Un sistema de Microbiomechanical para estudiar la formación de várices y recuperación en axones de la neurona Central

El objetivo general de esta configuración de fluido presurizado es producir hinchazones repetibles y consistentes a lo largo de los axones de las neuronas cultivadas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las lesiones cerebrales, como los mecanismos detrás de los cambios morfológicos subcelulares en las neuronas después de una lesión. La principal ventaja de esta técnica es que el método produce cambios morfológicos consistentes y repetibles que se recuperan con el tiempo.

Esta es una técnica muy importante que desarrollamos en el laboratorio. Esto se debe a que no solo podemos utilizar el sistema para identificar el mecanismo molecular que gobierna el cambio en la morfología de los axones inducido por el estrés mecánico como una nueva forma de plasticidad neuronal, sino también utilizar el sistema como una herramienta de cribado para identificar nuevos fármacos y la estrategia de tratamiento para la lesión cerebral leve o traumática. Para comenzar este procedimiento, coloque una o más cajas de cubreobjetos de 12 milímetros o 25 milímetros en un vaso de vidrio que contenga un 70 % de ácido nítrico e incube los cubreobjetos a temperatura ambiente durante la noche.

Al día siguiente, transfiera todos los cubreobjetos a un vaso de precipitados de cuatro litros lleno de 2,5 litros de agua destilada doble. Agite el vaso de precipitados que contiene los cubreobjetos durante una hora a 100 rpm, y no olvide usar bandas elásticas para sujetar el vaso de precipitados durante el agitado. A continuación, transfiera los cubreobjetos limpios a un matraz seco con la tapa metálica.

Hornee los cubreobjetos en un horno a 225 grados centígrados durante seis horas. Luego, deje que se enfríen a temperatura ambiente y guárdelos en un recipiente de plástico esterilizado hasta su uso. Ahora, coloque un cubreobjetos en cada pocillo de una placa de 24 pocillos.

Agregue 30 microlitros de solución de recubrimiento en un cubreobjetos de 12 milímetros y gírelo. Luego, agregue un mililitro de PBS estéril a cada pocillo. La placa puede utilizarse inmediatamente o almacenarse a cuatro grados centígrados en un PBS estéril durante un máximo de una semana.

El día de la disección, retire el PBS de la placa. Seque al aire y coloque la placa bajo luz ultravioleta durante dos a cuatro horas. Para disociar las neuronas del hipocampo para el cultivo, descongele la solución de la enzima proteasa y precaliente el medio de siembra a 37 grados Celsius.

A continuación, enjuague el hipocampo disecado con SLDS. A continuación, retíralo y añade dos mililitros de solución de enzima proteasa e incuba la muestra a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Después, lave los explantes del hipocampo con cinco a 10 mililitros de medio de siembra dos veces y agregue cinco mililitros de medio de siembra.

Disociar los explantes del hipocampo en células individuales generando un pequeño vórtice utilizando una pipeta con una punta de plástico de un mililitro. Pipetear hacia arriba y hacia abajo unas 40 veces, evitando la formación de burbujas de oxígeno hasta que la solución se vuelva turbia y no queden trozos grandes de explante. A continuación, centrifuga las células a 1,125 veces la gravedad durante tres minutos.

Retire el sobrenadante con las células sumergidas en medio y vuelva a suspender las células en 145 mililitros de medio de siembra. Luego, agregue un mililitro de la suspensión celular por pocillo a una placa de 24 pocillos. Incubar las células en el medio de siembra a 37 grados centígrados durante dos a cuatro horas.

Luego, retire el medio de recubrimiento y reemplácelo con un medio de mantenimiento nuevo. Después de dos días, reemplace la mitad del medio con dos RSC micromolares disueltos en el medio de mantenimiento para inhibir el crecimiento de células fibrobladas, endoteliales y gliales. Luego, después de exponer las células a RSC durante dos días, reemplace el medio con medio de mantenimiento nuevo.

Para transfectar la visualización de la morfología celular, diluya el constructo de stock a un microgramo por microlitro en medio y vórtice Opti-MEM. A continuación, diluya el reactivo de transfección mediado por liposomas en medios Opti-MEM y vórtice. Posteriormente, prepare una dilución de construcción y una dilución de transfección para cada pozo.

A continuación, prepare una mezcla uno a uno del constructo y el medio Opti-MEM y el reactivo de transfección y el medio Opti-MEM y el vórtice. Incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después de 20 minutos, retire la mitad del medio de cada pocillo y transfiera este medio a un tubo cónico limpio.

Mantenga el tubo en la incubadora, luego agregue 100 microlitros de la mezcla preparada en el paso anterior al medio restante en el pozo. Deje que las células se incuben a 37 grados centígrados durante 20 a 30 minutos. Durante la incubación, agregue un volumen de medio de mantenimiento fresco al medio en el tubo cónico y coloque la mezcla en la misma incubadora.

Después de la incubación, retire los medios que contienen la solución de transfección de los pocillos y reemplácela con la mezcla uno a uno de medio de mantenimiento viejo y fresco en el tubo cónico. En este procedimiento, inserte la pipeta en la tapa de rosca del micromanipulador para mantenerla en su lugar. Atornille el tornillo metálico de punta plana fijado al brazo del micromanipulador de modo que sujete el extremo no tirado de la pipeta justo por encima de donde está unido el tubo de goma.

Incline la pipeta en un ángulo de 45 grados con la superficie de la neurona que contiene los cubreobjetos. Encienda el filtro de florescencia. Abra la apertura y asegúrese de que se pueda ver un punto fluorescente que atraviesa el objetivo.

Con el micromanipulador, mueva la pipeta a una posición que alinee la punta con el punto fluorescente y baje la pipeta a una posición justo por encima de la altura de la placa de cultivo celular. Una vez que esté en posición, encienda la luz transmitida y apague la florescencia. Con unas pinzas, transfiera un cubreobjetos con las células orientadas hacia la pipeta de la placa de cultivo celular a la placa de cultivo celular que contiene 2 mililitros de tampón de Hank a temperatura ambiente.

Con la perilla de enfoque fino y el objetivo de 20 pliegues, enfoque en un plano a unas cuatro vueltas completas por encima de las celdas. A continuación, utilice el micromanipulador para colocar la punta de la pipeta de forma que quede enfocada y en el centro del lado izquierdo del plano visto a través de los oculares. Una vez que la pipeta esté en posición, enfoque el microscopio en un plano que contenga la región de interés.

En las imágenes de siete div, las neuronas del hipocampo de ratón transfectadas con GFP mostraron un pre y post hinchamiento del axón, así como un período de recuperación de 10 minutos. Aquí está el Zimógrafo de imágenes de lapso de tiempo de la misma neurona. Las flechas rojas indican las várices que se han formado después de 150 segundos de resoplado de 190 mililitros de H2O, a partir de los 30 segundos.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres horas si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el registro de células completas, las imágenes FRET y TIRF de lapso de tiempo y las imágenes de calcio para responder preguntas adicionales como los impactos del estrés mecánico en la señalización neuronal, eléctrica y de calcio, el tráfico de proteínas y las interacciones. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en la lesión cerebral fototraumática explicaran los mecanismos moleculares que subyacen a la formación de varicosidad axonal en neuronas vivas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar los experimentos para estudiar las mecanosensaciones de las neuronas centrales.