Combinando Optogenetics con microRNAs artificiales para caracterizar los efectos de Gene caída en la función presináptica en circuitos neuronales intactas

El objetivo general de combinar la interferencia de ARN mediada por microARN artificial con la optogenética es caracterizar el efecto de la eliminación de genes en la función presináptica dentro de circuitos neuronales intactos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la fisiología sináptica, como abordar el papel fisiológico de las proteínas presinápticas en los circuitos cerebrales intactos. La principal ventaja de esta técnica es que permite monitorizar selectivamente la transmisión sináptica en neuronas con expresión reducida de la proteína presináptica objeto de investigación.

Además, hemos utilizado este método para investigar la función presináptica en cortes agudos de cerebro. También se puede aplicar para manipular y sondear la seguridad neuronal in vivo. La demostradora del procedimiento estará a cargo de Carmela Vitale, estudiante de posgrado de nuestro laboratorio.

Después de diseñar los microARN y construir un vector recombinante para expresar los microARN y la sonda optogenética, prepare cultivos neuronales primarios de la región cerebral de interés. Para ello, siga un protocolo de ocultación de cortticas establecido por L.A.Cingolani and Company con las siguientes modificaciones. Primero, use placas de seis pocillos, coloque medio millón de neuronas por pocillo y use 2,5 mililitros de medio de fijación por pocillo.

Después de incubar la placa durante cuatro horas, cambie a 3,3 mililitros de medio de mantenimiento por pocillo y, si se observa un crecimiento excesivo de astrocitos, agregue 0,5 mililitros de medio de mantenimiento suplementado con 7,5 micromolares de AraC a tres o cuatro DIV. Con cinco o seis DIV, infecte tres pocillos por cada microARN que se va a analizar. Utilice la dosis infecciosa más baja que infecte al menos el 99% de las neuronas.

Agregue el virus directamente a las neuronas, mezcle suavemente y vuelva a colocar las placas en la incubadora a 37 grados centígrados. A 17 a 18 DIV, lisar las neuronas para una extracción de ARN. Incline las placas y use pipetas de vidrio para eliminar todo el medio de cada pocillo.

Luego, agregue inmediatamente 700 microlitros de reactivo de lisis a cada pocillo. Después de una breve mezcla, transfiera el lisado celular fuera de cada pocillo y colóquelo en tubos separados de 1,5 mililitros. A continuación, añade 140 microlitros de cloroformo a cada lisado.

Tape y agite rápidamente los tubos vigorosamente durante 15 segundos para emulsionar el contenido. A continuación, centrifuga los tubos a 12.000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Luego, transfiera con cuidado la fase acuosa superior que contiene ARN a un nuevo tubo.

No permita que la punta de la pipeta toque la fase orgánica. A la fase acuosa añadir 1,5 volúmenes de etanol al 100% y pipetear la solución lentamente tres veces para mezclar. A continuación, purifique el ARN con un kit disponible en el mercado y cuantifique los rendimientos.

Espere al menos 3,5 microgramos por muestra. Las proporciones de pureza sobre las proteínas y los compuestos orgánicos deben ser de al menos 1,9. A continuación, utilice un kit para retrotranscribir 250, 500 o 1.000 nanogramos de ARN.

A continuación, cuantifique la eficiencia de derribo del gen endógeno de interés mediante RTPCR cuantitativo. Apunte a una eficiencia de derribo de al menos el 60%Para este protocolo, use un animal que 15 días antes o más haya tenido RAAV12 inyectado en el cerebro de acuerdo con un protocolo publicado previamente por A.Cetin and Company. Aísle el cerebro y haga cortes agudos de cerebro con un vibratomo y ACFF helado gaseado.

Recoja las rodajas de la región de interés y minimice su exposición a la luz para evitar la activación de la sonda optogenética. Deje que las rodajas se recuperen durante 30 minutos a 37 grados centígrados en el mismo ACFF. Use una cámara diseñada específicamente para sostener cortes de cerebro.

Luego, regrese las rodajas a temperatura ambiente, donde permanecerán saludables durante seis a ocho horas. Para continuar, transfiera una rebanada a la cámara de grabación y superfúndala a dos mililitros por minuto de ACFF. A continuación, compruebe brevemente la señal del indicador fluorescente expresado para determinar la localización y la intensidad de la infección.

Luego, llene un electrodo de parche con la solución intracelular. Ahora, bajo iluminación infrarroja, se obtiene una configuración hermética al por mayor en una neurona que recibe entradas sinápticas de las neuronas infectadas. La resistencia en serie puede dejarse sin compensar, pero debe ser constante y baja.

Por ejemplo, si las neuronas piramidales CA3 estaban infectadas, se colocan un parche en las neuronas piramidales en el tracto proximal y medial de la región CA1. Cuando las células comienzan a verse encogidas o hinchadas, cuando la aplicación de parches se vuelve difícil o los lotes son inestables, entonces las porciones seleccionadas ya no están lo suficientemente sanas como para registrar. A continuación, utilice la farmacología para aislar las corrientes sinápticas que se están investigando.

Por ejemplo, si el objetivo es investigar la transmisión sináptica excitatoria, bloquee la transmisión sináptica inhibitoria añadiendo bicuculina al baño. A continuación, evoca las corrientes sinápticas, como las corrientes postsinápticas excitatorias, utilizando un láser azul de 473 nanómetros acoplado a una fibra óptica colocada en el somata de las neuronas infectadas. No dirija el láser sobre los axones de las neuronas.

Por ejemplo, evite arrojar luz sobre los colaterales de Shaffer. La despolarización directa de los axones no es deseable. A continuación, ajuste la duración de la estimulación al mínimo para reducir la posibilidad de evocar más de un potencial de acción por pulso de luz.

A continuación, refina la intensidad del láser para evocar una corriente sináptica pequeña pero claramente detectable. Por ejemplo, para la transmisión sináptica excitatoria entre las neuronas piramidales CA3 y CA1, ajuste la intensidad del láser para evocar corrientes sinápticas de 20 a 50 picoamperios. Al final del experimento, aplique tetrodotoxina a 0,5 micromolares para bloquear los canales de sodio.

La sensibilidad de las corrientes evocadas ópticamente a la tetrodotoxina indica que están impulsadas por el potencial de acción. Continúe recopilando datos hasta que al menos ocho neuronas hayan sido parcheadas para una condición determinada de al menos tres animales diferentes. Estos son los datos mínimos necesarios para analizar los resultados.

Utilizando el método descrito, se eliminaron las isoformas de empalme alternativas de los canales de calcio presinápticos dependientes de voltaje de tipo P/Q. Se cree que estos canales regulan la plasticidad sináptica a corto plazo en las sinapsis excitadoras de CA3 a CA1. Se realizaron cuatro construcciones diferentes que expresan microARN específicos de isoformas; cada uno se expresó junto con un canal ultrarrápido rodopsina junto con la proteína fluorescente Td-Tomato.

En primer lugar, se confirmó que cada constructo tenía suficiente eficiencia de derribo y selectividad en cultivos neuronales primarios de rata utilizando RTPCR cuantitativo específico de isoformas. A continuación, cada constructo se inyectó en el hipocampo de ratas P18. En última instancia, se investigó el efecto de las construcciones sobre la plasticidad sináptica a corto plazo en las sinapsis CA3 a CA1 estimulando neuronas piramidales CA3 infectadas con breves pulsos de luz de 473 nanómetros y registrando las EPSC resultantes en configuración mayorista a partir de neuronas piramidales de la región CA1.

La caída de diferentes isoformas de empalme afectó las respuestas a la estimulación de pulso emparejada en direcciones opuestas. La eliminación de la isoforma A impulsó la facilitación del pulso emparejado; mientras que la eliminación de la isoforma B la abolió. La combinación de la optogenética de interferencias de ARN permite que la investigación en el campo de la fisiología sináptica explore cómo las proteínas presinápticas regulan la plasticidad sináptica a corto plazo en circuitos intactos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo validar los microARN para la interferencia de ARN y cómo combinarlos con la optogenética para investigar la transmisión sináptica en cortes agudos de cerebro.