Aislamiento de mastocitos de peritoneo derivado y su caracterización funcional con Ca^{2 +}-proyección de imagen y pruebas de degranulación

Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización intracelular en células excitables, como qué canales iónicos son críticos para la activación de las células inmunitarias y la liberación de mediadores. Las principales ventajas de estas técnicas son su relativa simplicidad y la posibilidad de análisis simultáneo de un gran número de células. Kathrin Ohlenschlager, estudiante de posgrado de mi laboratorio, hará una demostración de imágenes de calcio Fura-2 en mastocitos.

Para comenzar este procedimiento, rocíe el ratón sacrificado con etanol al 70% y fíjelo en un bloque de espuma con el lado dorsal hacia abajo con alfileres. Con unas tijeras de filo romo, retire la piel sobre el abdomen del ratón y evite dañar la cavidad peritoneal. A continuación, inyecte siete mililitros de medio RPMI helado en la cavidad peritoneal insertando una aguja de calibre 27 con cuidado en el peritoneo.

No perfore ningún órgano y use un punto en la región de la grasa del epidídimo para reducir el riesgo de perforación de un órgano. Después de la inyección, agite el ratón durante un minuto para separar las células peritoneales en el medio RMPI. No agite el ratón con demasiada fuerza para evitar dañar los órganos internos y contaminar la cavidad peritoneal con la sangre.

Luego, reutilice la jeringa equipándola con una nueva cánula de calibre 20. Mueva los órganos internos hacia un lado inclinando el bloque de espuma y golpeándolo suavemente en el banco para facilitar la aspiración media desde el otro lado. Posteriormente, inserte un bisel de aguja de calibre 20 para aspirar el líquido del abdomen suave y lentamente para evitar la obstrucción de los órganos internos.

Recoja la mayor cantidad de líquido posible. Luego, retire la aguja de la jeringa y transfiera la suspensión celular recolectada en un tubo de recolección sobre hielo. Deseche un tubo de muestra si hay contaminación sanguínea visible.

Centrifugar el tubo con suspensión de célula limpia a 300 g durante cinco minutos. Bajo una campana estéril, aspirar el sobrenadante. Vuelva a suspender los gránulos de muestra en medio PMC frío y transfiera la suspensión celular a un matraz de cultivo celular de 25 centímetros cuadrados.

Posteriormente, agregue los factores de crecimiento IL-3 y SCF a las concentraciones finales de 10 nanogramos por mililitro y 30 nanogramos por mililitro, respectivamente. Incubar las células durante aproximadamente 48 horas a 37 grados centígrados hasta el próximo procedimiento. De los días 12 a 15, si se planea algún experimento con estimulación de los receptores de IgE plasmalemamal, se deben tratar previamente las células durante la noche con 300 nanogramos por mililitro de IgE anti-DNP en un medio de cultivo estándar.

Para preparar la imagen de Fura-2, diluya la solución madre de Fura-2, AM en HBSS de calcio hasta una concentración final de cinco micromolares para preparar el tampón de carga. A continuación, mezcle 500 microlitros del tampón de carga con 500 microlitros de la suspensión de celdas PMC. Pipetear la mezcla en la cámara de imágenes e incubar las células durante 20 a 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.

Configurar el sistema de aplicación por gravedad con diferentes soluciones según el protocolo de estimulación. A continuación, monte el sistema de aplicación en la platina del microscopio invertido. Prepare un objetivo de inmersión en aceite de alta apertura 40X colocando una pequeña gota de aceite de inmersión sobre él.

Coloque la cámara de imágenes con las celdas cargadas en el sistema de aplicación y asegúrela para evitar movimientos durante la grabación. Luego, encienda la luz transmitida y concéntrese en las celdas. A continuación, inicie el programa de adquisición de imágenes en el modo de adquisición fisiológica.

Abra la ventana de configuración y ajuste el enfoque y el tiempo óptimo de adquisición. Cree una imagen de referencia y marque las celdas como ROI. Marque el último ROI en un área donde no haya celdas presentes y defínalo como el fondo.

Luego, complete la configuración e inicie la medición con una velocidad de adquisición de cinco segundos. A continuación, agregue soluciones en el número de ciclo adecuado de acuerdo con el diseño del experimento. Para medir la elevación de la concentración de calcio intracelular inducida por el antígeno, aplique la solución de dos jeringas después del ciclo 20 y deje de registrar después del ciclo 150.

Para medir la elevación de la concentración de calcio intracelular inducida por el compuesto 48/80, aplique la solución de jeringa-tres después del ciclo 20 y detenga el registro después del ciclo 150. Para medir la elevación de la concentración de calcio intracelular evocada por SOCE, aplique la solución de jeringa cuatro después del ciclo 10, aplique la solución de jeringa cinco después del ciclo 70, aplique la solución de jeringa cuatro después del ciclo 120, aplique la solución de jeringa una después del ciclo 150 y detenga el registro después del ciclo 220. En el programa de adquisición, presione consecutivamente los botones Iniciar cortador, Marcar todo, Convertir todo, Mediciones de fisiología, OK y luego OK nuevamente.

Guarde los archivos como tablas y pilas de imágenes para analizarlos sin conexión. Para medir la liberación de beta-hexosaminidasa, transfiera 100 microlitros de la suspensión celular por pocillo a una placa de pocillo de fondo en V de 96 pocillos. Agregue 25 microlitros de solución de estimulación o control a cada pocillo.

Luego, incuba las células durante 45 minutos a 37 grados centígrados. Después, detenga la reacción colocando la placa de 96 pocillos en hielo durante cinco minutos. A continuación, centrifugar la placa a cuatro grados centígrados durante cuatro minutos a 120 g.

Transfiera 120 microlitros del sobrenadante a una placa de fondo plano de 96 pocillos y colóquela sobre hielo. Evite cuidadosamente tocar los gránulos de celdas, pero aspire completamente el sobrenadante. A continuación, agregue 125 microlitros de tampón de lisis a los gránulos de celdas.

Incubar los gránulos de células durante cinco minutos a temperatura ambiente y volver a suspenderlos después de la incubación mediante pipeteo repetido. Pipetee 25 microlitros de la solución pNAG de cuatro milimolares en los pocillos requeridos de una nueva placa de fondo plano de 96 pocillos. Añada 25 microlitros de cada sobrenadante y 25 microlitros de cada célula lisada por separado a la solución de pNAG preparada.

Incubar los lotes de reacción durante una hora a 37 grados centígrados. Después de la incubación, pipetee 150 microlitros de solución de parada en cada pocillo para detener la reacción. A continuación, analice la absorbancia de luz de la muestra de placa con un lector de microplacas a 405 nanómetros con referencia de 630 nanómetros para la sustracción automática del fondo.

En el programa de adquisición, marque la casilla Referencia y, en el menú de elementos del programa de absorbancia, seleccione 630 nanómetros para la sustracción automática de fondo. Se realizó un ensayo de liberación de beta-hexosaminidasa para probar la capacidad de las PMC aisladas que se someten a degranulación tras la reticulación de los receptores de alta afinidad de IgE en plasma o la estimulación de los receptores Mrg PRB2. Las células se añadieron a una placa de 96 pocillos con fondo en V y se estimularon de acuerdo con este esquema durante 45 minutos a 37 grados Celsius.

Después de la centrifugación y la eliminación del sobrenadante, los gránulos se lisaron. A continuación, se analizó el contenido de beta-hexosaminidasa de los sobrenadantes individuales y de los lisados de pellets mediante sus reacciones con pNAG durante una incubación de una hora a 37 grados centígrados. La cantidad de los productos de reacción se detectó colorimétricamente y se calculó el porcentaje de beta-hexosaminidasa liberada.

La liberación espontánea fue muy baja, mientras que las respuestas a estímulos de degranulación fuertes, como la ionomicina de 10 micromolares y el compuesto 48/80 a 50 microgramos por mililitro, fueron superiores al 40% y al 60% respectivamente. Las respuestas de degranulación a la estimulación de DNP fueron dependientes de la dosis en el rango de concentración de 10 a 300 miligramos por mililitro. En conjunto, estos datos indican claramente un buen estado funcional de las PMC aisladas.

Con esta técnica, se obtiene una población de alta pureza de mastocitos maduros de tejido conectivo murino derivados del peritoneo en dos semanas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener condiciones estériles durante el aislamiento y el cultivo de la célula para evitar la contaminación bacteriana. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como las mediciones electrofisiológicas de la corriente iónica de fijación en parche, con el fin de responder a preguntas adicionales sobre las vías de entrada de calcio en los mastocitos.

Después de su desarrollo, la técnica de imagen de calcio intracelular Fura-2 allanó el camino para que los investigadores en el campo de la fisiología de células masivas exploraran la dependencia del calcio de la degranulación de mastocitos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar experimentos de imágenes de calcio Fura-2 y el ensayo de degranulación de beta-hexosaminidasa con mastocitos. No olvide que trabajar con radiación UV puede ser peligroso para los ojos y la piel, y se debe evitar la exposición innecesaria mientras se realiza este procedimiento.