Un modelo de Ovo para probar compuestos de insulina-mimético

El objetivo general del modelo de embrión de pollo modificado presentado es caracterizar sustancias con propiedades miméticas de la insulina en un organismo vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación de los diabéticos, como encontrar extractos de hierbas con propiedades miméticas a la insulina que reduzcan los niveles de glucosa en sangre sin efectos secundarios. La principal ventaja de esta técnica es que la eficacia de los compuestos se puede probar en un organismo vivo con tasas de rendimiento adecuadas, y que no es necesario el permiso de un comité de ética.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de preparación y corte son difíciles de aprender, porque los recipientes no se preparan fácilmente o, a menudo, se cortan por completo y se pierden. Revise los huevos para ver si están fertilizados después de la incubación a 38 grados centígrados con una humedad promedio del 40 al 60 por ciento durante un máximo de 11 días. Para hacer esto, sumerja el fleco de la lámpara de ovoscopia en una almohadilla de tinta, luego encienda el lado puntiagudo del huevo.

Para identificar la cámara de aire, verifica si hay diferencias en el brillo en la parte superior del huevo. La vejiga de aire aparece como una región redonda y más transparente, mientras que la albúmina parece más oscura. Marque la ubicación de la cámara de aire presionando ligeramente la lámpara contra el huevo con la tinta aplicada anteriormente.

Excluya los óvulos no fertilizados, que no muestran una diferencia de brillo entre la albúmina y la vejiga aérea. Prepare el mimético de la insulina, o insulina, diluyéndolo hasta la concentración deseada en la solución salina equilibrada de Hank. Para aplicar el compuesto seleccionado, use un par de pinzas puntiagudas para picotear cuidadosamente la cáscara de huevo en el área marcada de la cámara de aire para formar un orificio igual al diámetro de la jeringa de aguja.

Utilice una jeringa estéril de un mililitro para inyectar 300 microlitros de la solución tampón que contiene la sustancia de interés. Para determinar el efecto reductor de la glucosa en sangre de una sustancia, vuelva a colocar los huevos en la incubadora y mida la glucosa en sangre después de 60, 120 y 180 minutos. En el momento adecuado, retire con cuidado la cáscara de huevo por encima de la cámara de aire y equilibre la membrana de la cáscara de huevo agregando suficiente tampón PBS para cubrir toda la membrana.

Después de verter el exceso de PBS, use un par de pinzas puntiagudas para quitar con cuidado la membrana de la cáscara de huevo. Use una microtijera para cortar y quitar la membrana corioalantoidea mientras evita cualquier vaso grande en la membrana. Localiza el vaso grande que se origina en el abdomen del embrión.

Levante este recipiente de la albúmina con una microtijera cerrada y colóquelo en una tira de pH de plástico. Mueva la tira de pH debajo del recipiente y retire la microtijera con cuidado. Es fundamental preparar los grandes vasos sanguíneos que se originan en el abdomen, ya que los más pequeños pueden romperse e imposibilitar la extracción de sangre.

Retire cualquier líquido que rodee el vaso con una pipeta para evitar la dilución de la sangre. Luego, use papel de filtro para secar el recipiente y la tira de pH. Para la recolección de sangre, es importante no cortar completamente el vaso, ya que se perderá.

A continuación, use una micro tijera para cortar el vaso sanguíneo con cuidado en un lado. No corte más de la mitad del recipiente para evitar cortar el recipiente por completo. Recoja la sangre que se filtra en la tira de pH con una pipeta.

Se requieren 10 microlitros de sangre para determinar los niveles de glucosa usando el medidor de glucosa en sangre. Después de la aplicación del compuesto seleccionado durante 24 horas, equilibre la membrana de la cáscara de huevo con PBS como antes durante al menos 30 segundos. Elimine el exceso de tampón PBS vertiéndolo.

Luego, retire la membrana de la cáscara de huevo con cuidado con un par de pinzas puntiagudas. Revise los vasos sanguíneos en busca de lesiones y confirme la vitalidad observando el movimiento del embrión de pollo. Para estos experimentos se utilizaron extractos preparados de combretum indicum, o la enredadera de Rangún, y un extracto no divulgado etiquetado como extracto 0845.

Como se indica en esta figura, el extracto de enredadera de Rangún no resultó en una reducción significativa de la glucosa en sangre en ovo. Sin embargo, la concentración de glucosa en sangre se redujo con éxito con el extracto 0845 y se observó un efecto significativo cuando se prolongaba el tiempo de incubación. En comparación con los huevos no tratados, el tratamiento de los huevos con un extracto de hierbas tóxicas en el día 10 durante 24 horas provocó lesiones graves de los vasos sanguíneos en la membrana corioalantoidea.

Las lesiones también fueron evidentes en el embrión tratado en comparación con el control normal. Una vez dominados, se pueden analizar dos óvulos para determinar los niveles de glucosa y la toxicidad en cinco minutos si se realiza correctamente. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar los vasos sanguíneos y recolectar sangre en el modelo de embrión de pollo para cuantificar los efectos reductores de glucosa en sangre de los compuestos naturales o sintéticos.