Reconfigurable canal microfluídico con flancos discretizar Pin

El objetivo general de este procedimiento es fabricar un dispositivo microfluídico reconfigurable con paredes laterales hechas de una matriz de pines. La principal ventaja de este dispositivo microfluídico es su capacidad para tratar objetos y situaciones difíciles de fluir que pueden ser desconocidas en la etapa de diseño del canal. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades para grabar pequeños alfileres en formas de huesos de perro.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que el ensamblaje de muchas piezas microfluídicas y el montaje de ellas en la base son difíciles de aprender solo a partir del protocolo escrito. Esta foto es del dispositivo microfluídico completo con un canal reconfigurable. Aquí, la parte reconfigurable se encuentra en la parte superior de la imagen.

Un esquema de vista despiezada revela algunos de sus componentes principales. En particular, observe el microcanal y los pines utilizados para reconfigurarlo. Como primer paso, graba los alfileres.

Comience con pasadores de acero inoxidable desengrasados, de 0,3 milímetros de grosor, en forma de L, de diferentes longitudes. Tenga listos cuatro mililitros de ácido nítrico al 10% y sumerja los alfileres en él. Luego, coloque el recipiente en un horno a 65 grados centígrados durante 30 minutos.

Después de recuperar los alfileres, transfiéralos con pinzas uno por uno a un recipiente con agua desionizada. A continuación, sonicatelos en el agua durante cinco minutos. Cuando estén listos, sécalos con una toalla de papel.

Tenga a mano 0,5 mililitros de agente desmoldante y sumerja los alfileres en él. Después de dos horas, coloque los alfileres en agua desionizada y soniquelos durante cinco minutos. Continuar requiere un plato de grabado.

El plato de grabado está construido con vidrio y adhesivo de silicona. Comience el proceso de grabado dispensando adhesivo de silicona para los extremos de los alfileres del plato. Coloque los alfileres de modo que las puntas de sus extremos rectos queden sumergidas en el adhesivo.

Este es el plato después de que todos los alfileres estén en su lugar y listos para el siguiente paso. Transfiera el plato de grabado a un fermentador humidificado calentado a 38 grados centígrados y espere toda la noche para curar el adhesivo. Cuando esté listo, coloque el plato de grabado con alfileres en una placa calefactora a 65 grados centígrados.

Vierta 0,8 mililitros de ácido de grabado sobre la región descubierta de los alfileres. Después de 10 minutos, transfiera el ácido a un vaso de precipitados con una micropipeta. Luego, agregue más ácido de grabado al plato para repetir el paso de grabado.

Después del grabado, compruebe que el ancho de la región grabada sea de aproximadamente 0,2 milímetros. Si es así, micropipetee cinco mililitros de solución de bicarbonato de sodio en la placa de grabado para neutralizar el ácido restante. A continuación, utilice un par de pinzas para quitar los alfileres tirando longitudinalmente.

Comience con un molde fabricado. Al igual que en este esquema, el molde es para un dispositivo con una pared lateral fija y espacio para alfileres. Crea el molde en un portaobjetos de vidrio usando litografía.

Coloque el portaobjetos preparado en el fondo de un plato de plástico. Ahora, vierta el prepolímero de PDMS en el molde hasta un grosor de tres milímetros. Coloque el plato en un desecador al vacío durante 10 minutos.

Después de eso, muévalo a un horno a 65 grados centígrados durante una hora. El resultado es una losa parcialmente curada. Use un bisturí para desmoldar la losa para los siguientes pasos.

Coloque la losa en un horno a 120 grados centígrados durante una hora para que se cure por completo. Ahora, trabaje con la losa completamente curada. Tendrá bordes irregulares a lo largo del patrón de la guía.

Utilice un bisturí para recortar con precisión y limpieza los bordes irregulares. Preste especial atención a la superficie de las ranuras de inserción de pines para crear el mejor dispositivo. Perfore los orificios de entrada/salida de la cámara principal y de otros lugares con punzones de biopsia.

Ahora, fabrique un ensamblaje de microcanal. Caliente una solución de limpieza a 60 grados centígrados y obtenga un cubreobjetos número cuatro. El cubreobjetos mide 10 milímetros por 20 milímetros.

Sumerge el cubreobjetos en la solución durante 10 minutos. Coloque el cubreobjetos enjuagado y seco y la losa de PDMS en el electrodo inferior de un recubridor por pulverización catódica. Genere plasma de vacío de aire durante 30 segundos.

Adhiera el elemento recuperado para que los bordes se alineen y las características del canal sean visibles a través del cubreobjetos. Utilice un recipiente estéril para llevar las capas adheridas a una funda laminar para esterilizarlas. Cuando termine, inserte los pasadores en la ranura.

Los pines adyacentes deben ser de diferentes longitudes. Los pines forman la otra pared lateral de la microcámara. Continúe trabajando en la campana laminar.

Para los siguientes pasos, tenga una base lista para el dispositivo. Prepare el relleno de huecos homogeneizando una mezcla de vaselina blanca y polvo de politetrafluoroetileno. Vierta la mezcla homogeneizada en una jeringa dispensadora e inserte un émbolo.

Empuje el émbolo para llenar la punta de la jeringa. Luego, coloque una aguja y empuje el émbolo hasta que la aguja esté llena. Prepare una segunda jeringa con adhesivo de silicona de manera similar y conecte cada una a un dispensador neumático.

Ahora, dispense adhesivo de silicona en la base. Colócalo a lo largo de uno de los bolsillos. Luego, coloque un cubreobjetos número cuatro en el bolsillo y presiónelo firmemente para unirlo.

A continuación, dispense adhesivo de silicona a lo largo de las dos ranuras exteriores de la base dibujando segmentos de aproximadamente un milímetro de profundidad. A lo largo de otra ranura en el medio, dispense el relleno de espacios en un segmento de un milímetro de profundidad. Coloca más adhesivo en el borde del otro bolsillo.

Coloque un conjunto de microcanal en el bolsillo y presiónelo firmemente. Una vez más, coloque relleno de espacio en la ranura a lo largo del centro de la base. A continuación, coloque adhesivo en las ranuras adyacentes.

Deje reposar el dispositivo durante un día en la campana estéril. Después del curado, en la campana laminar, mueva cada pin hasta un milímetro a lo largo de sus pines adyacentes para liberarlos de la barrera elastomérica. Establezca una prueba de fluorescencia para fugas diluyendo un tinte verde fluorescente en agua ionizada.

A continuación, abra el microcanal para que tenga un ancho coherente en todo momento. Utilice una micropipeta para transferir el tinte a un puerto final del microcanal y llénelo con la solución. En un plato de plástico grande, coloque dos trozos de papel absorbente mojados con agua desionizada y el dispositivo en su interior.

Incubar la placa en dióxido de carbono al 5% durante al menos 24 horas a 37 grados centígrados. Visualice el dispositivo recuperado con un microscopio fluorescente invertido y grabe imágenes. Úselos para confirmar que no haya fugas alrededor de los pines.

Estas imágenes son de una muestra con fugas y sin fugas. Otra prueba consiste en sembrar células. Abra el microcanal para hacer un canal recto de 400 micras de ancho con la pared lateral lo más plana posible.

Agregue la suspensión de la celda a un puerto final para llenar el canal. Localice los pines que definen la pared lateral de la región para iniciar el cultivo celular y ciérrelos para encerrar las células de la región. Comenzando cerca de la región, cierre todos los pines para expulsar las celdas en el canal.

Después de aspirar la suspensión desde los puertos de los extremos, agregue medio. Coloque el dispositivo en un recipiente de plástico con papel absorbente húmedo. Incubar durante un mínimo de 24 horas.

Busque que las celdas sean aproximadamente 10 celdas por en el área cerrada. Luego, retraiga lentamente un alfiler para ampliar el área de cultivo. Estas imágenes son de células COS-7 cultivadas en un microcanal reconfigurable.

A lo largo de nueve días, se amplió el área de cultivo de microcanales. Los datos recopilados permiten trazar el recuento de células y la densidad en función del tiempo. Los puntos azules y el ajuste de la curva son para el recuento de celdas.

Los símbolos rojos y los ajustes son para la densidad. Para la densidad, las flechas verticales indican la expansión del área de cultivo celular a los dos, cinco y seis días. Las densidades se calculan para las mismas áreas de cultivo.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir una pared lateral sin fugas de un canal microfluídico a partir de pequeños pines. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una semana si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante realizar cada uno de los pasos del protocolo con cuidado y minuciosidad.

No olvide que trabajar con ácido fuerte puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como la preparación de una cantidad adecuada de agente neutralizante. Siguiendo estos procedimientos, se pueden introducir otras células con líquido para establecer cultivos celulares más complejos.