Electrochemiluminescence ensayos para autoanticuerpos islote humano

Aquí, presentamos los métodos para la detección de autoanticuerpos del islote humano usando análisis electrochemiluminescence (ECL). El protocolo, utilizado para predecir la diabetes tipo 1, se puede ampliar a detectar autoanticuerpos para otras enfermedades autoinmunes.

El objetivo general de este ensayo de electroquimioluminiscencia es detectar atutoanticuerpos de los islotes en la diabetes autoinmune tipo uno, con alta sensibilidad y alta especificidad. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la diabetes tipo uno, como el momento del inicio de la autoinmunidad de los islotes y la predicción de alto riesgo para la diabetes tipo uno. La principal ventaja de esta técnica es que es más sensible, más específica de la enfermedad y no radiactiva en comparación con los radioensayos estándar actuales.

La implicación de esta técnica se extiende hacia la predicción y el diagnóstico de la diabetes tipo uno, ya que estos autoanticuerpos de los islotes aparecen meses o años antes de la enfermedad clínica sintomática. Aunque este método puede proporcionar información sobre la predicción de la diabetes tipo uno, también se puede aplicar para estudiar otras enfermedades autoinmunes, como los autoanticuerpos contra la transglutaminasa para la enfermedad celíaca a TPO y tiroglobulina para la enfermedad tiroidea autoinmune y varias otras. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando descubrimos que la técnica se basa en una alta sensibilidad y no radiactividad.

A diferencia del método ELISA convencional, que no funciona bien para la detección de autoanticuerpos en ningún islote. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el ensayo de autoanticuerpos contra la insulina con tratamiento con ácido sérico es difícil de describir en el texto. El encargado de demostrar el procedimiento será Yong Gu, un postdoc de mi laboratorio.

Primero, mezcle el autoantígeno del islote humano con biotina o SULFO-TAG en una proporción de uno a cinco molares en un tubo. Y cubra el tubo con papel de aluminio, ya que ambas etiquetas son sensibles a la luz. Luego, incuba el tubo durante una hora a temperatura ambiente.

Mientras tanto, cuando la incubación está en marcha, prepare la columna de centrifugación con solución salina tamponada con fosfato de dos pliegues. A continuación, centrifuga la columna a 1.000 veces la gravedad durante dos minutos cada vez. A continuación, centrifugar la mezcla de marcadores de autoantígenos en la columna de centrifugación a 1.000 veces la gravedad durante dos minutos.

Luego, alícuota y almacene el antígeno marcado a menos 80 grados centígrados. A continuación, utilice la concentración racional del antígeno marcado con biotina SULFO-TAG basada en el ensayo de tablero de ajedrez para el tampón de antígenos, para preparar tres mililitros de solución de antígenos por placa de 96 pocillos. Luego, en cada pocillo, agregue cuatro microlitros de suero y ajuste el volumen final a 20 microlitros con solución salina tamponada con fosfato de un pliegue.

Luego, agregue 20 microlitros de solución de antígeno marcado en cada pocillo. Y cubra la placa con papel de sellado para evitar la luz. Luego, transfiera el plato en una coctelera a temperatura ambiente durante dos horas.

Una vez que se detenga la coctelera, deje el plato a cuatro grados centígrados en el refrigerador durante 18 a 24 horas. Ahora, mezcle 15 microlitros de suero con 18 microlitros de ácido acético 0,5 molar por cada muestra e incube la misma a temperatura ambiente durante 45 minutos. Sobre la base del ensayo de tablero de ajedrez, utilice la concentración racional del antígeno marcado con biotina SULFO-TAG para preparar la solución de antígeno.

A continuación, alícuota 35 microlitros del tampón de antígeno en cada pocillo de una nueva placa de PCR. Justo antes de completar el curso de incubación de la mezcla de suero, agregue 3,8 microlitros de un tampón Tris molar a PH nueve, al lado de cada pocillo en la placa de antígeno. Una vez finalizada la incubación, transfiera rápidamente 25 microlitros del suero tratado con ácido acético en cada pocillo de la placa de antígenos y agite la solución.

A continuación, cubra la placa de PCR con papel de sellado para evitar la luz y colóquela en un agitador a temperatura ambiente durante dos horas. Una vez hecho esto, transfiera la placa a cuatro grados centígrados en el refrigerador e incube durante 18 a 24 horas. Retire una placa de estreptavidina del refrigerador a cuatro grados centígrados y deje que la placa alcance la temperatura ambiente.

Después de que la placa de estreptavidina alcance la temperatura ambiente, agregue 150 microlitros de bloqueador A al 3% en cada pocillo y cubra la placa de PCR con papel de sellado e incube en el refrigerador durante la noche. Al día siguiente, retire la placa de estreptavidina del refrigerador y expulse el tampón de los pocillos. Luego, seca el plato colocándolo boca abajo sobre algunas toallas de papel para que el tampón restante se empape.

Luego, agregue 150 microlitros de tampón PBST de un pliegue para lavar el pozo durante tres lavados consecutivos. A continuación, transfiera 30 microlitros de antígeno sérico incubado en cada pocillo de la placa de estreptavidina y cubra la placa con papel de aluminio para evitar la luz. Luego, transfiera el plato en una coctelera a temperatura ambiente durante una hora.

Después de una hora, deseche el antígeno sérico incubado de la placa y agregue 150 microlitros de tampón PBST de un pliegue para lavar el pocillo tres veces. Una vez terminado el lavado, agregue 150 microlitros de tampón de lectura a cada pocillo para leer en un lector de platos. Antes de analizar cualquier muestra desconocida, el límite de prueba para cada ensayo de autoanticuerpos se estableció mediante la prueba de alrededor de 100 pacientes con diabetes tipo uno y alrededor de 100 controles sanos.

Luego, se trazó una curva ROC para determinar el índice óptimo de límite superior de normal para el ensayo GADA, que fue de 0,023, con el fin de obtener la mejor sensibilidad y especificidad. Luego, se calculó el resultado de la muestra desconocida utilizando una ecuación derivada de estándares de control positivos altos, positivos bajos y negativos. A continuación, se trazó un gráfico para determinar las señales obtenidas en el ensayo de autoaticuerpo de los islotes en la incubación del anticuerpo monoclonal de insulina con suero humano normal en presencia y ausencia de tratamiento ácido.

El gráfico muestra que la señal se bloquea marcadamente tras la adición de suero normal en ausencia de tratamiento ácido. Por el contrario, la señal obtenida es comparativamente mayor cuando el suero se somete a un tratamiento ácido antes de la incubación con el anticuerpo monoclonal insulina. También se trazó un gráfico similar para determinar las señales obtenidas utilizando sueros de pacientes extranjeros en presencia y ausencia de tratamiento ácido.

El tratamiento del paciente con ácido antes de la incubación con el anticuerpo aumenta significativamente las señales en el ensayo de autoanticuerpos de los islotes cuando se comparan en ausencia de tratamiento. Una vez dominada, esta técnica se puede hacer fácilmente para varios cientos de muestras en un día si se prepara correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar el ensayo de tablero de ajedrez para cada ensayo de autoanticuerpos para optimizar la condición del ensayo.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para los investigadores en el campo de la diabetes tipo uno autoinmune para la predicción y prevención. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de la facilidad con la que se debe realizar este ensayo. No olvide que trabajar con muestras de suero puede ser peligroso y contagioso.

Siempre se deben tomar precauciones para evitar el contacto directo con la piel mientras se realiza este procedimiento.