Name: Un modelo de Ovo para probar compuestos de insulina-mimético (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Aprende a utilizar un modelo modificado de embrión de pollo in ovo para evaluar compuestos insulinomiméticos y extractos herbales que reducen la glucosa sanguínea. Este método permite probar eficacia y toxicidad en un organismo vivo sin necesidad de aprobación ética.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue financiado por la Agencia de promoción de investigación austríaco (FFG; número de proyecto 850681), la iniciativa de la University of Applied Sciences superior Austria financiamiento básico (proyecto GlucoSTAR) y el centro para la innovación tecnológica en medicina (tiempo centro) recibe financiamiento básico por la provincia de alta Austria.

Según la Directiva 2010/63/EU, los experimentos con embriones aves no nacieron durante los primeros dos tercios del desarrollo embrionario no es necesario permiso de un Comité de ética.
1. almacenamiento y crianza de los huevos
<ol><li>Obtener huevos de gallina fertilizados (Tabla de materiales) de un criador local. Nota: Huevos pueden ser almacenados a 14 º C en un ambiente humidificado hasta 10 días después de la colocación antes de utilizar para los experimentos.</li>
	<li>Incubar los huevos a 38 ° C con una humedad promedio de 40-60% para 10 o 11 días en una incubadora que constantemente da vuelta los huevos.</li>
</ol>2. selección de los huevos
<ol><li>Compruebe los huevos para la fertilización después de la incubación de hasta 11 días. Utilice una luz autónoma para este paso. Sumergir el borde de la lámpara autónoma en una almohadilla de tinta y la parte puntiaguda del huevo de la vela.</li>
	<li>Para identificar la vejiga de aire, comprobar las diferencias en brillo en la parte superior del huevo. Nota: La vejiga de aire aparece como una región más transparente, redonda, mientras que la albúmina es más oscuro cuando el huevo es candled.</li>
	<li>Después de la detección de la cámara de aire, marque la ubicación Presione la lámpara ligeramente contra el huevo con la tinta previamente aplicado.</li>
	<li>Excluye huevos no fecundados en este paso, que no muestran una diferencia de brillo entre la albúmina y la vejiga de aire.</li>
</ol>3. inyección de sustancias
<ol><li>Preparar la sustancia de interés(por ejemplo, el extracto herbario o insulina) diluyendo la sustancia en la concentración de tampón de solución salina balanceada (HBSS) de Hank. Por ejemplo, 3,3 U/mL de un análogo en HBSS comercialmente disponible de la insulina.</li>
	<li>Para la aplicación del compuesto seleccionado, peck con cuidado la cáscara del huevo con un acentuado pinzas en la zona de la vejiga de aire. No forman un agujero más grande que el diámetro de la aguja de la jeringa. Inyecte la solución tampón (300 μL) que contiene la sustancia de interés en el área de grabados a través de una jeringa. Nota: Uso estériles, 1 ml jeringas, puntas de pipetas y los vasos. Use guantes y una bata de laboratorio para los experimentos.</li>
	<li>Para determinar el efecto de reducción de glucosa de la sangre de una sustancia, coloque los huevos en la incubadora para 60, 120 y 180 min, respectivamente. Para determinar niveles de glucemia basal, incluyen por lo menos 10-15 huevos de control no tratados.</li>
</ol>4. toxicidad
<ol><li>Después de la aplicación del compuesto seleccionado durante 24 h, equilibre la membrana cascarón con tampón de fosfato salino tamponado (PBS) (suficiente para cubrir la membrana de la cáscara de huevo entero) durante al menos 30 s.</li>
	<li>Retire el exceso de tampón PBS vertiendo lejos.</li>
	<li>Quitar la membrana de la cáscara de huevo cuidadosamente con una pinzas puntiagudas.</li>
	<li>Verificar los vasos sanguíneos de las lesiones y confirmar vitalidad (p. ej., movimiento) del embrión de pollo. Nota: Vea la figura 1 para la comparación de vital frente a embriones no vitales después de la aplicación de un extracto de hierbas tóxico.</li>
</ol>5. medición del valor de glucosa de sangre
<ol><li>En el momento respectivo, con cuidado retire la cáscara de huevo encima de la vejiga de aire y equilibrar la membrana cascarón con tampón PBS (suficiente para cubrir la membrana de la cáscara de huevo entero).</li>
	<li>Retire el exceso de tampón PBS vertiendo lejos.</li>
	<li>Cuidadosamente Quite la membrana cascarón con una pinzas puntiagudas.</li>
	<li>Corte y quite la membrana corioalantoideas con un micro tijera, para permitir buen acceso a vasos sanguíneos adecuados. Cortar la membrana por lo menos 2-3 cm. No corte ningún vasos grandes en la membrana para evitar la pérdida de sangre no deseados del embrión.</li>
	<li>Localizar el vaso grande que origina en el abdomen del embrión. Levantar este barco de la albúmina con una tijera de micro cerrado y coloca sobre una tira de pH de plástico. Mueva la tira de pH bajo el buque, que se celebra con la micro-tijera, y tire hacia atrás el micro tijera cuidadosamente.</li>
	<li>Quite el 1-2 mL del líquido debajo de la membrana corioalantoideas con una pipeta para evitar la dilución de la sangre en el siguiente paso. Seco del recipiente y la tira de pH con papel de filtro, antes de que el buque se corta.</li>
	<li>Cortar los vasos sanguíneos cuidadosamente con una tijera micro en un lado. No cortar completamente el recipiente. Nota: El vaso es de aproximadamente 1 mm de espesor. No corte más de la mitad de la embarcación para evitar cortar por el vaso, puede deslizarse de la tira y recolección de sangre no es posible.</li>
	<li>Recoger la sangre que se escapa en la tira de pH utilizando una pipeta. Diez microlitros de sangre se requieren para determinar los niveles de glucosa con el medidor de glucosa en sangre.</li>
</ol>6. estadística evaluación
<ol><li>Calcular el valor medio de al menos 10 huevos individuales por momento y normalizar estos valores a uno de los huevos de control (huevos tratados no o tampón).</li>
	<li>Posteriormente, determinar el porcentaje de disminución. Además, usar la insulina como control positivo. Nota: Repetir cada experimento por lo menos tres veces.</li>
</ol>

<ol><li>Defronzo, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Banting+Lecture.+From+the+triumvirate+to+the+ominous+octet%3A+a+new+paradigm+for+the+treatment+of+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Banting Lecture. From the triumvirate to the ominous octet: a new paradigm for the treatment of type 2 diabetes mellitus.</a> Diabetes. 58 (4), 773-795 (2009).</li>
<li>American_Diabetes_Association. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+classification+of+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and classification of diabetes mellitus.</a> Diabetes Care. 37, S81-S90 (2014).</li>
<li>Han Cho, N., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHan+Cho%2C+N+%22IDF+Diabetes+Atlas%22">IDF Diabetes Atlas</a>. Cavan, D. 7, International Diabetes Federation. (2015).</li>
<li>Bailey, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individualized+glycaemic+targets+and+pharmacotherapy+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+%26+vascular+disease+research%22%5BJournal%5D)">Individualized glycaemic targets and pharmacotherapy in type 2 diabetes.</a> Diabetes & vascular disease research. 10 (5), 397-409 (2013).</li>
<li>Maruthur, N. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27088241">Diabetes Medications as Monotherapy or Metformin-Based Combination Therapy for Type 2 Diabetes: A Systematic Review and Meta-analysis.</a> Annals of internal medicine. 164 (11), 740-751 (2016).</li>
<li>Aleman-Gonzalez-Duhart, D., Tamay-Cach, F., Alvarez-Almazan, S., Mendieta-Wejebe, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Advances+in+the+Biochemical+and+Physiological+Aspects+of+the+Treatment+of+Type+2+Diabetes+Mellitus+with+Thiazolidinediones%5BTitle%5D)+AND+%22PPAR+research%22%5BJournal%5D)">Current Advances in the Biochemical and Physiological Aspects of the Treatment of Type 2 Diabetes Mellitus with Thiazolidinediones.</a> PPAR research. , 7614270(2016).</li>
<li>Cohen, F. J., Neslusan, C. A., Conklin, J. E., Song, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+antihyperglycemic+prescribing+trends+for+US+privately+insured+patients+with+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+care%22%5BJournal%5D)">Recent antihyperglycemic prescribing trends for US privately insured patients with type 2 diabetes.</a> Diabetes care. 26 (6), 1847-1851 (2003).</li>
<li>Desai, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+medication+initiation+in+newly+diagnosed+diabetes+mellitus%3A+quality+and+cost+implications%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Patterns of medication initiation in newly diagnosed diabetes mellitus: quality and cost implications.</a> The American journal of medicine. 125 (3), e301-e307 (2012).</li>
<li>Martel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-obesogenic+and+antidiabetic+effects+of+plants+and+mushrooms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Anti-obesogenic and antidiabetic effects of plants and mushrooms.</a> Nature reviews. Endocrinology. , (2016).</li>
<li>Lanzerstorfer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+insulin+mimetic+drugs+by+quantitative+total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Identification of novel insulin mimetic drugs by quantitative total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.</a> British journal of pharmacology. 171 (23), 5237-5251 (2014).</li>
<li>Onur, S., Stöckmann, H., Zenthoefer, M., Piker, L., Döring, F. <a target="_blank" href="http://www.ccsenet.org/journal/index.php/jfr/article/view/27642">The Plant Extract Collection Kiel in Schleswig-Holstein (PECKISH) Is an Open Access Screening Library.</a> Journal of Food Research. 2 (4), (2013).</li>
<li>Haselgrubler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gluc-HET%2C+a+complementary+chick+embryo+model+for+the+characterization+of+antidiabetic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Gluc-HET, a complementary chick embryo model for the characterization of antidiabetic compounds.</a> PloS one. 12 (8), e0182788(2017).</li>
<li>Stadlbauer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+Characterization+of+Putative+Antidiabetic+Herbal+Extracts%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Biomolecular Characterization of Putative Antidiabetic Herbal Extracts.</a> PloS one. 11 (1), e0148109(2016).</li>
<li>Greywe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applicability+and+robustness+of+the+hen%27s+egg+test+for+analysis+of+micronucleus+induction+%28HET-MN%29%3A+results+from+an+inter-laboratory+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+research%22%5BJournal%5D)">Applicability and robustness of the hen's egg test for analysis of micronucleus induction (HET-MN): results from an inter-laboratory trial.</a> Mutation research. 747 (1), 118-134 (2012).</li>
<li>Manakova, E., Hubickova, L., Kostalova, J., Zemanova, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryotoxicity+of+mirtazapine%3A+a+study+using+Chick+Embryotoxicity+Screening+Test%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+endocrinology+letters%22%5BJournal%5D)">Embryotoxicity of mirtazapine: a study using Chick Embryotoxicity Screening Test.</a> Neuro endocrinology letters. 31, Suppl 2. 8-10 (2010).</li>
<li>Ribatti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+embryo+chorioallantoic+membrane+as+a+useful+tool+to+study+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22International+review+of+cell+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Chick embryo chorioallantoic membrane as a useful tool to study angiogenesis.</a> International review of cell and molecular biology. 270, 181-224 (2008).</li>
<li>Yoshiyama, Y., Sugiyama, T., Kanke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+diabetes+model+in+chick+embryos+treated+with+streptozotocin%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+%26+pharmaceutical+bulletin%22%5BJournal%5D)">Experimental diabetes model in chick embryos treated with streptozotocin.</a> Biological & pharmaceutical bulletin. 28 (10), 1986-1988 (2005).</li>
<li>Wolf, T., Niehaus-Rolf, C., Luepke, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+new+methodological+aspects+of+the+hen%27s+egg+test+for+micronucleus+induction+%28HET-MN%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+research%22%5BJournal%5D)">Some new methodological aspects of the hen's egg test for micronucleus induction (HET-MN).</a> Mutation research. 514 (1-2), 59-76 (2002).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El ensayo HET-CAM es un sistema de prueba alternativa ampliamente utilizado para los ensayos con animales en el sector12. El sistema en ovo descrito aquí representa una versión modificada del ensayo HET-CAM. Mientras que en su forma original, se realizaron experimentos de HET-CAM para estudiar las propiedades irritantes de compuestos y formulación o el análisis de la angiogénesis14,15,16, hemos adaptado el enfoque de la prueba compuestos con supuestas características insulina-mimético12. Según la Directiva 2010/63/UE, experimentos con embriones aves no nacieron durante los primeros dos tercios del desarrollo embrionario no es necesario permiso de un Comité de ética ya que estos experimentos no se consideran los experimentos con animales. Estudios recientes han demostrado la idoneidad del sistema en ovo para caracterizar la eficacia de extractos de hierbas seleccionadas, que se han identificado en una pantalla principal basado en la translocación de GLUT410, para reducir los niveles de glucemia en el ausencia de insulina12,13. Puntos críticos para un buen funcionamiento del sistema en ovo incluyen: primero, un criador confiable entrega los huevos fertilizados. El pollo marrón clásico Lohmann es una buena opción de raza. En segundo lugar, la aplicación de toxicidad pruebas para excluir los efectos tóxicos de los investigados compuesto hay que hacer. Además, la preparación de un vaso sanguíneo adecuado para recolección de sangre es importante. Es importante evitar el corte de vasos grandes en las membranas corioalantoideas sí mismo, esto puede llevar a una pérdida no preferible de la sangre. Además, antes de que el buque se corta en la tira de pH, tiene que ser le dio unas palmaditas secas con papel de filtro para evitar la dilución de la sangre recogida. Por último, un número suficiente de experimentos parece ser importante. Se recomienda utilizar al menos 10 huevos para cada punto del tiempo y una triple repetición de la experiencia respectiva.
Naturalmente, existen algunas limitaciones de este enfoque en ovo . Puesto que toma hasta 30 minutos hasta que las sustancias son absorbidas por la membrana de la cáscara de huevo y entran en contacto con las membranas corioalantoideas, no es posible cuantificar una respuesta rápida del embrión al compuesto aplicado. Además, algunos compuestos pueden ser tóxicos en la concentración aplicada, que con frecuencia resulta en lesiones de los vasos sanguíneos de las membranas corioalantoideas. Por lo tanto, pruebas de citotoxicidad basados en incubación a largo plazo de los compuestos por cerca de 24 horas parece razonable. Finalmente, se encontró que el sistema utilizado para la aplicación de los compuestos tiene un efecto significativo sobre el rendimiento de la prueba. 12 actualmente, HBSS tampón se utiliza debido a el menor efecto sobre los niveles de glucosa de la sangre del embrión.
Para futuras aplicaciones, sistemas de amortiguamiento adicional como una alternativa a HBSS pueden probarse. Además, la influencia de extractos de hierbas en parámetros adicionales de la sangre como colesterol, triglicéridos o lipoproteínas podría ser una pregunta atractiva.
Nuestro nuevo sistema en ovo es una herramienta importante y prometedor para probar sustancias con características de insulina-mimético en un organismo vivo sin la necesidad de un experimento animal. Por lo tanto, rellena el hueco entre los enfoques in vitro y in vivo . En comparación con la existente en ovo-lacto-modelo sistemas17 no hay necesidad para inducir diabetes tratamiento streptozotocin (STZ), como el uso embriones en el día 10 u 11 de la incubación. En esta etapa, no se ha iniciado la producción de insulina, pero los embriones son ya insulina sensible. Además, autorización por un Comité de ética puede ser necesario si los embriones de edad 14-17 días son usados17. Además, comparado con estrategias alternativas18, la aplicación compuesta como se describe aquí es menos dañina y laborioso, aumento de las tasas de rendimiento experimentales.
Tomados en conjunto, esta en ovo-lacto- enfoque es un sistema atractivo si es un efecto de disminución de sangre de una sustancia insulina-mimético en un organismo vivo.

Diabetes mellitus es una enfermedad metabólica caracterizada por hiperglicemia y es causada por defectos en la secreción de insulina o insulina de acción1. Noventa por ciento de los casos de diabetes son la categoría de diabetes mellitus tipo 2 (T2DM), donde individuos demuestran resistencia a la insulina y sobre todo la deficiencia de insulina2. Varios factores se saben para aumentar la incidencia global de T2DM, incluyendo cambios en el estilo de vida, especialmente las relacionadas con la sobrealimentación, el envejecimiento y la inactividad física. Cerca de 400 millones de personas tienen diabetes mellitus a nivel mundial según la Federación Internacional de Diabetes (FID). Este número se espera llegar a 600 millones en los próximos 20 años3.
Complicaciones de la diabetes causadas por la hiperglucemia y resistencia a la insulina, tales como hipertensión, dislipidemia, intolerancia a la glucosa, enfermedad coronaria y enfermedad vascular cerebral, llevan a una significativamente menor esperanza de vida y calidad4. Las personas afectadas requieren farmacoterapia reductor de la glucosa; sin embargo, el uso de medicamentos como metformina5 suele ser asociado con efectos secundarios dramáticos6,7,8. Por lo tanto, más antidiabéticos enfoques que son seguros, ampliamente disponible y barato son necesarios.
Nutracéuticos, extractos, plantas y diferentes compuestos de hierbas se han atribuido propiedades insulina-mimético característica modulando funciones celulares diferentes. Una característica importante es la estimulación de la translocación del transportador de glucosa 4 (GLUT4) a la membrana plasmática de compartimentos de almacenamiento intracelular, resultando en una mayor captación de glucosa en músculo y tejido adiposo en la ausencia de insulina, conocido como insulina-mimético propiedades9. Anteriormente, hemos implementado un enfoque basado en la microscopía de fluorescencia para cuantificar el proceso de translocación de GLUT410. Análisis de numerosos extractos de plantas de un extracto de la biblioteca11 usando este análisis resultó en la identificación de candidatos prometedores. Sin embargo, se requieren pruebas adicionales en los organismos vivos. El enfoque descrito en detalle en este documento, un modelo de embrión de polluelo modificado, ha demostrado para ser un modelo prometedor para la identificación de sustancias con propiedades insulina-mimético. Representa una herramienta atractiva, llenando el boquete amplio entre los estudios in vitro y en vivo y ofrece varias ventajas en comparación con los sistemas existentes como costos aceptables, los procedimientos de manejo sencillo y velocidades de rendimiento adecuado. Además, no se requiere autorización por un Comité de ética.

<table><tbody><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td></td></tr><tr><td>Hank' s solución salina equilibrada (HBSS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30268.02</td><td></td></tr><tr><td>NovoRapid</td><td>Novo Nordisk</td><td>8-0905-82-304-6</td><td></td></tr><tr><td>Huevos de gallina (Lohmann pollo marrón clásico)</td><td>Criador</td><td></td><td></td>local</tr><tr><td>Accu-check performa</td><td>Roche</td><td>6454011</td><td></td></tr><tr><td>Accu-check Inform II Teststreifen</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora 5942861&nbsp; HEKA- Turbo 288</td><td>HEKA Brutger&auml; te</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Omnican F 1 mL</td><td>Braun</td><td>09161502S&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Extractos</td><td>PEKISH biblioteca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>de extractos Lámpara Tempo Nr. 119</td><td>ORBAN</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo de ovo para probar compuestos de insulina-mimético

An In Ovo Model for Testing Insulin-mimetic Compounds

Niveles elevados de glucemia en diabetes mellitus tipo 2 (T2DM), una enfermedad metabólica compleja y multifactorial, son causados por falta de insulina resistencia y β-celular. Diversas estrategias, incluyendo la inyección de la insulina o el uso de las drogas de insulina-sensibilización, persiguieron para tratar T2DM o al menos reducir los síntomas. Además, la aplicación de compuestos herbales ha atraído una atención creciente. Por lo tanto, es necesario encontrar sistemas de prueba eficiente para identificar y caracterizar compuestos de insulina-mimético. Aquí se desarrolló un modelo de embrión de polluelo modificada, que permite pruebas de compuestos sintéticos y extractos herbales con propiedades insulina-mimético. Usando una fluorescencia microscopía pantalla basado en primaria, que cuantifica la translocación del transportador de glucosa 4 (Glut4) a la membrana plasmática, hemos sido capaces de identificar compuestos, extractos de hierbas principalmente, que conducen a un aumento de la glucosa intracelular concentraciones en los adipocitos. Sin embargo, la eficacia de estas sustancias requiere más verificación en un organismo vivo. Por lo tanto, utilizamos un enfoque en ovo para identificar sus propiedades reductoras de glucosa de la sangre. La aprobación por un Comité de ética no es necesaria porque el uso de embriones de pollo durante los primeros dos tercios del desarrollo embrionario no se considera un experimento animal. Aquí, la aplicación de este modelo se describe en detalle.

Descripción del enfoque Gluc-HET:
Tras la incubación con las sustancias de interés, los huevos fertilizados son abiertos y preparados para recolección de sangre por eliminación de la cáscara de huevo (figura 2). Preparación incluye equilibrar y el retiro de la membrana de la cáscara de huevo para obtener acceso a las membranas corioalantoideas. Esta membrana se corta cuidadosamente para proporcionar acceso a un recipiente adecuado de sangre para recolección de sangre. Preferiblemente, el vaso grande que origina en el abdomen del embrión se coloca en una tira de pH de plástico. Para evitar la dilución de la sangre durante la colección, la nave y la tira de pH es secarlo con papel de filtro. Entonces se corta el vaso sanguíneo y se recoge la sangre que se escapa en la franja de pH para análisis mediante una pipeta.
Efectos de extractos de hierbas en los niveles de glucemia:
Con un recién creado translocación de GLUT4 cuantificación pantalla basado en primaria, que son capaces de identificar sustancias con una característica insulina-mimético10. Proyección de cientos de extractos de hierbas hidrosolubles resultó en la identificación de varios golpes. Estos extractos fueron probados en nuestro modelo en -ovo. Extractos preparados a partir de Combretum indicum (enredadera de Rangún) y un extracto no divulgada (llamado extracto 0845) fueron utilizados para estos experimentos. Hemos disuelto los extractos en tampón HBSS a 300 mg/L, una concentración que resultó para ser adecuado en anteriores estudios12,13. Sustancias se aplicaron a los embriones se incubaron durante 11 días. Como se indica en la figura 3, el extracto de la enredadera de Rangún no produjo una significativa sangre glucosa reducción en ovo. Sin embargo, la concentración de glucosa de la sangre se redujo con éxito con el extracto 0845, con una disminución menor después de 60 min, que es comparable con el efecto observado con un análogo de insulina disponible en el mercado. Se observó un efecto significativo cuando se prolongó el tiempo de incubación de los huevos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig1.jpg"> Figura 1: influencia de compuestos tóxicos en la vitalidad del embrión. Huevos fueron incubados durante 11 días (A y C) o tratados con un extracto de hierbas tóxico día 10 por otro 24 h (B y D). Aplicación del extracto condujo a graves lesiones de los vasos sanguíneos de las membranas corioalantoideas (D) y el embrión (B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig2.jpg"> Figura 2: Descripción del modelo en ovo . De izquierda a derecha: apertura y remoción de la cáscara del huevo (1 - 2); equilibrado y el retiro de la membrana de la cáscara de huevo con membranas corioalantoideas expusieron (3); recipiente dispuesto en una tira de pH (4); la colección de sangre y medición de la concentración de glucosa con un medidor de glucosa (5). Adaptado de Haselgruebler et al., 201712. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57237/57237fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57237/57237fig3.jpg"> Figura 3: efecto de extractos de hierbas en los niveles de glucemia en comparación con los no tratados o tratados con insulina huevos. Huevos incubados durante 11 días y fueron tratados con las sustancias indicadas (análogo de insulina disponible comercialmente: 3.3 U/mL; extractos: 300 mg/L) disuelto en tampón HBSS (volumen de 300 μL) para hasta 3 h. de sangre los niveles de glucosa se determinaron usando un medidor de glucosa en sangre. Resultados se muestran sin el efecto de la memoria intermedia. Barras de error se basan en el error estándar de la media. * P &lt; 0.05 y *** P &lt; 0.0001, importante disminución con respecto a los huevos tratados con HBSS del mismo tiempo de incubación. Adaptado de Haselgruebler et al., 201712. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57237/57237fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

En este estudio, describimos un sistema en la ovo como una herramienta prometedora para probar compuestos de insulina-mimético en un organismo vivo. Las principales ventajas incluyen velocidades de rendimiento adecuados y los costos aceptables, que permitan la identificación de sustancias fitoquímicas con propiedades insulina-mimético.

Un modelo de Ovo para probar compuestos de insulina-mimético

Elevated blood glucose levels in type 2 diabetes mellitus (T2DM), a complex and multifactorial metabolic disease, are caused by insulin resistance and ...

El objetivo general del modelo de embrión de pollo modificado presentado es caracterizar sustancias con propiedades miméticas de la insulina en un organismo vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación de los diabéticos, como encontrar extractos de hierbas con propiedades miméticas a la insulina que reduzcan los niveles de glucosa en sangre sin efectos secundarios. La principal ventaja de esta técnica es que la eficacia de los compuestos se puede probar en un organismo vivo con tasas de rendimiento adecuadas, y que no es necesario el permiso de un comité de ética.La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de preparación y corte son difíciles de aprender, porque los recipientes no se preparan fácilmente o, a menudo, se cortan por completo y se pierden. Revise los huevos para ver si están fertilizados después de la incubación a 38 grados centígrados con una humedad promedio del 40 al 60 por ciento durante un máximo de 11 días. Para hacer esto, sumerja el fleco de la lámpara de ovoscopia en una almohadilla de tinta, luego encienda el lado puntiagudo del huevo.Para identificar la cámara de aire, verifica si hay diferencias en el brillo en la parte superior del huevo. La vejiga de aire aparece como una región redonda y más transparente, mientras que la albúmina parece más oscura. Marque la ubicación de la cámara de aire presionando ligeramente la lámpara contra el huevo con la tinta aplicada anteriormente.Excluya los óvulos no fertilizados, que no muestran una diferencia de brillo entre la albúmina y la vejiga aérea. Prepare el mimético de la insulina, o insulina, diluyéndolo hasta la concentración deseada en la solución salina equilibrada de Hank. Para aplicar el compuesto seleccionado, use un par de pinzas puntiagudas para picotear cuidadosamente la cáscara de huevo en el área marcada de la cámara de aire para formar un orificio igual al diámetro de la jeringa de aguja.Utilice una jeringa estéril de un mililitro para inyectar 300 microlitros de la solución tampón que contiene la sustancia de interés. Para determinar el efecto reductor de la glucosa en sangre de una sustancia, vuelva a colocar los huevos en la incubadora y mida la glucosa en sangre después de 60, 120 y 180 minutos. En el momento adecuado, retire con cuidado la cáscara de huevo por encima de la cámara de aire y equilibre la membrana de la cáscara de huevo agregando suficiente tampón PBS para cubrir toda la membrana.Después de verter el exceso de PBS, use un par de pinzas puntiagudas para quitar con cuidado la membrana de la cáscara de huevo. Use una microtijera para cortar y quitar la membrana corioalantoidea mientras evita cualquier vaso grande en la membrana. Localiza el vaso grande que se origina en el abdomen del embrión.Levante este recipiente de la albúmina con una microtijera cerrada y colóquelo en una tira de pH de plástico. Mueva la tira de pH debajo del recipiente y retire la microtijera con cuidado. Es fundamental preparar los grandes vasos sanguíneos que se originan en el abdomen, ya que los más pequeños pueden romperse e imposibilitar la extracción de sangre.Retire cualquier líquido que rodee el vaso con una pipeta para evitar la dilución de la sangre. Luego, use papel de filtro para secar el recipiente y la tira de pH. Para la recolección de sangre, es importante no cortar completamente el vaso, ya que se perderá.A continuación, use una micro tijera para cortar el vaso sanguíneo con cuidado en un lado. No corte más de la mitad del recipiente para evitar cortar el recipiente por completo. Recoja la sangre que se filtra en la tira de pH con una pipeta.Se requieren 10 microlitros de sangre para determinar los niveles de glucosa usando el medidor de glucosa en sangre. Después de la aplicación del compuesto seleccionado durante 24 horas, equilibre la membrana de la cáscara de huevo con PBS como antes durante al menos 30 segundos. Elimine el exceso de tampón PBS vertiéndolo.Luego, retire la membrana de la cáscara de huevo con cuidado con un par de pinzas puntiagudas. Revise los vasos sanguíneos en busca de lesiones y confirme la vitalidad observando el movimiento del embrión de pollo. Para estos experimentos se utilizaron extractos preparados de combretum indicum, o la enredadera de Rangún, y un extracto no divulgado etiquetado como extracto 0845.Como se indica en esta figura, el extracto de enredadera de Rangún no resultó en una reducción significativa de la glucosa en sangre en ovo. Sin embargo, la concentración de glucosa en sangre se redujo con éxito con el extracto 0845 y se observó un efecto significativo cuando se prolongaba el tiempo de incubación. En comparación con los huevos no tratados, el tratamiento de los huevos con un extracto de hierbas tóxicas en el día 10 durante 24 horas provocó lesiones graves de los vasos sanguíneos en la membrana corioalantoidea.Las lesiones también fueron evidentes en el embrión tratado en comparación con el control normal. Una vez dominados, se pueden analizar dos óvulos para determinar los niveles de glucosa y la toxicidad en cinco minutos si se realiza correctamente. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar los vasos sanguíneos y recolectar sangre en el modelo de embrión de pollo para cuantificar los efectos reductores de glucosa en sangre de los compuestos naturales o sintéticos.

an-in-ovo-model-for-testing-insulin-mimetic-compounds

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Señalización de la insulina conserva las vías se encuentran en la mosca de la...

Inyección de insulina y extracción hemolinfa para medir la sensibilidad a la insulina en adultos Drosophila melanogaster</em

Un ensayo de tres dimensiones que permite clonigénicas como de páncreas, células progenitoras a diferenciarse en la insulina que expresan las colonias se describe. Este método tiene la ventaja de medio semi-sólido que contiene factores de metilcelulosa, Matrigel y el crecimiento, en el que los progenitores solo proliferan y se...

Un análisis cuantitativo de la insulina que expresan la formación de colonias de progenitores

Este protocolo permite a uno identificar los factores que modulan la masa funcional de las células beta para encontrar posibles dianas terapéuticas para el tratamiento de la diabetes. El protocolo consiste en un método simplificado para evaluar la replicación de islotes y la función de las células beta en los islotes de rata aislados siguientes manipulación de la expresión génica con adenovirus.

La evaluación de la replicación y la función celular beta en Adenovirally transducidas aislados islotes de roedores

Presentamos aquí un protocolo para el aislamiento de islotes del modelo de ratón de diabetes tipo 2, Leprdb y detalles de un ensayo de células vivas para la medición de la secreción de insulina de islotes intactos que utiliza microscopía de 2 fotones.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modelo de ratón de la Diabetes Tipo 2: El aislamiento de los islotes pancreáticos y células en Vivo 2-Photon imágenes de islotes intactos

retos críticos para el campo de investigación de la diabetes son comprender los mecanismos moleculares que regulan la replicación de las células β de los islotes y desarrollar métodos para estimular la regeneración de las células β. En este documento un método de alto contenido de cribado para identificar y evaluar se presenta la actividad de replicación promotoras de células β de moléculas pequeñas.

Un alto contenido<em&gt; In Vitro</em&gt; Islotes pancreáticos de células β plataforma de descubrimiento de replicación

Aquí, presentamos una metodología para generar y administrar microesferas de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) cargadas de interés a islotes de ratón intactos en cultivo con el posterior análisis de inmunofluorescencia de la proliferación de células β. Este método es adecuado para determinar la eficacia de los mitógenos candidatos a β células.

Administración sostenida de mitógenos de células β de los islotes intactos mouse<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Uso Biodegradable poli (ácido láctico-co-glicólico) Microesferas

Aquí, presentamos homogénea tiempo resuelve FRET (HTRF) como un método eficiente para la detección rápida de la insulina secretada desde las células.

Homogénea tiempo resuelto Förster Resonancia energía basada en la transferencia de ensayo para la detección de la secreción de insulina

Este protocolo describe cómo realizar ensayos rápidos de luciferasa de bajo costo a rendimiento medio utilizando una Gaussia luciferase ligada a la insulina como un proxy para la secreción de insulina de células beta. El ensayo se puede realizar con la mayoría de los lectores de placas de luminiscencia y pipetas multicanal.

Medición de la secreción relativa de insulina mediante un sustituto de la Luciferase co-secretada

Este protocolo describe un método para la adquisición sincrónica y el co-registro de eventos de señalización intracelular y la secreción de insulina y glucagón por pseudoislotes humanos primarios utilizando la administración adenoviral de un biosensor de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), un detector de diferencia de cAMP in situ (cADDis) y un sistema de microperifusión.

Sistema de pseudoislotes humanos para la evaluación sincrónica de la dinámica de biosensores fluorescentes y perfiles de secreción de hormonas

Establecimos un ensayo de hibridación in situ dúplex para mapear las isoformas de los receptores de insulina IR-A e IR-B en el plexo coroideo murino, superando las limitaciones de los métodos tradicionales. Este enfoque de alta resolución revela la expresión específica de isoformas, ofreciendo nuevos conocimientos sobre la señalización de la insulina en el cerebro y posibles terapias dirigidas a isoformas para trastornos neurológicos.

Visualización precisa de los receptores de insulina A y B en el cerebro murino con un ensayo de hibridación in situ de ARN

Aprende a utilizar un modelo modificado de embrión de pollo in ovo para evaluar compuestos insulinomiméticos y extractos herbales que reducen la glucosa sanguínea. Este método permite probar eficacia y toxicidad en un organismo vivo sin necesidad de aprobación ética.

Un modelo de Ovo para probar compuestos de insulina-mimético

Explorar más videos