Name: Electrochemiluminescence ensayos para autoanticuerpos islote humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Aprende a detectar autoanticuerpos de islotes pancreáticos mediante ensayos de electroquimioluminiscencia con alta sensibilidad. Este método no radioactivo permite predecir la diabetes tipo 1 antes de los síntomas clínicos.

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Este trabajo fue financiado por los NIH grant DK32083, JDRF Grant 2-SRA-2015-51-Q-R.

1. preparación de buffer
<ol><li>Etiquetado tampón (2 x PBS, pH 7.9): en 400 mL de agua destilada desionizada (DD), añadir 100 mL de PBS de x 10, ajustar el pH a 7.9 con NaOH.</li>
	<li>3 mM de la biotina: disolver 1 mg de biotina en 588 μl de tampón de etiquetado.</li>
	<li>3 mM de Sulfo-etiqueta: disolver 150 nmol de Sulfo-etiqueta en 50 μl de tampón de etiquetado.</li>
	<li>Buffer de antígeno (5% BSA): en 500 mL de PBS 1 x, agregue 25 g de albúmina de suero bovino (BSA).</li>
	<li>Preparar la solución de ácido acético de 0,5 M.</li>
	<li>1,0 M de tampón Tris-HCl, pH 9.0: preparar 1 M Tris-HCl buffer y ajustar el pH a 9.0 con HCl.</li>
	<li>De tampón con revestimiento (3% bloqueador A): en 500 mL de PBS 1 x, añadir 15 g de bloqueador de A.</li>
	<li>Tampón de lavado (0,05% Tween 20, SAFT): en 5000 mL de PBS 1 x, añadir 2,5 mL de Tween 20.</li>
	<li>Búfer de lectura (2 x Buffer de lectura T con surfactante): en 500 mL de agua DD, agregar 500 mL de 4 x Buffer de lectura T con surfactante (Tabla de materiales).</li>
	<li>Tienda biotina y Sulfo-etiqueta en un congelador de-20 ° C. Nota: Ambas soluciones de biotina y Sulfo-tag deben recién preparadas siempre justo antes del procedimiento de etiquetado.</li>
</ol>2. etiquetar el autoantígeno del islote humano con biotina y Sulfo-etiqueta
Nota: Una alta concentración del antígeno, ≥0.5 mg/mL, se recomienda para una reacción más eficaz de etiquetado.
<ol><li>Determinar la fracción molar de autoantígenos de los islotes pancreáticos humanos de biotina y Sulfo-tag.<ol>
<li>Obtener el número molares de antígeno dividiendo el peso del antígeno por el peso molecular.</li>
		<li>Utilizar la relación molar de 1:5 para el antígeno con un peso molecular más pequeño (≤10 kd) y la fracción molar de 1:20 para el antígeno de mayor peso molecular (> 50 kd).</li>
		<li>Calcular el volumen de biotina o Sulfo-tag dividiendo el número molar por su concentración.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mezclar el autoantígeno del islote humano con biotina o Sulfo-tag con la fracción molar de 1:5. Nota: La proteína en sistemas de tampón tris o glicina debe cambiarse a 2 x tampón PBS pH 7.9 usando tamaño columna.</li>
	<li>Como biotina y Sulfo-tag son sensibles a la luz, cubrir los tubos de reacción con papel de aluminio. Incubar la reacción a temperatura ambiente (RT) durante 1 h.</li>
	<li>Durante la incubación, cebe la columna spin 2 dispensadores x tampón PBS en la columna tres veces. Centrifugue la solución a 1000 x g durante 2 min cada vez. Nota: Actualmente la reacción de etiquetado, a través del puente, se sigue produciendo y desea detener.</li>
	<li>Detener la reacción etiquetadora purificando el autoantigen del islote humano marcado. Para purificar, pase el autoantígeno a través de la columna de spin y centrifugar la columna a 1000 x g durante 2 minutos.</li>
	<li>Determinar la concentración de antígeno marcado (μg/μl) con la cantidad de proteína y el volumen final. Nota: Aproximadamente, habrá retención de 90-95% de antígeno etiquetado después de pasar cada columna de vuelta.</li>
	<li>Alícuota del antígeno etiquetado y almacén etiquetados como antígeno a-80 ° C.</li>
</ol>3. definir las mejores concentraciones y proporciones de los dos antígenos marcados para el ensayo (ensayo de Checker Board)
<ol><li>Preparar dos muestras de suero, un positivo alto y uno negativo, con un volumen total de 200 μL de cada uno.</li>
	<li>Alícuota 4 μL de suero y 1 x PBS hasta el volumen final es de 20 μl por pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos. Utilizar la mitad de una placa de la muestra positiva alta y la otra mitad de la muestra negativa, como se muestra en la figura 2A.</li>
	<li>Añada 10 μl de biotina y 10 μl de Sulfo-etiqueta etiquetado diluciones seriadas de antígeno y la conducta de los dos antígenos diferentemente marcadas, como se muestra en la figura 2A. Ejecute una dilución seriada horizontal para un antígeno marcado y una dilución seriada vertical para el otro antígeno etiquetado.</li>
	<li>Continuar con el resto de los pasos de análisis descritos en 5.3 a 9.1.</li>
	<li>Calcular el cociente de las señales de la muestra positiva alta contra cada una de las señales correspondientes de la muestra negativa que se muestra en la figura 2B.</li>
	<li>Identificar las mejores concentraciones de biotina y Sulfo-tag etiqueta antígenos seleccionando un punto con el más alto o cerca de proporción más alta de positiva a negativa. Considerar la señal de bajo fondo de la muestra negativa a identificar la relación. Nota: Ensayo día 1 incluye paso 4 al paso 6.</li>
</ol>4. preparar el Buffer del antígeno mediante la correcta concentración de biotina/Sulfo-etiqueta marcado antígeno
<ol><li>Seleccionar la concentración racional de cada antígeno basado en el ensayo de checker board.</li>
	<li>Preparar 3 mL de solución antigénica por placa, usando la concentración racional de biotina/Sulfo-etiqueta etiquetado como antígeno para el búfer de antígeno.</li>
</ol>5. Incube las muestras de suero con antígeno marcado
Nota: Existen dos protocolos en esta sección, sin tratamiento ácido suero y con tratamiento con suero ácido. Todos islote autoanticuerpos los ensayos excepto ensayo de IAA utilizan Protocolo regular sin tratamiento ácido suero de pasos 5.1 a 5.5, mientras que IAA análisis omite estos pasos y utiliza el protocolo con tratamiento con suero ácido de pasos 5.6 a 5.9.
<ol><li>Alícuota 4 μL de suero y 1 x PBS hasta el volumen final es de 20 μl por pocillo de una placa de PCR de 96 pocillos.</li>
	<li>Añadir 20 μl de solución de antígeno marcado por pozo.</li>
	<li>Cubra la placa PCR con el lacre de la hoja para evitar la luz.</li>
	<li>Poner la placa en un agitador (baja velocidad) a temperatura ambiente por 2 h.</li>
	<li>Poner la placa en el refrigerador de 4 ° C e incubar durante la noche (18-24 h). Nota: El siguiente protocolo de pasos de 5.6 a 5.9 está diseñado sólo para el ensayo de IAA y otros ensayos de autoanticuerpo omitir estos pasos.</li>
	<li>Mix 15 μl de suero con 18 μL de ácido acético de 0,5 M para cada muestra de suero. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 45 minutos.</li>
	<li>Preparar la solución de antígeno con la concentración racional de la biotina y Sulfo-etiqueta marcado antígeno, basado en el análisis de checker board, utilizando buffer de antígeno. En cada uno, alícuota 35 μl de tampón de antígeno, que contiene biotina y Sulfo-etiqueta con la etiqueta antígeno, en una nueva placa de la polimerización en cadena.</li>
	<li>Antes de que termine la etapa de incubación (paso 5.6) de 45 minutos, añadir 8,3 μl de tampón de 1 M Tris pH 9.0 al lado de cada pocillo de la placa del antígeno (paso 5.6). Es importante limitar la mezcla entre el buffer Tris y el antígeno. Inmediatamente transferir 25 μl del suero, que es tratado con ácido, en el paso 5.6, en cada pozo y agitar la solución. Cubra la placa PCR con el lacre de la hoja para evitar la luz.</li>
	<li>Poner la placa en un agitador (baja velocidad) a temperatura ambiente por 2 h. Ponga la placa en el refrigerador de 4 ° C y permiten que la placa a incubar durante la noche (18-24 h).</li>
</ol>6. preparar la placa de estreptavidina
<ol><li>Tomar una placa de estreptavidina del refrigerador de 4 ° C y deje que la plancha venir a RT.</li>
	<li>Una vez que la placa de estreptavidina es a temperatura ambiente, añadir 150 μL del 3% un bloqueador a cada pocillo.</li>
	<li>Cubra la placa PCR con papel de aluminio del lacre.</li>
	<li>Incube la placa en el refrigerador de 4 ° C durante la noche. Nota: Ensayo día 2 incluye paso 7 al paso 9.</li>
</ol>7. transferencia de suero antígeno se incuba la placa estreptavidina
<ol><li>Al día siguiente, sacar la placa de la estreptavidina del refrigerador y deseche el buffer de la placa. Establecidas algunas toallas de papel sobre la mesa y golpear la placa invertida hasta no hay ningún búfer más dentro de los pozos.</li>
	<li>Llenar la placa vacía de la estreptavidina con 150 μL de SAFT por pozo y deseche la SAFT de la placa para un total de tres lavados.</li>
	<li>Transferencia 30 μl de suero antígeno incuba por pozo en la placa de estreptavidina.</li>
	<li>Cubra la placa con papel aluminio para evitar la luz. Agitar la placa, en un nivel bajo, a temperatura ambiente durante 1 hora.</li>
</ol>8. Lave la placa y añadir el Buffer de lectura
<ol><li>Descartes se incuba de la placa. Añadir 150 μL de SAFT por pozo y deseche la SAFT de la placa para un total de tres lavados.</li>
	<li>Después del lavado, agregar 150 μL por pocillo de búfer de lectura. Nota: Es importante evitar burbujas de aire en la solución, porque esto afectará cómo la placa se lee en el equipo lector de placa.</li>
</ol>9. leer la placa y analizar datos
<ol><li>Contar la placa en el equipo lector de placa. Valores de anticuerpos aparecen como cuentas por segundo (CPS).</li>
	<li>Transmitir los niveles de anticuerpos recibieron de la máquina de lector de placa como un índice relativo. Calcular el índice de la siguiente ecuación: Índice valor = [CPS (muestra) - CPS (control negativo)] / [CPS (control positivo) - CPS (control negativo)].</li>
	<li>Identificar resultados de anticuerpos positivos y negativos utilizando el corte para la positividad, definido basado en el percentil 99 de los 100 sujetos sanos control (individuos no diabéticos sin cualquier enfermedad autoinmune conocida y que no hay antecedentes familiares de diabetes).</li>
</ol>

<ol><li>Insel, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+presymptomatic+type+1+diabetes%3A+a+scientific+statement+of+JDRF%2C+the+Endocrine+Society%2C+and+the+American+Diabetes+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association.</a> Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).</li>
<li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes%3A+new+perspectives+on+disease+pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment.</a> Lancet. 358 (9277), 221-229 (2001).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Autoanticuerpos del islote son actualmente los biomarcadores más confiables para la autoinmunidad de la diabetes tipo 1. Marcan el inicio de la autoinmunidad específica islote y determinar riesgos de enfermedad abierta. El ensayo de ECL para autoanticuerpos de islote, se ha validado extensivamente en múltiples ensayos clínicos diabetes de tipo nacional e internacional 1. El ensayo ha demostrado mayor sensibilidad y especificidad en comparación con la corriente 'gold' drea estándar. El ensayo de ECL ha demostrado su ventaja superior para mayor especificidad de la enfermedad por la exigente alta afinidad y alto riesgo islote autoanticuerpos de bajo riesgo, baja afinidad las señales generadas por el RBA. Esto se nota especialmente en los sujetos que son sólo único islote autoanticuerpos positivos y nunca han progresado para diabetes tipo 1. La mayoría de estos baja afinidad autoanticuerpos fueron encontrados para ser perdidos durante el seguimiento prueba hecha dentro de meses a años, comportándose como un 'transitorio positivo.' Como se presume, estos baja afinidad 'individuales' autoanticuerpos probablemente resultaron de la inmunización con una molécula de cruz-reactivo. Mientras mayor afinidad, autoanticuerpos de islote de mayor riesgo resultaron de la inmunización con los antígenos del islote se. Además, ECL-ensayos han demostrado la capacidad que preceden el momento de la seroconversión del' ' de ensayos de Unión radio estándar actuales (RBA) por años en niños con diabetes previa, que fueron seguidos desde el nacimiento a la diabetes clínica. Un ensayo clínico en curso internacional, el ambientales determinantes de la Diabetes en los jóvenes (TEDDY), depende de la detección precisa de identificar el momento y la aparición del primer autoanticuerpo islote 'seroconversión' para marcar el principio del islote autoinmunidad y para la identificación de desencadenantes ambientales. Una posible razón para el aumento de la sensibilidad en el ensayo de ECL es que el análisis de capturas de todas las clases de inmunoglobulinas: IgG, IgM, IgA, IgE, en lugar de la tradicional RBA es o ELISA que se basan sólo en la detección de IgG.
En los ensayos de ECL, para algunos autoanticuerpos particular como AIA, la Unión de autoanticuerpos a los antígenos parece ser inhibida por algún componente presente en el suero humano normal. Para quitar o soltar esta inhibición, tratamiento con ácido de las muestras de suero era necesario hacerlo antes de que el suero fue incubado con el antígeno. Como se muestra en la [figura 5], análisis de la ECL-IAA, las actividades de la Unión de autoanticuerpos de suero de pacientes con el antígeno y el anticuerpo monoclonal de ratón insulina fue realzada grandemente. La acidificación de las muestras de suero, utilizado en los ensayos de anticuerpos, generalmente se aplica para disociar complejos encuadernados previamente existentes. Se desconoce el mecanismo detrás de cómo señales de IAA se inhibió en muestras de suero humano y publicadas por acidificación del suero, pero este método se ha utilizado en otros ensayos ECL basado en14,15.
En algunos casos, cuando las moléculas de etiquetado, biotina o Sulfo-tag, el etiquetado positionsinside de las moléculas de proteína del antígeno están en, o muy cerca de principales epítopos de unión de anticuerpos, que puede interferir con la actividad de unión a los anticuerpos. Esto reducirá la sensibilidad del ensayo y puede derribar completamente el ensayo. Etiquetado procedimiento de rutina, maximización o saturación se desea para que cada molécula de proteína del antígeno generar máxima actividad o señal por la molécula marcada por maximiza la capacidad de etiquetado de cada posición posible del etiquetado. Etiquetado no saturados debe realizarse mediante la reducción de la fracción molar de moléculas (biotina y Sulfo-etiqueta) a la proteína del antígeno de etiquetado si etiquetado sobre el antígeno se convierte en una posible razón para la interrupción de la actividad de unión del anticuerpo. Principales epitopos pueden ser mejor reservados e interrupción de la actividad de unión del anticuerpo puede ser lanzado usando la estrategia de etiquetado no saturada en la mayoría de los casos.
Cada ensayo debe incluir un estándar alto positivo y negativo control interno para el cálculo del índice de muestras desconocidas. Control positivo bajo cerca de límite superior de la prueba de los controles normales es importante incluir para el control de sensibilidad del ensayo. El laboratorio debe mantener suficientes alícuotas de estándar controles positivos y negativos para el uso a largo plazo y todas alícuotas deben almacenarse a-20 ° C. Para el aseguramiento de la calidad del ensayo, deben ejecutar ensayos por duplicado para cada muestra y cada resultado positivo se debe confirmar mediante la repetición de la muestra en un análisis separado. Un tercer ensayo es necesario cuando el segundo ensayo confirmatorio no está de acuerdo con el primer ensayo y los resultados de dos ensayos, que están de acuerdo (por ej., +, + o-, -), será la determinación final de un resultado positivo o negativo.
Con la plataforma de ensayos solo de ECL, un análisis multiplexado pueden ampliarse de éstos. Pueden determinar simultáneamente hasta 10 diferentes autoanticuerpos en un pozo solo con una pequeña cantidad de suero. Actualmente, cuatro autoanticuerpos islote incluyendo IAA, GADA, IA-2A y ZnT8A son iguales en importancia para la predicción del riesgo de progresión a la T1D en ambos parientes de pacientes con T1D y la población en general. Los métodos utilizados para la detección de estos 4 autoanticuerpos utilizando medidas actuales solo autoanticuerpo son laboriosos e ineficaz, especialmente para la proyección de población a gran escala. Lo importante, hasta un 40% de los pacientes con T1D tienen una condición autoinmune adicional16,17,18. Desafortunadamente, no hay ninguna herramienta fácil y barata para detectar estas condiciones. El ensayo múltiple de ECL no sólo es capaz de combinar 4 ensayos de autoanticuerpo islote principal actual en uno, pero también es capaz de combinar más ensayos de autoanticuerpo más de otras enfermedades autoinmunitarias pertinentes. Esto hace posible llevar a cabo eficientemente alto rendimiento detección de enfermedades autoinmunes múltiples simultáneamente en las poblaciones a gran escala. En el ensayo múltiple de ECL, como se muestra en [figura 6], cada complejo antígeno-anticuerpo formado en la fase de fluido será restringida a un punto de origen específico vinculador en el mismo bien. El receptor de la señal en el equipo lector de placa es capaz de reconocer las señales de 10 fuentes diferentes de manchas. Sin embargo, los puntos con una señal muy alta pueden generar un fondo de ensayo alta y causa interferencia a puntos vecinos a través de la charla de la Cruz. Por esta razón, las señales de límite máximo para cada ensayo de autoanticuerpo deben limitarse a menos de 20.000 cuentas. En nuestra experiencia, los autoanticuerpos con fondos inferiores deben colocarse relativamente lejos de los lugares con cuentas más altas cuando se diseña el mapa punto. Para estudios a largo plazo utilizando ensayos multiplexores de ECL, se recomienda utilizar el vinculador mismo para el mismo ensayo de autoanticuerpo para mantener el ensayo constante.

Un sistema de clasificación reciente puesta en escena ha sido creado para ayudar en el diagnóstico de estadios iniciales de T1D en pacientes. Exacto de la detección de autoanticuerpos del islote humano desempeña un papel importante en la identificación y puesta en escena presintomáticos diabetes tipo 1, como la presencia de autoanticuerpos islote indica la presencia de autoinmunidad de la célula β. La tasa en que diabetes afecta a pacientes de la ocurrencia inicial de la autoinmunidad de la célula β a la enfermedad sintomática, asociada con el número y tipo de autoanticuerpos del islote, es variable de2,3.
La edad de seroconversión del autoanticuerpo, título y afinidad de autoanticuerpos islote puede afectar la tasa de progresión a síntomas tipo 1 diabetes4,5,6,7,8 ,9,10. Recientemente desarrollados ensayos ECL han sido ampliamente validados, han demostrado una mayor sensibilidad y son más específicos de la enfermedad10,11,12,13. Estos ensayos mejoran la predicción y la puesta en escena de riesgo de la diabetes a través de la detección anterior de islote autoanticuerpos. Más precisamente marca el inicio de la autoinmunidad de los islotes pancreáticos e ignorar las señales de baja afinidad y bajo riesgo no pertinentes a la diabetes.
En un ensayo de ECL, los autoanticuerpos en el suero, si presente, puente el antígeno conjugado con Sulfo-etiqueta a los antígenos de captura biotinilado en la fase fluida. Después de tender un puente sobre, el vinculador de biotina es atrapado en la fase sólida y detectado mediante ECL de la Sulfo-etiqueta en la placa de streptavidin recubierto (figura 1).
En esta revisión, principalmente se utilizan ensayos de ECL solo anticuerpo con los autoanticuerpos del islote humano. Brevemente, multiplexado de anticuerpo ensayos basados en ensayos de ECL solo serán discutidos. El ensayo múltiplex puede utilizarse para identificar múltiples, hasta 10, autoanticuerpos dentro de un solo bien, con 15 μl de suero. Este ensayo simple de alto rendimiento puede utilizarse para la pantalla, simultáneamente, múltiples autoanticuerpos múltiples enfermedades autoinmune relevante en la población general.

<table><tbody><tr><td>Proteína proinsulina recombinante humana (PINS)</td><td>AmideBio</td><td>Proinsulina humana, Rec</td><td></td></tr><tr><td>Proteína GAD65 recombinante humana</td><td>Diamyd</td><td>rhGAD65</td><td></td></tr><tr><td>Proteína IA-2 recombinante humana</td><td>Creative BioMart</td><td>IA2</td><td></td></tr><tr><td>1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, pH 7.4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>SIGMA-ALORICH</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>Placa de PCR de 96 pocillos&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>14230232</td><td></td></tr><tr><td>Placa recubierta de estreptavidina</td><td>MSD</td><td>L15SA</td><td></td></tr><tr><td>Columna giratoria de dimensionamiento Zeba</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89890</td><td></td></tr><tr><td>Twen-20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PI21329</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueador MSD</td><td></td><td>R91AO-1</td><td></td>con etiqueta de sulfos</tr>, <tr><td>A</td><td>MSD</td><td>R93AA-1</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lectura 4x T con tensioactivo</td><td>MSD</td><td>R92TC-1</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-PEG4-Biotina</td><td>ThermoScience</td><td>21329</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-TAG</td><td>MSD</td><td>R91AO-1</td><td></td>Placa de reacción en cadena de</tr> la <tr><td>polimerasa (PCR) de 96 pocillos</td> Placa de <td></td> estreptavidina de <td></td> 96 pocillos 14230232 <td></td></tr><tr>de la marca<td></td><td>Fisher MSD GOLD</td><td>L 15SA-1</td><td></td></tr><tr><td>Columna de desalinización de centrifugado Zeba</td><td>ThermoScience</td><td>PL208984</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de placas de 96 pocillos</td><td>Perkin Elmer</td><td>1296-003</td><td></td></tr><tr><td>MSD</td><td></td><td>QuickPlex SQ120</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa con cangilón giratorio</td><td>Beckman</td><td>Allegra X-15R</td><td></td></tr></tbody></table>

electrochemiluminescence ensayos para autoanticuerpos islote humano

Electrochemiluminescence Assays for Human Islet Autoantibodies

Localización de autoanticuerpos islote asociados con diabetes tipo 1 (T1D) lidera el camino para proyectar y prevenir esta enfermedad en la población general. Un análisis nuevo de la ECL es un ensayo de fase líquido no radiactiva para autoanticuerpos islote con mayor sensibilidad y especificidad que el actual 'gold' estándar radio enlace ensayo (RBA). Ensayos de ECL pueden definir más precisamente la aparición de T1D presintomáticos distinguiendo los autoanticuerpos de alto riesgo, alta afinidad de los autoanticuerpos de bajo riesgo, baja afinidad generados en drea y ensayos convencionales enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA ). La proteína del antígeno utilizada en este ensayo de ECL se etiqueta con etiqueta de Sulfo y biotina, respectivamente. Cada ensayo de autoanticuerpo ECL que utiliza una proteína particular necesita un paso de optimización antes de que puede ser utilizado para aplicaciones de laboratorio. Este paso es especialmente vital en la determinación de los requisitos para tratamientos ácidos del suero, las concentraciones y proporciones de los dos antígenos diferentes marcados con etiqueta de Sulfo y biotina. Para realizar el ensayo, las muestras se mezclan con Sulfo-etiqueta-conjugado suero y biotinilado captura proteína en solución amortiguada de fosfatos (PBS), que contiene 5% albúmina de suero bovino (BSA). Luego, las muestras se incuban toda la noche a 4 ° C. El mismo día, una placa recubierta estreptavidina es preparada con tampón de bloqueador y se incubó toda la noche a 4 ° C. En el segundo día, lave la placa de estreptavidina y transferir la mezcla suero-antígeno sobre la placa. Coloque la placa en la coctelera de placa, ajuste de velocidad baja e incubar a temperatura ambiente durante 1 h. Posteriormente, la placa se lava otra vez, y se añade tampón de lector. La placa se cuenta en el equipo lector de placa. Los resultados se transmiten a través de un índice, que se genera a partir de las muestras de suero control positivo y negativo estándar interno.

La figura 2 muestra la placa del corrector. Se muestra que 250 ng/mL de biotina y 250 ng/mL de antígeno marcado son las concentraciones más racionales utilizadas en el ensayo teniendo en cuenta las señales de la muestra control positivo alto, la muestra control negativo como antecedentes del ensayo y la relación de Sulfo-etiqueta positiva a las señales negativas. Con las concentraciones optimizadas de estos dos antígenos marcados, el ensayo se realizó con las muestras de suero de 100 pacientes recién diagnosticados con T1D y 100 controles sanos. El valor del índice de 0.023 se definió como el corte de ensayo para la positividad. Esto representa sensibilidad 85% especificidad pacientes y 99% en controles sanos utilizando el receptor característico de la curva (ROC) se muestra en la Figura 3A. Se realizó el ensayo para las muestras desconocidas con internos positivos alto estándar, pocos positivos y muestras de control negativas. Se muestran los resultados de las cuentas de CPS en tabla 2A. El medio CPS de controles positivos de alta y baja están resaltadas en rojo, [(19940+15866) 17903/2] y 839 [(857+820)/2], y los controles negativos se resaltarán en verde, 168 [(170+165)/2]. Se calcula el índice de muestras desconocidas "(CPSmuestra-168)/(17903-168)." Tabla 2B muestra los valores del índice calculado para todas las muestras. Los valores de índice que son mayores a 0.023 están escritos en rojo, correspondiente a los valores de la CPS también escritos en rojo en la tabla 2A. Estos valores se define como los resultados positivos que superanel percentil 99 de la población control sana . Cuando se utiliza una concentración de antígeno irracional, el ensayo tendrá un fondo alta, como se muestra en la tabla 2 C. Extrañaremos a niveles bajos de anticuerpos positivos como los valores A2, A5, D1 y H4 resaltadas en gris en la tabla 2D.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig1.jpg"> Figura 1 : Ilustración de una captura de bivalente de la placa de un solo análisis de ECL-IAA. El autoanticuerpo del islote en los puentes de suero el Sulfo-tag conjugado antígeno a antígeno de captura biotinilado, que es capturado en la fase sólida en la placa revestida de estreptavidina. Detección de antígeno conjugado de Sulfo-tag placa capturado se logra a través de ECL. Esta figura ha sido modificada desde Yu, et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig1large.jpg" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig2.jpg"> Figura 2 : Curva de la ROC para determinar el punto de corte de positividad de la prueba. El percentil 99 de especificidad corresponden a 85% de sensibilidad fue seleccionado y se representa como un valor de índice de 0.023. Este límite del ensayo fue tomado de 100 controles sanos. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig3.jpg"> Figura 3 : Ilustración del suero humano normal, bloqueando las señales ECL-IAA. A: las señales de ensayos ECL-IAA con un anticuerpo monoclonal de insulina (MoAb) drásticamente fueron bloqueadas por la adición de suero humano normal. Al comparar el MoAb en PBS, la señal fue restaurada parcialmente cuando el suero humano fue tratado con ácido. B: las señales de un ensayo de ECL-IAA con suero del paciente 4 mejoraron significativamente con el tratamiento con ácido. Esta figura ha sido modificada desde Yu, et al. 11. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig3large.jpg" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57227/57227fig4.jpg"> Figura 4 : Ilustración del ensayo Mutiplex ECL. Complejos antígeno-anticuerpo se forman en la fase de fluido con conectores específicos. Los complejos del anticuerpo-antígeno-linker específicos se refrenan en cada uno de los puntos específicos de vinculador en el mismo bien. La máquina de lector de placa es capaz de distinguir las señales de diferentes fuentes de manchas y da cuenta de CPS en 10 canales diferentes, respectivamente. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/57227/57227tbl1.jpg"> Tabla 1: Análisis de Checker board determinan las concentraciones y proporciones de biotina y Sulfo-tag etiqueta antígenos. R: raw CPS cuenta la placa del inspector de tablero con suero positivo alto en la mitad de la placa y el suero negativo en la otra mitad. La concentración de antígeno biotinilado se diluyó horizontalmente en serie y la concentración de Sulfo-etiqueta marcado antígeno se diluyó verticalmente en serie. B: los valores de la relación de las cuentas de CPS del suero positivo alto a cada uno de sus correspondientes cuentas de CPS del suero negativo. Los pozos resaltados amarillo representan la mejor relación de positiva a negativa en el Panel B. Esta proporción corresponde a 250 ng/mL biotina y 250 ng/mL Sulfo-etiqueta marcada las concentraciones de antígeno en el Panel A con una cuenta de CPS aceptablemente baja de suero negativo. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227tbl1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta mesa.</a>
<img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/57227/57227tbl2.jpg"> Tabla 2: Análisis de resultados. A: CPS cruda cuenta de la placa de ensayo con los controles positivos alto y bajo estándar resaltados en rojo y los controles negativos estándar resaltados en verde. Cada muestra fue duplicado en el ensayo. B: se calcularon valores de índice, como se describe en el protocolo de ensayo. Cualquier valor de índice que fue mayor a 0.023 fue definido como un resultado positivo, resaltado en rojo. C: CPS cruda cuenta de la placa de ensayo con el mismo conjunto de muestras cuando se utilizó una concentración de antígeno irracional. Esto dio lugar a un fondo de alta y algunos pocos positivos normalmente se detecta, como se muestra en el Panel B, se convirtieron en negativos, resaltadas en gris en el Panel D. <a href="/files/ftp_upload/57227/57227tbl2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta mesa.</a>

Aquí, presentamos los métodos para la detección de autoanticuerpos del islote humano usando análisis electrochemiluminescence (ECL). El protocolo, utilizado para predecir la diabetes tipo 1, se puede ampliar a detectar autoanticuerpos para otras enfermedades autoinmunes.

Electrochemiluminescence ensayos para autoanticuerpos islote humano

Pinpointing islet autoantibodies associated with type 1 diabetes (T1D) leads the way to project and deter this disease in the general population. A novel ...

El objetivo general de este ensayo de electroquimioluminiscencia es detectar atutoanticuerpos de los islotes en la diabetes autoinmune tipo uno, con alta sensibilidad y alta especificidad. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la diabetes tipo uno, como el momento del inicio de la autoinmunidad de los islotes y la predicción de alto riesgo para la diabetes tipo uno. La principal ventaja de esta técnica es que es más sensible, más específica de la enfermedad y no radiactiva en comparación con los radioensayos estándar actuales.La implicación de esta técnica se extiende hacia la predicción y el diagnóstico de la diabetes tipo uno, ya que estos autoanticuerpos de los islotes aparecen meses o años antes de la enfermedad clínica sintomática. Aunque este método puede proporcionar información sobre la predicción de la diabetes tipo uno, también se puede aplicar para estudiar otras enfermedades autoinmunes, como los autoanticuerpos contra la transglutaminasa para la enfermedad celíaca a TPO y tiroglobulina para la enfermedad tiroidea autoinmune y varias otras. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando descubrimos que la técnica se basa en una alta sensibilidad y no radiactividad.A diferencia del método ELISA convencional, que no funciona bien para la detección de autoanticuerpos en ningún islote. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el ensayo de autoanticuerpos contra la insulina con tratamiento con ácido sérico es difícil de describir en el texto. El encargado de demostrar el procedimiento será Yong Gu, un postdoc de mi laboratorio.Primero, mezcle el autoantígeno del islote humano con biotina o SULFO-TAG en una proporción de uno a cinco molares en un tubo. Y cubra el tubo con papel de aluminio, ya que ambas etiquetas son sensibles a la luz. Luego, incuba el tubo durante una hora a temperatura ambiente.Mientras tanto, cuando la incubación está en marcha, prepare la columna de centrifugación con solución salina tamponada con fosfato de dos pliegues. A continuación, centrifuga la columna a 1.000 veces la gravedad durante dos minutos cada vez. A continuación, centrifugar la mezcla de marcadores de autoantígenos en la columna de centrifugación a 1.000 veces la gravedad durante dos minutos.Luego, alícuota y almacene el antígeno marcado a menos 80 grados centígrados. A continuación, utilice la concentración racional del antígeno marcado con biotina SULFO-TAG basada en el ensayo de tablero de ajedrez para el tampón de antígenos, para preparar tres mililitros de solución de antígenos por placa de 96 pocillos. Luego, en cada pocillo, agregue cuatro microlitros de suero y ajuste el volumen final a 20 microlitros con solución salina tamponada con fosfato de un pliegue.Luego, agregue 20 microlitros de solución de antígeno marcado en cada pocillo. Y cubra la placa con papel de sellado para evitar la luz. Luego, transfiera el plato en una coctelera a temperatura ambiente durante dos horas.Una vez que se detenga la coctelera, deje el plato a cuatro grados centígrados en el refrigerador durante 18 a 24 horas. Ahora, mezcle 15 microlitros de suero con 18 microlitros de ácido acético 0,5 molar por cada muestra e incube la misma a temperatura ambiente durante 45 minutos. Sobre la base del ensayo de tablero de ajedrez, utilice la concentración racional del antígeno marcado con biotina SULFO-TAG para preparar la solución de antígeno.A continuación, alícuota 35 microlitros del tampón de antígeno en cada pocillo de una nueva placa de PCR. Justo antes de completar el curso de incubación de la mezcla de suero, agregue 3,8 microlitros de un tampón Tris molar a PH nueve, al lado de cada pocillo en la placa de antígeno. Una vez finalizada la incubación, transfiera rápidamente 25 microlitros del suero tratado con ácido acético en cada pocillo de la placa de antígenos y agite la solución.A continuación, cubra la placa de PCR con papel de sellado para evitar la luz y colóquela en un agitador a temperatura ambiente durante dos horas. Una vez hecho esto, transfiera la placa a cuatro grados centígrados en el refrigerador e incube durante 18 a 24 horas. Retire una placa de estreptavidina del refrigerador a cuatro grados centígrados y deje que la placa alcance la temperatura ambiente.Después de que la placa de estreptavidina alcance la temperatura ambiente, agregue 150 microlitros de bloqueador A al 3% en cada pocillo y cubra la placa de PCR con papel de sellado e incube en el refrigerador durante la noche. Al día siguiente, retire la placa de estreptavidina del refrigerador y expulse el tampón de los pocillos. Luego, seca el plato colocándolo boca abajo sobre algunas toallas de papel para que el tampón restante se empape.Luego, agregue 150 microlitros de tampón PBST de un pliegue para lavar el pozo durante tres lavados consecutivos. A continuación, transfiera 30 microlitros de antígeno sérico incubado en cada pocillo de la placa de estreptavidina y cubra la placa con papel de aluminio para evitar la luz. Luego, transfiera el plato en una coctelera a temperatura ambiente durante una hora.Después de una hora, deseche el antígeno sérico incubado de la placa y agregue 150 microlitros de tampón PBST de un pliegue para lavar el pocillo tres veces. Una vez terminado el lavado, agregue 150 microlitros de tampón de lectura a cada pocillo para leer en un lector de platos. Antes de analizar cualquier muestra desconocida, el límite de prueba para cada ensayo de autoanticuerpos se estableció mediante la prueba de alrededor de 100 pacientes con diabetes tipo uno y alrededor de 100 controles sanos.Luego, se trazó una curva ROC para determinar el índice óptimo de límite superior de normal para el ensayo GADA, que fue de 0,023, con el fin de obtener la mejor sensibilidad y especificidad. Luego, se calculó el resultado de la muestra desconocida utilizando una ecuación derivada de estándares de control positivos altos, positivos bajos y negativos. A continuación, se trazó un gráfico para determinar las señales obtenidas en el ensayo de autoaticuerpo de los islotes en la incubación del anticuerpo monoclonal de insulina con suero humano normal en presencia y ausencia de tratamiento ácido.El gráfico muestra que la señal se bloquea marcadamente tras la adición de suero normal en ausencia de tratamiento ácido. Por el contrario, la señal obtenida es comparativamente mayor cuando el suero se somete a un tratamiento ácido antes de la incubación con el anticuerpo monoclonal insulina. También se trazó un gráfico similar para determinar las señales obtenidas utilizando sueros de pacientes extranjeros en presencia y ausencia de tratamiento ácido.El tratamiento del paciente con ácido antes de la incubación con el anticuerpo aumenta significativamente las señales en el ensayo de autoanticuerpos de los islotes cuando se comparan en ausencia de tratamiento. Una vez dominada, esta técnica se puede hacer fácilmente para varios cientos de muestras en un día si se prepara correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar el ensayo de tablero de ajedrez para cada ensayo de autoanticuerpos para optimizar la condición del ensayo.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para los investigadores en el campo de la diabetes tipo uno autoinmune para la predicción y prevención. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de la facilidad con la que se debe realizar este ensayo. No olvide que trabajar con muestras de suero puede ser peligroso y contagioso.Siempre se deben tomar precauciones para evitar el contacto directo con la piel mientras se realiza este procedimiento.

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