Name: Combinando Optogenetics con microRNAs artificiales para caracterizar los efectos de Gene caída en la función presináptica en circuitos neuronales intactas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprende a combinar microRNAs artificiales con optogenética para caracterizar el efecto del silenciamiento génico en la función presináptica. Este método permite investigar la transmisión sináptica en circuitos neuronales intactos de rebanadas cerebrales agudas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Agradecemos a F. Benfenati (Istituto Italiano di Tecnologia, IIT) para apoyo y Carmela Vitale para ayudar con la demostración. Este trabajo fue financiado por el IIT y la Compagnia San Paolo (beca Nº 9734 a LAC).

<ol><li>Lam, J. K., Chow, M. Y., Zhang, Y., Leung, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA+Versus+miRNA+as+Therapeutics+for+Gene+Silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther-Nucl+Acids%22%5BJournal%5D)">siRNA Versus miRNA as Therapeutics for Gene Silencing.</a> Mol Ther-Nucl Acids. 4, e252(2015).</li>
<li>Kohl, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemisphere-specific+optogenetic+stimulation+reveals+left-right+asymmetry+of+hippocampal+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Hemisphere-specific optogenetic stimulation reveals left-right asymmetry of hippocampal plasticity.</a> Nat Neurosci. 14 (11), 1413-1415 (2011).</li>
<li>Maejima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+loss+of+P%2FQ-type+channels+confined+to+rhombic-lip-derived+neurons+alters+synaptic+transmission+at+the+parallel+fiber+to+purkinje+cell+synapse+and+replicates+genomic+Cacna1a+mutation+phenotype+of+ataxia+and+seizures+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Postnatal loss of P/Q-type channels confined to rhombic-lip-derived neurons alters synaptic transmission at the parallel fiber to purkinje cell synapse and replicates genomic Cacna1a mutation phenotype of ataxia and seizures in mice.</a> J Neurosci. 33 (12), 5162-5174 (2013).</li>
<li>Mark, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+postnatal+loss+of+P%2FQ-type+calcium+channels+recapitulates+the+absence+epilepsy%2C+dyskinesia%2C+and+ataxia+phenotypes+of+genomic+Cacna1a+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Delayed postnatal loss of P/Q-type calcium channels recapitulates the absence epilepsy, dyskinesia, and ataxia phenotypes of genomic Cacna1a mutations.</a> J Neurosci. 31 (11), 4311-4326 (2011).</li>
<li>Thalhammer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+Splicing+of+P%2FQ-Type+Ca2%2B+Channels+Shapes+Presynaptic+Plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Alternative Splicing of P/Q-Type Ca2+ Channels Shapes Presynaptic Plasticity.</a> Cell Rep. 20 (2), 333-343 (2017).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-phosphate-mediated+Transfection+of+Eukaryotic+Cells+with+Plasmid+DNAs%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Calcium-phosphate-mediated Transfection of Eukaryotic Cells with Plasmid DNAs.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Chung, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycistronic+RNA+polymerase+II+expression+vectors+for+RNA+interference+based+on+BIC%2FmiR-155%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Polycistronic RNA polymerase II expression vectors for RNA interference based on BIC/miR-155.</a> Nucleic Acids Res. 34 (7), e53(2006).</li>
<li>McClure, C., Cole, K. L., Wulff, P., Klugmann, M., Murray, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+titering+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Production and titering of recombinant adeno-associated viral vectors.</a> J Vis Exp. (57), e3348(2011).</li>
<li>Cingolani, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+regulation+of+synaptic+AMPA+receptor+composition+and+abundance+by+beta3+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent regulation of synaptic AMPA receptor composition and abundance by beta3 integrins.</a> Neuron. 58 (5), 749-762 (2008).</li>
<li>Huang, H., Xu, Y., Cheng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+alternative+splicing+during+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Detection of alternative splicing during epithelial-mesenchymal transition.</a> J Vis Exp. (92), e51845(2014).</li>
<li>Vandesompele, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+normalization+of+real-time+quantitative+RT-PCR+data+by+geometric+averaging+of+multiple+internal+control+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes.</a> Genome Biol. 3 (7), (2002).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. (2012).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. (2013).</li>
<li>Gunaydin, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+optogenetic+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ultrafast optogenetic control.</a> Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).</li>
<li>Bourinet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+of+alpha+1A+subunit+gene+generates+phenotypic+variants+of+P-+and+Q-type+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Splicing of alpha 1A subunit gene generates phenotypic variants of P- and Q-type calcium channels.</a> Nat Neurosci. 2 (5), 407-415 (1999).</li>
<li>Chaudhuri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+as+a+molecular+switch+for+Ca2%2B%2Fcalmodulin-dependent+facilitation+of+P%2FQ-type+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing as a molecular switch for Ca2+/calmodulin-dependent facilitation of P/Q-type Ca2+ channels.</a> J Neurosci. 24 (28), 6334-6342 (2004).</li>
<li>Soong, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+splice+variants+in+human+P%2FQ-type+channel+alpha1%282.1%29+subunits%3A+implications+for+current+density+and+Ca2%2B-dependent+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of splice variants in human P/Q-type channel alpha1(2.1) subunits: implications for current density and Ca2+-dependent inactivation.</a> J Neurosci. 22 (23), 10142-10152 (2002).</li>
<li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+channelrhodopsins+for+fast+neuronal+stimulation+at+low+light+levels%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels.</a> P Natl Acad Sci USA. 108 (18), 7595-7600 (2011).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+engineered+channelrhodopsin+variants+with+improved+properties+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics.</a> Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).</li>
<li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nat Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li>
<li>Fowler, D. K., Williams, C., Gerritsen, A. T., Washbourne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+knockdown+from+artificial+microRNAs+in+an+enhanced+miR-155+backbone%3A+a+designer%27s+guide+to+potent+multi-target+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Improved knockdown from artificial microRNAs in an enhanced miR-155 backbone: a designer's guide to potent multi-target RNAi.</a> Nucleic Acids Res. 44 (5), e48(2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Coexpresión de una sonda de optogenetic y un miR contra un gene presináptico de interés ofrece un poderoso enfoque para caracterizar el efecto de la precipitación del gene en la función presináptica en circuitos neuronales intactas. Para este enfoque experimental, es importante identificar y caracterizar miRs que son altamente eficientes y selectivos en derribar el gen de interés en sistemas nativos. Si es posible, miRs independientes dos o más contra el mismo ARNm de interés puede usarse para control de posibles efectos off-target. Experimentos de rescate, en la que un gen resistente a la miR es reintroducido en el sistema, pueden utilizarse como un control de especificidad.
Utilizando la misma construcción para expresar una optogenetic sonda y un miR permite estimular ópticamente sólo las neuronas presinápticas que han sido manipuladas. Esto no es posible con estímulos eléctricos porque no distinguen entre las neuronas infectadas y no infectadas, produciendo resultados mezclados y diluidos. Debido a estímulos ópticos pueden inducir múltiples potenciales de acción15, es importante elegir sólo las sondas de optogenetic más rápidas, entre una creciente paleta15,19,20,21. Además, es esencial para asegurar que la estimulación óptica no induce una despolarización directa de botones presinápticos, para evitar pasar por algunos de los pasos de la transmisión sináptica se desea investigar22.
El enfoque experimental que se describe aquí, es posible evaluar en paralelo la relevancia fisiológica de genes múltiples presinápticos de interés dentro de un período de tiempo limitado (4 a 6 meses). Sin embargo, es importante tener en cuenta que caídas rara vez llega a 100%. Además, rAAVs necesitan expresarse durante al menos dos semanas permitir la máxima precipitación y completa expresión de la sonda de optogenetic, que puede representar una restricción de tiempo, la investigación de procesos de desarrollo tempranos. Aunque más ratones knockout condicional, desperdiciador de tiempo limitados a las neuronas presinápticas, generalmente como resultado completar la eliminación del gen de interés y, por tanto, ofrecer un enfoque complementario válido.
Una ventaja específica de la tecnología de miR es que permite la expresión de múltiples miRs de la promotora de la misma. Esta propiedad se ha utilizado principalmente para aumentar la eficiencia de precipitación mediante la inserción de copias múltiples del mismo miR o miRs diferentes contra el mismo gene de la blanco. Sin embargo puede ser utilizado también para caída múltiples genes expresando miRs contra diferentes genes7,23. Esta propiedad podría usarse para silenciar a múltiples proteínas presinápticas para diseccionar las vías de señalización presinápticas.
Aquí hemos combinado optogenetics con miRs artificiales para caracterizar los efectos de la precipitación del gene en la función presináptica en rebanadas hippocampal agudas. Un enfoque similar podría utilizarse también para manipular y la punta de prueba circuitos neuronales en vivo. Además, combinando miRs artificiales con chemogenetic enfoques permitiría a interrogar los circuitos neuronales en escalas de tiempo más largo.

Este protocolo describe un nuevo enfoque para caracterizar el efecto de la precipitación del gene en la función presináptica en circuitos neuronales intactas. Investigar la función presináptica en circuitos neuronales intactas es difícil porque muchos botones presinápticos son demasiado pequeños y lejos del soma para permitir intervenciones moleculares y electrofisiológicas combinadas. A pesar de interferencia de ARN ofrece un medio potente y flexible a la precipitación de las proteínas sinápticas1, este enfoque se ha utilizado con moderación para investigar la función presináptica porque es difícil detectar los efectos de la precipitación utilizando estímulos eléctricos, que no distinguen entre manipularon e ingenuo botones presinápticos2. Aquí, describimos cómo combinar artificial microARN (miR)-mediada por ARN de interferencia con tecnología de optogenetic recientemente desarrollados para lograr la estimulación selectiva de manipuladas botones presinápticos en rebanadas de cerebro agudo.
Mientras que los ratones condicionales en combinación con electrofisiología podrían utilizarse también para investigar la función de proteínas presinápticas3,4, nuestra estrategia no requiere el desarrollo y mantenimiento de genéticamente modificar líneas de ratón y también se puede emplear fácilmente derribar a isoformas específicas de un gen. Relativa más comúnmente usado horquilla corta RNAs (shRNAs), miRs artificiales, que empleamos aquí, ofrecen ventajas fundamentales para la caída en las neuronas. A diferencia de shRNAs, puede ser expresados bajo el control de una polimerasa II promotor1. Así, un promotor solo puede utilizarse para impulsar la expresión de miR y una sonda de optogenetic, junto con un reportero fluorescente. De esta forma, el tamaño de la construcción se puede mantener dentro de los límites de empaquetado de virus adeno-asociado recombinantes (rAAV, figura 1A). Además, el uso de una construcción única y un único promotor reduce variabilidad experimental porque permite la expresión de la miR, la sonda de optogenetic y el reportero fluorescente en un cociente fijo.
Recientemente hemos aplicado esta tecnología para examinar el papel de los isoforms alternativomente empalmada de canales de calcio presinápticos en el hipocampo5. Esta estrategia es generalmente aplicable al estudio de la relevancia fisiológica de otras proteínas presynaptically expresadas en los circuitos cerebrales de interés.

<table><tbody><tr><td>Acrilamida</td><td>Sigma</td><td>Acrilamida/Bis-acrilamida, solución al 30%</td><td>Controlador</td>de</tr><tr><td>temperatura animal tóxico con almohadilla térmica</td> Kit de ensayo <td>de proteínas WPI</td><td>ATC2000</td><td></td></tr><tr><td>BCA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>BLOCK-iT Pol II miR Kit de vectores de expresión de ARNi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K4936-00</td><td></td></tr><tr><td>Cortes de cerebro Precámara</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BSC-PC</td><td></td></tr><tr><td>CCD generador de imágenes basado en cámara</td><td>Bio-Rad</td><td>ChemiDoc&trade; MP</td><td></td></tr><tr><td>Reactivos de cultivo celular</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sustrato quimioluminiscente</td><td>GE Helthcare</td><td>ECL Reactivos de Western Blotting, RPN2106</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Citosina tóxica &beta;-D-arabinofuranósido</td><td>Sigma</td><td>C6645</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Foredom</td><td>K.1030</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Pomada de gentamicina</td><td>Farmacia</td><td></td><td></td>local</tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>54459</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetas inyectables</td><td>Narishige</td><td>GD1</td><td></td></tr><tr><td>Sales inorgánicas y detergentes</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>K2- fosfato de creatina</td><td>Calbiochem</td><td>237911</td><td></td></tr><tr><td>KGluconato</td><td>Fluka</td><td>60245</td><td></td></tr><tr><td>Láser</td><td>Laserglow Technologies</td><td>LRS-0473-GFM-00100-03</td><td></td></tr><tr><td>Membrana</td><td>Amersham</td><td>Protran&trade; 0.2 &micro; m NC</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Soporte para micropipetas</td><td>Narishige</td><td>IM-H1</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Narishige</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>Na3GTP</td><td>Sigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>NaPyruvate</td><td>Sigma</td><td>P5280</td><td></td></tr><tr><td>Lubricante ocular</td><td>Farmacia local</td><td>Lacrigel</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidores de fosfato</td><td>Sigma</td><td>P0044, P5726</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidores de la proteasa</td><td>Sigma</td><td>cOmplete&trade;, sin EDTA Cóctel de inhibidores de la proteasa Dispositivos</td><td></td></tr> de <tr><td>electroforesis y transferencia de gel de proteínas</td><td>Bio-Rad</td><td>Mini-Protean III Cell</td><td></td></tr><tr><td>Providone yodo</td><td>Farmacia local</td><td>Reactivo</td> de lisis Betadine <td></td></tr><tr><td>Qiazol</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>QuantiTect Reverse Kit</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Aparato estereotáctico</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoxina</td><td>Tocris</td><td>1069</td><td>Tóxico</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

combinando optogenetics con micrornas artificiales para caracterizar los efectos de gene caída en la función presináptica en circuitos neuronales intactas

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

El propósito de este protocolo es caracterizar el efecto de la precipitación del gene en la función presináptica en circuitos neuronales intactas. Se describe un flujo de trabajo sobre cómo combinar artificial microARN (miR)-mediada por ARN de interferencia con optogenetics para lograr la estimulación selectiva de manipuladas botones presinápticos en rebanadas de cerebro agudo. El enfoque experimental involucra el uso de una sola construcción viral y solo enolase promotor para conducir la expresión de una sonda de optogenetic y miR(s) artificial contra genes presinápticos. Cuando stereotactically inyectado en la región cerebral de interés, el concepto expresado hace posible estimular con luz exclusivamente las neuronas con la reducida expresión de los genes investigados. Esta estrategia no requiere el desarrollo y mantenimiento de líneas de ratón modificados genéticamente y puede en principio aplicarse a otros organismos y a cualquier gen neuronal de elección. Recientemente hemos aplicado para investigar cómo la caída de isoformas de empalme alternativos de canales de calcio voltaje-bloqueado de P/Q-type presinápticos (VGCCs) regula la plasticidad sináptica a corto plazo en CA3 a CA1 sinapsis excitatorias en rebanadas hippocampal agudas. Un enfoque similar podría utilizarse también para manipular y probe el circuito neuronal in vivo.

Los procedimientos descritos anteriormente proporcionan un método robusto para evaluar la transmisión sináptica cómo se ve afectado por la caída de proteínas sinápticas de las neuronas presinápticas. Resultados representativos de cómo la caída de alternativa empalme isoformas de presinápticos de Cav2.1 (P/Q-type) VGCCs regula plasticidad sináptica a corto plazo en CA3 a CA1 las sinapsis excitatorias se indican a continuación como ejemplo.
CAv2.1 (P/Q-type) los canales son los VGCCs presinápticas predominantes en las sinapsis más rápidas en el sistema nervioso central. Alternativa de empalme de los exones excluyentes 37a y 37b de la formación de poros α1 subunidad de Cav2.1 (α1A) produce dos variantes principales, Cav2.1 [EPT] y Cav2.1 [EFb]16,17 ,18. Para determinar si Cav2.1 [EPT] y Cav2.1 [EFb] diferencialmente regulan la transmisión sináptica y plasticidad en las neuronas piramidales hipocampales de rata, primero desarrollamos específica de isoforma miRs a caída selectiva de Cav 2.1 [EPT] o Cav2.1 [EFb]5. A pesar del tamaño corto (97 bp) y la alta semejanza (61.86% de identidad en el nivel de nucleótido) entre los exones 37a y 37b, podríamos diseñar tres secuencias miR contra rata Cav2.1 [EPT] (miR EFa1: TCCTTATAGTGAATGCGGCCG; miR EFa2: ATGTCCTTATAGTGAATGCGG; miR EFa3: TTGCAAGCAACCCTATGAGGA) y dos contra rata Cav2.1 [EFb] (miR EFb1: ATACATGTCCGGGTAAGGCAT; miR EFb2: ATCTGATACATGTCCGGGTAA) con eficacia prevista de precipitación alta. Como control negativo (Control de la miR), se utilizó el plásmido pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg que contiene una secuencia que no dirige ningún gen vertebrado conocido. En base a una primera pantalla en células HEK 293 contra canales heterólogos, miR EFa1, miR EFa3 y miR EFb2 seleccionados y clonados sus cassettes de expresión en el 3' UTR del vector pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, que está diseñado para la producción de rAAVs y donde la promotor sinapsina unidades de expresión de la ultrarrápida channelrhodopsin ChETA, la proteína fluorescente roja TdTomato y el miR insertado (figura 1). También duplica el cassette de la expresión de miR EFb2 para aumentar la eficiencia de la precipitación de este miR.
A continuación, preparamos rAAV1/2 para las construcciones de cuatro arriba y cuantificó su precipitación eficiencia y selectividad en cultivos neuronales de rata primaria mediante qRT-PCR específica de isoforma. miR EFa1 miR EFa3 reducido y mRNA de nativa de Cav2.1 [EPT] ~ 70% pero no de Cav2.1 [EFb], mientras que miR EFb reducido mRNA de nativa de Cav2.1 [EFb] ~ 60% pero no de Cav2.1 [EPT] (figura 2).
Entonces stereotactically inyectamos cada uno de los cuatro rAAV1/2 en el área CA3 del hipocampo de ratas P18 (Figura 3A-C), con coordenadas de −2.6 (A-P/M-L/D-V de Bregma) / ± 2.9 / −2.9. Después de la inyección quince a veinte y cuatro días, preparamos rebanadas hippocampal agudas de ratas rAAV1/2-inyectado y utiliza fluorescencia TdTomato para confirmar la expresión y localización de rAAVs (figura 3B). Para investigar si caída presináptico de Cav2.1 [EPT] o Cav2.1 [EFb] afectó la plasticidad sináptica a corto plazo en CA3 a CA1 sinapsis, nos estimulan selectivamente infectadas neuronas CA3 con breve 473 nm láser pulsos ligeros (2 ms de duración ; Figura 3) y las resultantes EPSCs por parches de neuronas piramidales en la proximal a la zona medial de la región CA1 (figura 3). Encontramos que la caída de Cav2.1 isoformas de empalme afectado las respuestas a la estimulación de junto-pulso en direcciones opuestas: caída de Cav2.1 [EPT] (miR EFa1 o miR EFa3) impulsado facilitación de junto-pulso (PPF) Considerando que la precipitación de Ca v2.1 [EFb] (miR EFb2) había abolido (figura 3D, E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig1.jpg"> Figura 1: Esquema de las construcciones de la expresión combinada de la sonda de optogenetic ultrarrápida ChETA y miRs de la isoforma específica contra Cav2.1 [EPT] y Cav2.1 [CEE]. (A) mapa de la rAAV construir pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X, que contiene un promotor sinapsina (Syn), channelrhodopsin ultrarrápida ChETA fundido a TdTomato y en el proximal 3' UTR, un miR de Cav2.1 empalme isoforma específica. Enzimas de restricción que se muestra son solo fresas. Esquema superior, (B) del casete de expresión. El promotor sinapsina unidades de expresión de una isoforma específica miR y ChETA-TdTomato. Fondo, complemento reverso de las secuencias diana de 21 nucleótidos, que forman parte de la cinta de miR. Para miR EFb2 dos casetes miR idénticos fueron expresados en tándem uno tras otro. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig2.jpg"> Figura 2. Evaluación de la eficacia de derribo y selectividad de miRs de la isoforma específica de Cav2.1 [EPT] y Cav2.1 [EFb]. Análisis específica de isoforma qRT-PCR de RNA aislado de cultivos primarios de 17-18 DIV infectados en DIV 6 con rAAVs expresando miRs a cualquiera de los dos Cav2.1 [EPT] (miR EFa1 y miR EFa3) o Cav2.1 [EFb] (miR EFb2). Datos son normalizados para el control negativo (Control de la miR). miR EFa1 y miR EFa3 selectiva y significativamente reducen el mRNA de Cav2.1 [EPT] (n = 8 y 7 culturas, respectivamente), mientras que miR EFb significativamente y de forma selectiva reduce el mRNA de Cav2.1 [EFb] (n = 4 culturas; *** p &lt; 0.001; una vía análisis de prueba de varianza seguida por el post-test de Tukey-Kramer). Los datos se presentan como media ± SEM. Esta figura ha sido adaptada de Thalhammer, a. et al. 5. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57223/57223fig3.jpg"> Figura 3. Evaluación del papel de Cav2.1 [EPT] y Cav2.1 [EFb] en el hipocampo nativo por dirigida la estimulación de las neuronas derribado con optogenetics. (A) esquema de la cassette de expresión de las construcciones de rAAV utilizado para la infección en vivo . (B) sección hipocampo mostrando esa fluorescencia TdTomato se limita a la región CA3 y sus proyecciones. Configuración Experimental (C) : rayo láser fue dirigido en CA3 somata, y realizaron grabaciones de abrazadera del remiendo de neuronas piramidales de CA1. (D) 2 ms de duración azul (473 nm) pulsos de luz láser brillados en 20 Hz evocan EPSCs cuya PPF es aumentado por miRs a Cav2.1 [EPT] y suprimido por el miR para Cav2.1 [CEE]. Extracto (E) de la relación de junto-pulso para experimentos como en (D), mostrando un incremento en PPF para miR EFa1 y miR EFa3 y una disminución para miR EFb2, comparado con miR Control (n = 9-11 grabaciones; * p = 0.02; ** p = 0,01; *** p &lt; 0,0004; análisis de covarianza). Los datos se presentan como media ± SEM. Esta figura ha sido adaptada de Thalhammer, a. et al. 5. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57223/57223fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo sobre cómo combinar artificial microRNA mediada por ARN de interferencia con optogenetics estimular específicamente botones presinápticos con menor expresión de genes selectivos dentro de circuitos neuronales intactos.

Combinando Optogenetics con microRNAs artificiales para caracterizar los efectos de Gene caída en la función presináptica en circuitos neuronales intactas

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

El objetivo general de combinar la interferencia de ARN mediada por microARN artificial con la optogenética es caracterizar el efecto de la eliminación de genes en la función presináptica dentro de circuitos neuronales intactos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la fisiología sináptica, como abordar el papel fisiológico de las proteínas presinápticas en los circuitos cerebrales intactos. La principal ventaja de esta técnica es que permite monitorizar selectivamente la transmisión sináptica en neuronas con expresión reducida de la proteína presináptica objeto de investigación.Además, hemos utilizado este método para investigar la función presináptica en cortes agudos de cerebro. También se puede aplicar para manipular y sondear la seguridad neuronal in vivo. La demostradora del procedimiento estará a cargo de Carmela Vitale, estudiante de posgrado de nuestro laboratorio.Después de diseñar los microARN y construir un vector recombinante para expresar los microARN y la sonda optogenética, prepare cultivos neuronales primarios de la región cerebral de interés. Para ello, siga un protocolo de ocultación de cortticas establecido por L.A.Cingolani and Company con las siguientes modificaciones. Primero, use placas de seis pocillos, coloque medio millón de neuronas por pocillo y use 2,5 mililitros de medio de fijación por pocillo.Después de incubar la placa durante cuatro horas, cambie a 3,3 mililitros de medio de mantenimiento por pocillo y, si se observa un crecimiento excesivo de astrocitos, agregue 0,5 mililitros de medio de mantenimiento suplementado con 7,5 micromolares de AraC a tres o cuatro DIV. Con cinco o seis DIV, infecte tres pocillos por cada microARN que se va a analizar. Utilice la dosis infecciosa más baja que infecte al menos el 99% de las neuronas.Agregue el virus directamente a las neuronas, mezcle suavemente y vuelva a colocar las placas en la incubadora a 37 grados centígrados. A 17 a 18 DIV, lisar las neuronas para una extracción de ARN. Incline las placas y use pipetas de vidrio para eliminar todo el medio de cada pocillo.Luego, agregue inmediatamente 700 microlitros de reactivo de lisis a cada pocillo. Después de una breve mezcla, transfiera el lisado celular fuera de cada pocillo y colóquelo en tubos separados de 1,5 mililitros. A continuación, añade 140 microlitros de cloroformo a cada lisado.Tape y agite rápidamente los tubos vigorosamente durante 15 segundos para emulsionar el contenido. A continuación, centrifuga los tubos a 12.000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Luego, transfiera con cuidado la fase acuosa superior que contiene ARN a un nuevo tubo.No permita que la punta de la pipeta toque la fase orgánica. A la fase acuosa añadir 1,5 volúmenes de etanol al 100% y pipetear la solución lentamente tres veces para mezclar. A continuación, purifique el ARN con un kit disponible en el mercado y cuantifique los rendimientos.Espere al menos 3,5 microgramos por muestra. Las proporciones de pureza sobre las proteínas y los compuestos orgánicos deben ser de al menos 1,9. A continuación, utilice un kit para retrotranscribir 250, 500 o 1.000 nanogramos de ARN.A continuación, cuantifique la eficiencia de derribo del gen endógeno de interés mediante RTPCR cuantitativo. Apunte a una eficiencia de derribo de al menos el 60%Para este protocolo, use un animal que 15 días antes o más haya tenido RAAV12 inyectado en el cerebro de acuerdo con un protocolo publicado previamente por A.Cetin and Company. Aísle el cerebro y haga cortes agudos de cerebro con un vibratomo y ACFF helado gaseado.Recoja las rodajas de la región de interés y minimice su exposición a la luz para evitar la activación de la sonda optogenética. Deje que las rodajas se recuperen durante 30 minutos a 37 grados centígrados en el mismo ACFF. Use una cámara diseñada específicamente para sostener cortes de cerebro.Luego, regrese las rodajas a temperatura ambiente, donde permanecerán saludables durante seis a ocho horas. Para continuar, transfiera una rebanada a la cámara de grabación y superfúndala a dos mililitros por minuto de ACFF. A continuación, compruebe brevemente la señal del indicador fluorescente expresado para determinar la localización y la intensidad de la infección.Luego, llene un electrodo de parche con la solución intracelular. Ahora, bajo iluminación infrarroja, se obtiene una configuración hermética al por mayor en una neurona que recibe entradas sinápticas de las neuronas infectadas. La resistencia en serie puede dejarse sin compensar, pero debe ser constante y baja.Por ejemplo, si las neuronas piramidales CA3 estaban infectadas, se colocan un parche en las neuronas piramidales en el tracto proximal y medial de la región CA1. Cuando las células comienzan a verse encogidas o hinchadas, cuando la aplicación de parches se vuelve difícil o los lotes son inestables, entonces las porciones seleccionadas ya no están lo suficientemente sanas como para registrar. A continuación, utilice la farmacología para aislar las corrientes sinápticas que se están investigando.Por ejemplo, si el objetivo es investigar la transmisión sináptica excitatoria, bloquee la transmisión sináptica inhibitoria añadiendo bicuculina al baño. A continuación, evoca las corrientes sinápticas, como las corrientes postsinápticas excitatorias, utilizando un láser azul de 473 nanómetros acoplado a una fibra óptica colocada en el somata de las neuronas infectadas. No dirija el láser sobre los axones de las neuronas.Por ejemplo, evite arrojar luz sobre los colaterales de Shaffer. La despolarización directa de los axones no es deseable. A continuación, ajuste la duración de la estimulación al mínimo para reducir la posibilidad de evocar más de un potencial de acción por pulso de luz.A continuación, refina la intensidad del láser para evocar una corriente sináptica pequeña pero claramente detectable. Por ejemplo, para la transmisión sináptica excitatoria entre las neuronas piramidales CA3 y CA1, ajuste la intensidad del láser para evocar corrientes sinápticas de 20 a 50 picoamperios. Al final del experimento, aplique tetrodotoxina a 0,5 micromolares para bloquear los canales de sodio.La sensibilidad de las corrientes evocadas ópticamente a la tetrodotoxina indica que están impulsadas por el potencial de acción. Continúe recopilando datos hasta que al menos ocho neuronas hayan sido parcheadas para una condición determinada de al menos tres animales diferentes. Estos son los datos mínimos necesarios para analizar los resultados.Utilizando el método descrito, se eliminaron las isoformas de empalme alternativas de los canales de calcio presinápticos dependientes de voltaje de tipo P/Q. Se cree que estos canales regulan la plasticidad sináptica a corto plazo en las sinapsis excitadoras de CA3 a CA1. Se realizaron cuatro construcciones diferentes que expresan microARN específicos de isoformas; cada uno se expresó junto con un canal ultrarrápido rodopsina junto con la proteína fluorescente Td-Tomato.En primer lugar, se confirmó que cada constructo tenía suficiente eficiencia de derribo y selectividad en cultivos neuronales primarios de rata utilizando RTPCR cuantitativo específico de isoformas. A continuación, cada constructo se inyectó en el hipocampo de ratas P18. En última instancia, se investigó el efecto de las construcciones sobre la plasticidad sináptica a corto plazo en las sinapsis CA3 a CA1 estimulando neuronas piramidales CA3 infectadas con breves pulsos de luz de 473 nanómetros y registrando las EPSC resultantes en configuración mayorista a partir de neuronas piramidales de la región CA1.La caída de diferentes isoformas de empalme afectó las respuestas a la estimulación de pulso emparejada en direcciones opuestas. La eliminación de la isoforma A impulsó la facilitación del pulso emparejado; mientras que la eliminación de la isoforma B la abolió. La combinación de la optogenética de interferencias de ARN permite que la investigación en el campo de la fisiología sináptica explore cómo las proteínas presinápticas regulan la plasticidad sináptica a corto plazo en circuitos intactos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo validar los microARN para la interferencia de ARN y cómo combinarlos con la optogenética para investigar la transmisión sináptica en cortes agudos de cerebro.

combining-optogenetics-with-artificial-micrornas-to-characterize

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video demuestra la inhibición mediada por microARN de las corrientes sinápticas excitadoras en cortes de cerebro de hipocampo de ratón. Las neuronas CA3 se infectaron con un vector viral recombinante que alberga una construcción para expresar un indicador fluorescente, un canal de membrana activado por luz y un microARN que regula a la baja la expresión de los canales de calcio dependientes de voltaje. Al colocar un corte en una cámara de registro y parchear una neurona CA1 con una pipeta...

Inhibición mediada por microARN de las corrientes postsinápticas excitatorias en cortes de hipocampo de ratón

Los microARNs tienen funciones importantes en la estructura y función del cerebro. Aquí se describe un método para hacer cumplir miRNA hipocampo sobreexpresión mediante inyección estereotáxica de un lentivirus que expresan los genes miARN ingeniería. Este enfoque puede servir como una manera relativamente rápida para evaluar...

Inyección estereotáctica de microARN que expresan lentivirus al ratón hipocampo CA1 Región y evaluación de los resultados del comportamiento

El reciente desarrollo de herramientas de la neurociencia, que combinan la genética y la óptica, denominada "optogenética", permite el control sobre la actividad de circuitos neuronales con un nivel sin precedentes de la resolución espacial y temporal. Aquí les ofrecemos un protocolo para la integración en la grabación vivo con la manipulación optogenética de subconjuntos definidos genéticamente las neuronas piramidales corticales y subicular prefrontales.

Un método para la alta fidelidad Optogenética control de un individuo neuronas piramidales<em&gt; En vivo</em

Describimos un método para caracterizar la topografía funcional y las propiedades sinápticas de los circuitos del prosencéfalo utilizando un enfoque optogenético para fotoestimular poblaciones neuronales in vitro.

Fotoestimulación de barrido láser de circuitos del prosencéfalo optogenéticamente dirigidos

optogenética se ha convertido en una poderosa herramienta para su uso en experimentos de neurociencia conductual. Este protocolo ofrece una guía paso a paso para el diseño y la configuración de sistemas láser, y proporciona un protocolo completo para llevar a cabo estimulaciones optogenéticas in vivo múltiples y simultáneas compatibles con la mayoría de los paradigmas de pruebas de comportamiento de roedores.

In vivo optogenético la estimulación del sistema nervioso central de roedores

Se describe un protocolo para generar un sistema de cocultivo compuesto por neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs), neuronas corticales primarias y astrocitos. Este sistema de cocultivo permite detectar la formación de contactos sinápticos y circuitos entre nuevas neuronas derivadas de iPSC y neuronas corticales preexistentes que expresan canalrodopsina-2.

Un enfoque optogenética para Evaluar formación de conexiones neuronales en un sistema de co-cultura

Aquí, describimos métodos de manipulación optogenética de determinados tipos de neuronas durante la monitorización de los estados de sueño/vigilia en ratones, presentando nuestro trabajo reciente en el núcleo de la estría terminal is como ejemplo.

Manipulación optogenética de circuitos neuronales durante la supervisión de los estados de sueño/vigilia en ratones

El objetivo de este protocolo es describir un enfoque para analizar el comportamiento de las células madre/progenitoras neurales adultas en respuesta a la manipulación quimiogenética de un circuito neural local específico.

Regulación específica del circuito de ensayo de células precursoras neuronales hipocampales adultas

Con la manipulación optogenética de poblaciones neuronales específicas o regiones cerebrales, el comportamiento se puede modificar con alta resolución temporal y espacial en animales en movimiento libre. Mediante el uso de diferentes herramientas optogenéticas en combinación con fibras ópticas implantadas crónicamente, se puede realizar una variedad de modulaciones neuronales y pruebas de comportamiento.

Manipulación optogenética de la actividad neuronal para modular el comportamiento en ratones que se mueven libremente

Aquí presentamos un protocolo que describe la transducción viral de regiones cerebrales discretas con construcciones optogenéticas para permitir la caracterización electrofisiológica específica de la sinapsis en cortes cerebrales agudos de roedores.

Ex Vivo Interrogación optogenética de la transmisión sináptica de largo alcance y la plasticidad de la corteza prefrontal medial a la corteza entorrinal lateral

Aquí, describimos un protocolo que combina la inyección de virus adenoasociados con la implantación de ventana craneal para obtener imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos.

Imágenes simultáneas de la dinámica microglial y la actividad neuronal en ratones despiertos

Aprende a combinar microRNAs artificiales con optogenética para caracterizar el efecto del silenciamiento génico en la función presináptica. Este método permite investigar la transmisión sináptica en circuitos neuronales intactos de rebanadas cerebrales agudas.

Combinando Optogenetics con microRNAs artificiales para caracterizar los efectos de Gene caída en la función presináptica en circuitos neuronales intactas (Video) | JoVE Journal

Combinando Optogenetics con microRNAs artificiales para caracterizar los efectos de Gene caída en la función presináptica en circuitos neuronales intactas

Explorar más videos