Un método para la medición de la función de la glándula salival en ratones

El objetivo general de este procedimiento es recolectar y medir de manera precisa y reproducible la saliva del ratón después de la estimulación con pilocarpina. Medir la producción de saliva en roedores es un procedimiento desafiante y propenso a una alta variabilidad. Este método es simple y se puede repetir en el mismo animal en los múltiples puntos de tiempo de todo el estudio.

Este método no solo puede medir el volumen de la saliva producida, sino que también se puede utilizar para recolectar la saliva para un análisis posterior de las moléculas bioactivas que pueden secretarse en la saliva. En última instancia, esto será de gran utilidad cuando se investigue el síndrome de Sjögren, la fibrosis de las glándulas salivales o la regeneración de las glándulas salivales en sistemas modelo de roedores. Para este procedimiento, haga preparar y congelar alícuotas de clorhidrato de pilocarpina, de no más de tres meses de antigüedad.

No vuelva a congelar las alícuotas descongeladas. Comience preparando tubos de microfuga de 0,6 mL. Perfora con cuidado un pequeño agujero en la parte inferior de los tubos con una aguja caliente de calibre 18.

Haz un tubo por ratón. Luego, coloque estos tubos en tubos de 2 ml. La esterilidad no es una preocupación.

A continuación, utilizando métodos asépticos, corte los hisopos absorbentes cilíndricos en longitudes de dos centímetros. Luego, corta cada pieza de dos centímetros en diagonal para hacer dos hisopos de forma cónica. Coloque un hisopo cónico en cada uno de los tubos de microfuga preparados.

A continuación, pesa cada tubo de 0,6 ml con su hisopo seco. Ahora, transfiera los ratones para el estudio a una nueva jaula limpia. Pueden estar alojados juntos.

Durante las próximas dos horas, dales agua helada, pero nada de comida. Justo antes de que finalice el período de dos horas, prepare la solución de pilocarpina en funcionamiento diluyendo una alícuota de 100x stock en solución salina estéril hasta 1x. Agita el tubo y mantén la solución en hielo.

Para empezar, pesa cada ratón para calcular las dosis. Luego, anestesiar a los ratones con inyecciones intraperitoneales de ketamina más xilacina. Si después de cuatro minutos un ratón no está anestesiado, ajuste la dosis.

Ahora, aplique un ungüento tálmico en ambos ojos para evitar que se sequen. A continuación, administre la dosis calculada de pilocarpina al ratón mediante una vía intraperitoneal y ajuste el temporizador a dos minutos. Durante este intervalo de dos minutos, inserte el mouse en un tubo de restricción de 50 ml, de modo que solo sobresalgan la cabeza y las orejas.

Coloque el tubo en un ángulo de 45 grados, con la cabeza del ratón hacia abajo y la superficie ventral hacia arriba. Luego, asegure el tubo con cinta adhesiva. Justo después de los dos minutos, levante la mandíbula inferior para abrir la boca e inserte suavemente una pinza de disección cerrada, de uno a dos milímetros en la boca.

Asegúrese de que la lengua esté apoyada en el brazo superior de las pinzas. Con la otra mano, use un par de pinzas finas para sostener el hisopo seco previamente pesado cerca de su punta cónica. A continuación, deslice suavemente la punta cónica del hisopo en la boca y retire las pinzas dejando la punta del hisopo en la cavidad oral.

Ahora, agarre y gire el hisopo hasta que haga el máximo contacto con la boca y para que no se caiga. El extremo ancho del hisopo debe permanecer fuera de la boca. Mantenga el hisopo en esta posición durante quince minutos.

Después de quince minutos, gire suavemente el hisopo para recoger la saliva que no se haya absorbido. A continuación, transfiera el hisopo empapado en saliva al tubo de microfuga de 0,6 ml. Tape el tubo y colóquelo en el tubo de 2 ml, colocado sobre hielo.

Ahora, transfiera el mouse de nuevo a una jaula de recuperación. Proporciónale gel dietético o gránulos de comida humedecidos en la jaula para ayudarlo a rehidratarse. También se puede administrar una inyección subcutánea de solución salina isotónica de 0,2 mL para acelerar la recuperación.

Después de recolectar todas las muestras de saliva, péselas para determinar la masa de saliva recolectada. Corte las tapas de los tubos de 2 ml que contienen el tubo más pequeño de muestra de saliva y luego cárguelas en una centrífuga refrigerada y gírelas durante dos minutos a 7.500 g y a cuatro grados centígrados. La saliva se acumulará en el tubo de dos ml.

A continuación, mida los volúmenes de las muestras con una micropipeta. La producción de saliva se midió en ratones hembra C57 de once semanas de edad utilizando el método descrito. Con la dosis de 1 microgramo de pilocarpina por gramo de peso corporal, algunos de los ratones comenzaron a mostrar signos de angustia.

Hubo una buena relación dosis-respuesta entre la pilocarpina y la producción de saliva. También hubo una concordancia significativa entre el peso y el volumen de la saliva. Utilizando la técnica descrita, se encontraron diferencias entre cepas en la saliva.

La cepa de ratones 129 S6 produjo la menor cantidad de saliva. En un experimento para detectar la hipofunción de las glándulas salivales, se inyectaron lipopolisacáridos para activar una respuesta inmunitaria innata. Durante la respuesta, los ratones produjeron menos saliva.

Otra táctica para inducir la hipofunción de las glándulas salivales fue inyectar a los ratones un alumbre adyuvante más anticuerpos anti-Ro52. El control del vehículo se trató solo con alumbre. Esto también fue detectable con la técnica descrita.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir de manera precisa y reproducible la producción de saliva en ratones. Una vez dominados, se pueden evaluar diez ratones en unas dos horas y media. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe ser extremadamente constante en cada paso, desde las inyecciones intraperitoneales hasta la colocación del hisopo y el manejo de los intervalos de tiempo para cada paso.

No hay que olvidar que el clorhidrato de pilocarpina actúa sobre el sistema cardiovascular, provocando bradicardia e hipotensión. Por lo tanto, la inyección de pilocarpina en los ratones debe hacerse con cuidado.