Name: Un sistema de Microbiomechanical para estudiar la formación de várices y recuperación en axones de la neurona Central (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Aprende a inducir várices reversibles en axones de neuronas de hipocampo mediante fluido presurizado. Este método permite estudiar la plasticidad neuronal y mecanismos de recuperación tras lesiones cerebrales.

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Todos los experimentos con animales se ha realizado según los institutos nacionales de Salud Animal uso directrices. Este trabajo fue financiado en parte por las subvenciones de los institutos nacionales de salud (R01NS093073 y R21AA024873) a C. Gu.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El procedimiento de este ensayo microbiomechanical es hacia adelante. Va a producir resultados confiables, si se realizan cuidadosamente todos sus pasos. Hay varios pasos fundamentales que, si se realiza incorrectamente, dificultará la recopilación de datos exitosa. Los pasos críticos comienzan aguas arriba de la aplicación real del estímulo que sopla. Disección cuidadosa, cultivo y cuidado de la cultura de la neurona primaria son primordiales. Si las neuronas cultivadas no son saludables, no reaccionarán, ya que podrían...

Formación de várices o inflamación o abalorios, a lo largo de los axones, es una característica prominente de la neurodegeneración observada en muchos trastornos o lesiones del sistema nervioso central, incluyendo esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y traumática cerebro lesiones1,2. A pesar de los significativos impactos fisiológicos de várices axonales en la propagación del potencial de acción y transmisión sináptica3, cómo se generan las várices se desconoce. Recientemente, usando un análisis microbiomechanical de reciente creación en neuronas hippocampal cultivadas de los roedores, encontramos que los estímulos mecánicos pueden inducir várices en estas neuronas con muy interesantes características. En primer lugar, la inducción de várices es rápida (< 10 s) y este proceso es reversible de forma inesperada. En segundo lugar, iniciación de varices depende de la fuerza que sopla a presión: cuanto mayor sea la presión, más rápido la iniciación. En tercer lugar, iniciación de varices depende de edad neuronal. Los axones de las neuronas más jóvenes aparecen más sensibles a la tensión mecánica, en comparación con los de las neuronas más viejas. En cuarto lugar, la forma de várices a lo largo de los axones de las neuronas hipocampales, dendritas y segmentos inicial del axón de estas neuronas no muestran ningún cambio bajo la misma condición que sopla. Por lo tanto, nuestro estudio reveló una característica novedosa de polaridad neuronal. Estos resultados con el sistema in vitro son fisiológicamente relevantes. Usando un modelo en vivo para lesiones traumáticas leves del cerebro (mTBI), demostramos que várices axonales desarrollaron de una manera multi-focal en la corteza somatosensorial de los ratones inmediatamente después del impacto de cierre-cráneo, consistente con nuestro en vitro resultados4. Es importante tener en cuenta que la tinción y proyección de imagen de los ratones de la LCT sólo proporcionan un tiro rápido de cambios morfológicos neuronales, desde realizar en vivo Time-lapse la proyección de imagen de morfología neuronal durante un impacto mecánico es todavía no es factible.
Este sistema de líquido soplar nos permitió no sólo para capturar características únicas asociadas con la formación de várices inducida por estrés mecánico, sino también para determinar el mecanismo subyacente. Probando diferentes soluciones extracelulares, los bloqueadores y abridores de diferentes candidatos de mechanosensitive canales del ion y electrofisiología celular, identificamos que el catión potencial transitorio del receptor canal de miembros de la subfamilia V 4 (TRPV4) canal que es permeable al Ca2 + y Na+ y activado por soplar es principalmente encargada de detectar el estrés mecánico inicial durante la formación de várices axonal4. Esto fue confirmado más con un enfoque de nocaut de siRNA. Tomados en conjunto, este nuevo sistema de análisis que hemos desarrollado con cultura de neurona del hipocampo, es muy valiosa para el estudio de las propiedades de la micromecánica de las neuronas centrales, especialmente en combinación con otras técnicas.
Este sistema de micromechanical que hemos establecido es única y difiere de los sistemas previamente existentes en varios aspectos importantes. En primer lugar, en este sistema, las neuronas experimentan estrés mecánico fuera de plano en las formas de compresión y corte. Durante el impacto mecánico, procesos neuronales permanecen adheridos a la superficie del cubreobjetos y no se mueven. Esto difiere de otros sistemas que participan principalmente de flexión y estiramiento en el plano experimental (o tensión), por ejemplo, la desviación de axones incluidas como mover cuerdas5,6 o estiramiento de axones en micropatterned canales y membranas elástica7,8. Por otra parte, aunque las várices axonales pueden ser también inducidas en estos ensayos como en nuestro sistema que sopla el fluido, el proceso en estos ajustes toma mucho más tiempo (de 10 minutos a varias horas6,7,8) y aparece irreversible. Por último, nuestro sistema usando soplar líquido local permite el examen de las características espaciales de la formación de várices (e.g., dendritas, espinas dendríticas, soma, segmentos iniciales axonales, terminales axonales), además de sus características temporales. Mediante este sistema, descubrimos varias características inesperados y únicos de la formación de várices axonal, especialmente Inicio rápido lenta reversibilidad y polaridad de axón-dendrita.
El sistema que comentaremos en este artículo es compatible con muchas de las técnicas de molecular y biología de la célula. Por ejemplo, para estudiar los efectos del estrés mecánico sobre la morfología neuronal y función, puede ser utilizado junto con cocultivo de mielina, Time-lapse de imágenes de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) y de transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) proyección de imagen de calcio y parche abrazadera grabación. En este artículo, nos centramos en los componentes del sistema. Cultura de neuronas hippocampal, líquido soplar configuración, alta resolución imágenes de Time-lapse para transporte axonal y proyección de imagen de calcio se ilustran paso a paso a continuación.

<table><tbody><tr><td>cubreobjetos de 12 mm&nbsp;</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>64-0702</td><td>para placa de 24 pocillos&nbsp;</td></tr><tr><td>cubreobjetos de 25 mm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12-545-102</td><td>para placa de 6 pocillos&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lisina</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno de cola de rata&nbsp;</td><td>Roche&nbsp;</td><td>11 179 179 001&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS&nbsp;</td><td>Diagnóstico Nacional&nbsp;</td><td>CL-253</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>K2SO4</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>P304-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP410-500</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Enzima proteasa&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4032</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>25030081</tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina 100x (P/S)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>MEM Sales de Earle&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>B27 suplemento&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Arabinosilcitosina (Ara-C)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>147-94-4</td><td></td></tr><tr><td>Medios Opti-MEM&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>1854313</td><td>reactivo de transfección&nbsp;</td></tr><tr><td>Varillas de borosilicato&nbsp;</td><td>Instrumentos de Precisión Mundial Inc.&nbsp;</td><td>PG52151-4</td><td>para pipeta de inflado&nbsp;</td></tr><tr><td>tubo de caucho &nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-169-1A</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa y émbolo de plástico de 10 cc</td><td>Becton Dickinson &nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micromanipulador&nbsp;</td><td>Instrumentos Sutter&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>S640-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>C70-500</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular (35 mm x 10 mm)</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3294</td><td></td></tr><tr><td>Sondas moleculares</td><td>Fluo-4 AM</td><td>F14201</td><td>para imágenes de calcio&nbsp;</td></tr><tr><td>Construcción Mito-YFP&nbsp;</td><td>Takara Bio Inc.&nbsp;</td><td></td><td>para la transfección celular&nbsp;</td></tr><tr><td>Construcción YFP-N1&nbsp;</td><td>Takara Bio Inc.&nbsp;</td><td></td><td>para la transfección celular&nbsp;</td></tr><tr><td>Modelo P-1000 Tirador de micropipetas Flaming/Marrón&nbsp;</td><td>Instrumentos Sutter&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse TE2000-U Mcroscope&nbsp;</td><td>Lente Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plan Fluor ELWD 20x&nbsp; &nbsp;</td><td>Objetivo</td><td>062933</td><td>Nikon&nbsp;</td></tr><tr><td>Lente de aceite Apo TIRF 100x/1.49&nbsp;</td><td>Objetivo</td><td>MRD01991</td><td>Nikon&nbsp;</td></tr></tbody></table>

un sistema de microbiomechanical para estudiar la formación de várices y recuperación en axones de la neurona central

A Microbiomechanical System for Studying Varicosity Formation and Recovery in Central Neuron Axons

Várices axonales son estructuras ampliadas a lo largo de los ejes de axones con un alto grado de heterogeneidad. Están presentes no sólo en los cerebros con lesiones o enfermedades neurodegenerativas, sino también en el cerebro normal. Aquí, describimos un sistema de micromechanical recién establecida rápidamente, confiable y reversible inducir várices axonales, lo que nos permite entender los mecanismos que regulan la formación de várices y de composición heterogénea. Este sistema representa un nuevo medio para evaluar los efectos del estrés de compresión y cizalla en diferentes compartimentos subcelulares de las neuronas, diferentes de otros sistemas en vitro que se centran principalmente en el efecto de estiramiento. Importante, debido a las características únicas de nuestro sistema, recientemente hizo un nuevo descubrimiento que demuestra que la aplicación de fluido a presión puede inducir várices axonales a través de la activación de un canal potencial de receptor transitorio rápido y reversible. Nuestro sistema biomecánico puede utilizarse convenientemente en combinación con perfusión de drogas, proyección de imagen de células vivas, proyección de imagen de calcio y parche abrazadera grabación. Por lo tanto, este método puede ser adoptado para el estudio de canales del ion mechanosensitive, regulación de transporte axonal, dinámica del citoesqueleto axonal, señalización de calcio y cambios morfológicos relacionados con traumatismo craneoencefálico.

Antes de soplar, axones normalmente muestran poca formación de várices. Siguientes soplar con la presión estándar (190 mmH2O altura), el comienzo de axones a desarrollar várices grano-como muchos. La formación de várices es parcialmente reversible, como se muestra por regiones del axón regresan a su estado pre-inflado después de un período de recuperación de 10 minutos (figura 2A-B). Después de un período de recuperación más largo ...

Este protocolo describe un acercamiento fluido fisiológicamente relevante, presurizado para la inducción rápida y reversible de las várices en las neuronas.

Un sistema de Microbiomechanical para estudiar la formación de várices y recuperación en axones de la neurona Central

Axonal varicosities are enlarged structures along the shafts of axons with a high degree of heterogeneity. They are present not only in brains with ...

El objetivo general de esta configuración de fluido presurizado es producir hinchazones repetibles y consistentes a lo largo de los axones de las neuronas cultivadas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las lesiones cerebrales, como los mecanismos detrás de los cambios morfológicos subcelulares en las neuronas después de una lesión. La principal ventaja de esta técnica es que el método produce cambios morfológicos consistentes y repetibles que se recuperan con el tiempo.Esta es una técnica muy importante que desarrollamos en el laboratorio. Esto se debe a que no solo podemos utilizar el sistema para identificar el mecanismo molecular que gobierna el cambio en la morfología de los axones inducido por el estrés mecánico como una nueva forma de plasticidad neuronal, sino también utilizar el sistema como una herramienta de cribado para identificar nuevos fármacos y la estrategia de tratamiento para la lesión cerebral leve o traumática. Para comenzar este procedimiento, coloque una o más cajas de cubreobjetos de 12 milímetros o 25 milímetros en un vaso de vidrio que contenga un 70 % de ácido nítrico e incube los cubreobjetos a temperatura ambiente durante la noche.Al día siguiente, transfiera todos los cubreobjetos a un vaso de precipitados de cuatro litros lleno de 2,5 litros de agua destilada doble. Agite el vaso de precipitados que contiene los cubreobjetos durante una hora a 100 rpm, y no olvide usar bandas elásticas para sujetar el vaso de precipitados durante el agitado. A continuación, transfiera los cubreobjetos limpios a un matraz seco con la tapa metálica.Hornee los cubreobjetos en un horno a 225 grados centígrados durante seis horas. Luego, deje que se enfríen a temperatura ambiente y guárdelos en un recipiente de plástico esterilizado hasta su uso. Ahora, coloque un cubreobjetos en cada pocillo de una placa de 24 pocillos.Agregue 30 microlitros de solución de recubrimiento en un cubreobjetos de 12 milímetros y gírelo. Luego, agregue un mililitro de PBS estéril a cada pocillo. La placa puede utilizarse inmediatamente o almacenarse a cuatro grados centígrados en un PBS estéril durante un máximo de una semana.El día de la disección, retire el PBS de la placa. Seque al aire y coloque la placa bajo luz ultravioleta durante dos a cuatro horas. Para disociar las neuronas del hipocampo para el cultivo, descongele la solución de la enzima proteasa y precaliente el medio de siembra a 37 grados Celsius.A continuación, enjuague el hipocampo disecado con SLDS. A continuación, retíralo y añade dos mililitros de solución de enzima proteasa e incuba la muestra a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Después, lave los explantes del hipocampo con cinco a 10 mililitros de medio de siembra dos veces y agregue cinco mililitros de medio de siembra.Disociar los explantes del hipocampo en células individuales generando un pequeño vórtice utilizando una pipeta con una punta de plástico de un mililitro. Pipetear hacia arriba y hacia abajo unas 40 veces, evitando la formación de burbujas de oxígeno hasta que la solución se vuelva turbia y no queden trozos grandes de explante. A continuación, centrifuga las células a 1,125 veces la gravedad durante tres minutos.Retire el sobrenadante con las células sumergidas en medio y vuelva a suspender las células en 145 mililitros de medio de siembra. Luego, agregue un mililitro de la suspensión celular por pocillo a una placa de 24 pocillos. Incubar las células en el medio de siembra a 37 grados centígrados durante dos a cuatro horas.Luego, retire el medio de recubrimiento y reemplácelo con un medio de mantenimiento nuevo. Después de dos días, reemplace la mitad del medio con dos RSC micromolares disueltos en el medio de mantenimiento para inhibir el crecimiento de células fibrobladas, endoteliales y gliales. Luego, después de exponer las células a RSC durante dos días, reemplace el medio con medio de mantenimiento nuevo.Para transfectar la visualización de la morfología celular, diluya el constructo de stock a un microgramo por microlitro en medio y vórtice Opti-MEM. A continuación, diluya el reactivo de transfección mediado por liposomas en medios Opti-MEM y vórtice. Posteriormente, prepare una dilución de construcción y una dilución de transfección para cada pozo.A continuación, prepare una mezcla uno a uno del constructo y el medio Opti-MEM y el reactivo de transfección y el medio Opti-MEM y el vórtice. Incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después de 20 minutos, retire la mitad del medio de cada pocillo y transfiera este medio a un tubo cónico limpio.Mantenga el tubo en la incubadora, luego agregue 100 microlitros de la mezcla preparada en el paso anterior al medio restante en el pozo. Deje que las células se incuben a 37 grados centígrados durante 20 a 30 minutos. Durante la incubación, agregue un volumen de medio de mantenimiento fresco al medio en el tubo cónico y coloque la mezcla en la misma incubadora.Después de la incubación, retire los medios que contienen la solución de transfección de los pocillos y reemplácela con la mezcla uno a uno de medio de mantenimiento viejo y fresco en el tubo cónico. En este procedimiento, inserte la pipeta en la tapa de rosca del micromanipulador para mantenerla en su lugar. Atornille el tornillo metálico de punta plana fijado al brazo del micromanipulador de modo que sujete el extremo no tirado de la pipeta justo por encima de donde está unido el tubo de goma.Incline la pipeta en un ángulo de 45 grados con la superficie de la neurona que contiene los cubreobjetos. Encienda el filtro de florescencia. Abra la apertura y asegúrese de que se pueda ver un punto fluorescente que atraviesa el objetivo.Con el micromanipulador, mueva la pipeta a una posición que alinee la punta con el punto fluorescente y baje la pipeta a una posición justo por encima de la altura de la placa de cultivo celular. Una vez que esté en posición, encienda la luz transmitida y apague la florescencia. Con unas pinzas, transfiera un cubreobjetos con las células orientadas hacia la pipeta de la placa de cultivo celular a la placa de cultivo celular que contiene 2 mililitros de tampón de Hank a temperatura ambiente.Con la perilla de enfoque fino y el objetivo de 20 pliegues, enfoque en un plano a unas cuatro vueltas completas por encima de las celdas. A continuación, utilice el micromanipulador para colocar la punta de la pipeta de forma que quede enfocada y en el centro del lado izquierdo del plano visto a través de los oculares. Una vez que la pipeta esté en posición, enfoque el microscopio en un plano que contenga la región de interés.En las imágenes de siete div, las neuronas del hipocampo de ratón transfectadas con GFP mostraron un pre y post hinchamiento del axón, así como un período de recuperación de 10 minutos. Aquí está el Zimógrafo de imágenes de lapso de tiempo de la misma neurona. Las flechas rojas indican las várices que se han formado después de 150 segundos de resoplado de 190 mililitros de H2O, a partir de los 30 segundos.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres horas si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el registro de células completas, las imágenes FRET y TIRF de lapso de tiempo y las imágenes de calcio para responder preguntas adicionales como los impactos del estrés mecánico en la señalización neuronal, eléctrica y de calcio, el tráfico de proteínas y las interacciones. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en la lesión cerebral fototraumática explicaran los mecanismos moleculares que subyacen a la formación de varicosidad axonal en neuronas vivas.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar los experimentos para estudiar las mecanosensaciones de las neuronas centrales.

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Investigación

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