo de linfa para describir el curso temporal de la degradación en este tipo de tejido, en el contexto de una revisión de anterior trabajo metodológico en la degradación del RNA en otros tejidos. En general, este protocolo servirá a ambos investigadores veterinarios comenzando proyectos de transcriptoma en muestras de animales grandes y a biólogos moleculares interesados en aprender técnicas para el muestreo de tejido en vivo y en vitro procesamiento.

El uso de las consideraciones presentadas en este artículo (pasos 1-4 del Protocolo) ayudará a la recuperación del ARN de muestras animales grandes que es conveniente para un análisis posterior en estudios de expresión génica de host. Se evaluó la calidad de RNA para aplicaciones posteriores mediante varias medidas estándar. Para espectrofotometría, un260/A280 ratio proporciona una medida de la contaminación de la proteína, y un260/A230 ratio proporciona otra forma de evaluació...

Este protocolo proporciona un resumen de los procedimientos para el aislamiento de ARN para los perfiles transcriptómicos de nodo de linfa tejidos de animales grandes, incluyendo pasos en la identificación y extirpación de los ganglios linfáticos de ganado y la fauna, métodos de muestreo para proporcionar consistencia en varios animales y consideraciones más resultados representativos para la conservación de la colección y procesamiento de análisis de ARN.

Recogida y tratamiento de los ganglios linfáticos de animales grandes para el análisis de ARN: preparación para estudios de nodo de linfa transcriptómicos de grandes especies animales

Large animals (both livestock and wildlife) serve as important reservoirs of zoonotic pathogens, including Brucella, Mycobacterium bovis, Salmonella, and ...

Hola, mi nombre es Dr. Robert Schaut y soy científico en el Centro Nacional de Enfermedades Animales en Ames, Iowa. En este video de JoVE, compartiremos con usted información sobre la recolección y el procesamiento de ganglios linfáticos de animales grandes para su uso en experimentos posteriores de ARN. Por ejemplo, estos experimentos podrían incluir PCR cuantitativa en productos transcritos inversos o estudios de secuenciación de ARN de transcriptomas.Los ganglios linfáticos son muestras útiles para la evaluación de las respuestas inmunitarias del huésped, pero también pueden proporcionar una fuente de ARN de patógenos para su estudio, como en el caso de los patógenos intracelulares presentes en las células inmunitarias dentro de los ganglios linfáticos. Las muestras de animales grandes, incluyendo tanto especies de ganado como de fauna silvestre, son de interés en el estudio de las enfermedades zoonóticas. Aquí, en el Centro Nacional de Enfermedades Animales, estudiamos las infecciones del ganado con especies como la brucella abortus, que causa brucelosis en el ganado y el bisonte, y la E. Coli O157:H7 que se desprende de las huellas intestinales del ganado.También recuperaremos muestras de tejido de especies de vida silvestre, como ciervos y alces. Se puede recolectar una variedad de ganglios linfáticos de animales infectados con diferentes enfermedades. Los estudios de los tejidos de estas especies hospedadoras naturales son generalmente más relevantes para la progresión natural de la enfermedad que los modelos de ratón.Sin embargo, el proceso de recolección de tejidos de especies grandes es necesariamente más complicado que el de ratones, incluyendo el mayor retraso entre la eutanasia y la recolección de tejidos, y un mayor tamaño de los ganglios linfáticos. Aquí, presentaremos un protocolo para el aislamiento de ganglios linfáticos de animales grandes para el estudio de ARN que será informativo para los biólogos moleculares involucrados en los estudios transcriptómicos de infecciones de animales grandes, así como para los investigadores veterinarios que comienzan estudios transcriptómicos. En este video, demostraremos los procedimientos en los ganglios linfáticos para el ganado.Antes de la necropsia, recomendamos reunir los siguientes suministros específicos para el procedimiento de aislamiento de tejidos. Tubos de microfuga llenos de aproximadamente 1 ml de conservante de tejido de ARN, como RNAlater, bisturíes desechables, pinzas limpias y de autoclave, agujas de biopsia, un recipiente para objetos punzantes para bisturíes y agujas usadas, y una tabla de cortar o una bandeja desechable, según el nivel de infectividad de los materiales involucrados. En este caso, demostraremos los elementos clave del procedimiento mediante el uso de ganglios linfáticos que generalmente recolectamos del ganado.Están infectados con bacterias que causan la brucelosis. Estos son los ganglios linfáticos prescapulares y el ganglio linfático parótido. Al realizar una necropsia de animales grandes para la recuperación de ARN, es útil tener al menos tres participantes trabajando en tejidos animales.El disector uno se encargará de seccionar diferentes piezas del animal, el disector dos recuperará los ganglios linfáticos de diferentes secciones de animales en la mesa de necropsia principal, y el disector tres trabajará en una mesa separada para aislar secciones de cada ganglio linfático y transferirlas a tubos con solución conservante. Comenzaremos con la identificación y extirpación del ganglio linfático prescapular. Idealmente, la palpación de un ganglio linfático, antes de la disección, ayudará a identificar la ubicación del ganglio linfático.Aunque no siempre es posible detectarlo, el ganglio linfático prescapular suele ser palpable en un animal sano. Comience colocando al animal en decúbito lateral. Extienda el hombro moviendo la extremidad delantera hacia atrás a la altura de la rodilla.Este movimiento llevará el hombro hacia atrás y permitirá una fácil palpación del ganglio linfático. Palpa la presencia del ganglio linfático como se muestra. Una vez localizado, y con el hombro aún extendido, utiliza un bisturí o un cuchillo de necropsia para hacer una incisión en la piel a lo largo del contorno del hombro.Retrae la piel para revelar la punta de la musculatura del hombro y el cuello. A veces se observa una sección de grasa subcutánea, especialmente en animales sobrecondicionados. El ganglio linfático prescapular a menudo se encuentra con secciones de grasa subcutánea.Aquí se pueden ver las tres capas de la piel, el músculo y la grasa subcutánea. Una vez más, palpa la ubicación de un ganglio linfático. A diferencia de la grasa subcutánea, el ganglio linfático mantendrá su forma cuando se palpa.Después de localizar el ganglio linfático prescapular, diseccione cuidadosamente la grasa subcutánea y diseccione el ganglio linfático. La apariencia de estos ganglios linfáticos en el bisonte, que utilizamos en estudios de brucelosis debido a la susceptibilidad de los bisontes en el área metropolitana de Yellowstone a la brucella, es similar. Aquí, demostramos la apariencia del ganglio linfático prescapular, diseccionado del hombro derecho de un bisonte americano.A continuación pasaremos al aislamiento del ganglio linfático parótido. Con el animal en decúbito lateral, localice la articulación temporomandibular. Con un bisturí o un cuchillo de necropsia, haga con cuidado una incisión en la piel.Comience dorsal a la articulación y extiéndase verticalmente a lo largo de la línea de la mandíbula. Disecciona la piel para revelar el tejido subcutáneo. La glándula salival parótida será visible, en primer lugar, debido a su gran tamaño, apariencia superficial lobulada y coloración roja.Con fórceps y bisturí, mueva la glándula salival parótida a un lado para encontrar el ganglio linfático parótido que se encuentra justo craneal y medial a la glándula salival. Al aislar el ganglio linfático parótido, es fundamental separar el tejido de los ganglios linfáticos del tejido de la glándula salival parótida. Los tipos de tejido se ven distintos, incluso dentro de la sección transversal del tejido.Esto se puede observar aquí, con el ganglio linfático parotídeo a la izquierda y la glándula salival parótida a la derecha. Asegúrese de examinar cuidadosamente el tejido de los ganglios linfáticos parótidos para ver si tiene textura antes de continuar con el procesamiento. En algunos casos, puede ser necesario extirpar la glándula salival parótida para localizar el ganglio linfático parótido.Aquí hay un ejemplo de una glándula parótida extirpada de un novillo, en la que el ganglio linfático estaba incrustado dentro de la glándula salival y no era visible antes de la extracción de la glándula. En el manuscrito principal se proporciona información adicional sobre la identificación de los ganglios linfáticos seleccionados. Una vez que se hayan recolectado los ganglios linfáticos, estará listo para extirpar secciones para su preservación.Con un bisturí o un bisturí de necropsia, extirpa una sección del ganglio linfático y haz una incisión sagital para abrir el ganglio linfático. Examinar el interior del ganglio linfático, especialmente en ejemplares de animales infectados, buscando asimetrías, lesiones, diferencias de color, etc. En este ganglio linfático prescapular bovino, múltiples características son visibles a simple vista.Estos incluyen folículos, que albergan linfocitos B, y unidades corticales profundas, que albergan linfocitos T. Estas razones parecen más oscuras que los senos medulares, que son más claros. Aquí, se muestra otro ejemplo de un ganglio linfático no infectado.Este ganglio linfático es de un bisonte más joven. Tenga en cuenta que los folículos son menos distintos en este ejemplo. Con el fin de seccionar los tejidos para su procesamiento, una opción es recolectar pequeños trozos de tejido de cada ganglio linfático con un bisturí para la posterior recuperación del ARN.Sin embargo, uno de los principales desafíos al comparar los perfiles de expresión entre muestras es el gran tamaño de los ganglios linfáticos de animales grandes, en comparación con un ganglio linfático de ratón, que se puede extraer fácilmente entero para la extracción de ARN. Como resultado, las secciones pequeñas de tejido no capturarán uniformemente el perfil de las células a través de un ganglio linfático. En su lugar, para capturar células a través del perfil de un ganglio linfático, se extirpa una cuña en forma de pastel del ganglio linfático, se corta en trozos pequeños de no más de 5 mm de grosor y se coloca, con pinzas, en tubos que contienen ARNlater.Alternativamente, utilice metodologías de biopsia para extirpar secciones de tejido de cada ganglio linfático. Seleccione la herramienta de biopsia por punción si desea recolectar secciones específicas, como folículos específicos del ganglio, y luego transferirlos, con fórceps, a RNAlater. Una vez que las muestras se hayan transferido a RNAlater, transfiéralas nuevamente al laboratorio y almacene a 4 grados centígrados durante la noche para permitir la penetración en el tejido.Después, elimine el exceso de ARN y almacene las muestras de tejido a 80 grados centígrados. Una ventaja de usar una solución conservante de ARN es que no se requiere nitrógeno líquido en la necropsia, ni en la recolección de muestras en el campo. Antes de acceder a las muestras, pre-alícuota el reactivo de Trizol a tubos para su homogeneización.Después de que las muestras se retiren del congelador, transfiéralas inmediatamente al reactivo Trizol para su procesamiento posterior, según las recomendaciones del fabricante. Aquí, una pieza de 50-100 mg de tejido se transfiere al reactivo Trizol. Limite la descongelación antes de la adición de Trizol tanto como sea posible.El almacenamiento en hielo seco se puede utilizar cuando se retiran varias muestras del congelador para su procesamiento. Coloque los tubos en el homogeneizador y homogeneice en el reactivo Trizol. En este caso, se utiliza un ajuste de extracción de ARN de dos minutos.Cuando termine, verifique si tiene una apariencia turbia. Repita si es necesario. Siga el protocolo del fabricante para generar capas acuosas y orgánicas para cada muestra.Retire la fase acuosa clara superior con una punta de pipeta. Transfiera a un nuevo tubo de microcentrífuga. A continuación, mezcle con un volumen igual de etanol al 100%.Homogeneizar. A menudo, el tubo se verá turbio. Con una punta de micropipeta, transfiera el líquido a una columna de centrifugación comercial a base de sílice para purificar aún más y luego eluir su ARN.Para evaluar la calidad del ARN, cargue uno o dos l de la muestra de ARN eluido en un espectrofotómetro para su análisis. Después de completar el procedimiento, observamos relaciones de absorbancia de aproximadamente dos para la relación 260-280 y la relación 260-230, lo que indica una alta pureza con un arrastre químico mínimo. La contaminación por fenol sería observable a partir de una disminución en la relación de absorbancia de 260-230 nm.Durante el procedimiento de necropsia, en el caso de animales como el bisonte, observamos un período de tiempo de al menos 20 minutos entre la eutanasia y la transferencia de la primera muestra de tejido al conservante. Por el contrario, los ganglios linfáticos de ratón pueden extirparse y conservarse después de la eutanasia en cuestión de minutos. Por lo tanto, nos interesaba caracterizar el perfil de degradación de los ganglios linfáticos a lo largo del tiempo.En el manuscrito principal también compilamos un resumen de los perfiles de estabilidad del ARN en una variedad de otros tipos de tejidos que han sido probados en otras publicaciones. En experimentos representativos, realizados con ganglios linfáticos de bisonte, la estabilidad del ARN fue relativamente constante en el transcurso de una hora después de la eutanasia. Aquí, representamos una imagen en gel de ARN total purificado a partir de trozos de tejido de ganglios linfáticos supramamarios de un bisonte americano.Este hallazgo es consistente con datos previos para otros tipos de tejidos compilados a partir de la literatura. Esto sugiere que se pueden recolectar muestras de calidad aceptable para el análisis posterior de la expresión génica incluso de especies más desafiantes como el bisonte y el alce. Sin embargo, es importante tener en cuenta que los tiempos más largos entre la muerte y la conservación de la muestra pueden dar lugar a cambios en los perfiles de expresión de ARN, incluido el aumento de la degradación de tres extremos principales de las transcripciones de ARNm.Por lo tanto, sigue siendo importante utilizar un flujo de trabajo rápido y optimizado para la recuperación de tejidos con el fin de reducir más retrasos una vez que el animal está disponible para la necropsia, con el fin de lograr los perfiles de ARN más válidos biológicamente. Además, señalamos que se debe tener cuidado durante todo el procedimiento para evitar la introducción de contaminantes de ARN en las muestras durante todo el proceso, más allá de los que ya están presentes dentro de los tejidos. Esto incluye el uso de guantes como parte del resto del equipo de protección personal requerido.También alícuotas el producto final de ARN en múltiples tubos para limitar el estancamiento libre de las muestras de ARN tanto como sea posible. Por ejemplo, se pueden almacenar alícuotas separadas para su uso en pruebas de control de calidad. En resumen, en este video hemos proporcionado información importante para su uso en la identificación, recolección, muestreo representativo y procesamiento de ganglios linfáticos para el análisis de expresión génica posterior.Si bien nuestro video representativo se ha demostrado con ejemplos de ganado y bisonte, también hemos trabajado con ganglios linfáticos de otras especies grandes, incluidas cabras y alces. Esperamos que este video le resulte útil en su trabajo, ya sea que sea un científico veterinario que está considerando el uso de métodos transcriptómicos en su trabajo o un biólogo molecular interesado en aventurarse en el campo de la ciencia de los grandes animales.

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Investigación

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Immunology and Infection

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Este artículo describe un flujo de trabajo de técnicas empleadas para probar nuevos mediadores candidatos de metástasis de melanoma y sus mecanismos de acción.

Una plataforma de descubrimiento robusta para la identificación de nuevos mediadores de la metástasis del melanoma

Este protocolo describe la preparación detallada de muestras de bajo aporte para la secuenciación de un solo núcleo, incluida la disección de ganglios cervicales y estrellados superiores de ratón, disociación celular, criopreservación, aislamiento de núcleos y código de barras hashtag.

Aislamiento y multiplexación de núcleos de baja entrada con anticuerpos con códigos de barras de ganglios simpáticos de ratón para la secuenciación de ARN de un solo núcleo

Las células T e ILC2 que expresan IL-9 se inducen durante la infección por N. brasiliensis , sin embargo, su caracterización se ha pasado por alto en gran medida en el intestino infectado debido a su baja frecuencia y cinética diferencial. Este protocolo describe el aislamiento de estas células de diferentes órganos diana y la confirmación de su identidad mediante citometría de flujo en diferentes etapas de infección.

Una estrategia para el estudio de células linfoides productoras de IL-9 en el modelo de infección por Nippostrongylus brasiliensis

Este protocolo describe un procedimiento de supervivencia para una linfadenectomía renal bilateral murina segura y bien tolerada.

Linfodenectomía renal bilateral murina

Este protocolo describe un procedimiento de supervivencia para una linfadenectomía mesentérica murina segura y bien tolerada en cada una de las cuatro estaciones a lo largo de la cadena de ganglios linfáticos mesentéricos. Este procedimiento es adaptable para permitir la interrupción selectiva de la comunicación linfática con el colon distal, el colon proximal y/o el intestino delgado.

Linfodenectomía mesentérica murina por alteración selectiva de la comunicación linfática con el intestino específico de la región

Aprenda a recolectar y procesar ganglios linfáticos de animales grandes para análisis de ARN. Este protocolo estandarizado garantiza calidad en estudios transcriptómicos de ganado y fauna silvestre.

Recogida y tratamiento de los ganglios linfáticos de animales grandes para el análisis de ARN: preparación para estudios de nodo de linfa transcriptómicos de grandes especies animales (Video) | JoVE Journal

Recogida y tratamiento de los ganglios linfáticos de animales grandes para el análisis de ARN: preparación para estudios de nodo de linfa transcriptómicos de grandes especies animales

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