Name: Custom diseñado moldes de cultivo de tejidos de maestros grabado a láser (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprende a fabricar moldes personalizados de polidimetilsiloxano para tejidos hidrogel mediante grabado láser. Este método de bajo costo permite controlar la geometría de tejidos cardíacos para estudios de desarrollo tisular y análisis mecánico.

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Los autores reconocen que la financiación de los NIH R00 HL115123 y Brown University escuela de ingeniería. También agradecemos al taller de diseño de Brown y Chris Bull para capacitación y apoyo con el cortador del laser.

<ol><li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nat. Protoc. 5, 491(2010).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Modificado para requisitos particulares geometrías de molde PDMS que son compatibles con el cultivo de tejidos tienen gran utilidad en propiedades de tejido de ingeniería importantes, como alineación celular, tasa de difusión y la rigidez efectiva de afinación. Además, estos moldes son muy útiles para preparar los tejidos para aplicaciones de análisis en el que geometría es importante, como el mecánico prueba16,17. Preparación de estos dispositivos de láser corte...

En las últimas dos décadas, litografía blanda se ha utilizado ampliamente como una técnica de fabricación para apoyar la investigación científica, particularmente en los campos de la microfluídica, investigación de materiales y tejidos ingeniería1,2, 3. Moldeado de la réplica, en el que se crea un objeto con la forma deseada de un molde negativo principal, ofrece un método conveniente y bajo costo de producir positivo que PDMS Replica puede ser usado para el bastidor en forma de hidrogeles. Sin embargo, los moldes maestro negativo requiere por lo general se producen usando técnicas de microfabricación que son costosos, desperdiciadores de tiempo, limitado en tamaño, y requieren espacio limpio y equipo sofisticado. Mientras que impresión 3D ofrece una alternativa potencial, su utilidad es limitada debido a los límites de resolución de las impresoras de bajo costo y las interacciones químicas entre polímeros comunes de impresora 3D y PDMS que puede inhibir la polimerización.
Sistemas de corte láser capaz tanto de corte y grabado de materiales como plástico, madera, vidrio y metal han vuelto considerablemente menos costoso y por lo tanto más accesible para la fabricación de herramientas de investigación. Cortadoras Láser de grado comercial son capaces de la fabricación de objetos en la escala del centímetro con características mínimas menores de 25 μm y además requieren un mínimo de entrenamiento, experiencia y tiempo a utilizar. Mientras que la ablación del laser de PDMS ha sido previamente utilizada en la fabricación de dispositivos de microfluidos, a nuestro conocimiento ningún manuscrito ha descrito un proceso de milímetro y centímetro escala moldes pueden fabricarse de láser cortar moldes negativos de maestro4 .
Hemos utilizado esta técnica sobre todo para manipular la forma de los tejidos diseñados para mejorar la difusión de nutrientes, la alineación celular y propiedades mecánicas5,6,7. Sin embargo, la versatilidad de esta técnica permite la utilización en cualquier campo donde hidrogel moldeadas es de interés, como la droga entrega material ciencia investigación8. Con acceso a un cortador láser, repeticiones de molde PDMS se pueden hacer para casi cualquier geometría sin voladizos (que inhibiría la eliminación sin un molde de varias parte, que está fuera del alcance de este manuscrito) y que se ajuste a las dimensiones de la cama láser.

<table><tbody><tr><td>Item</td>Fibrinógeno bovino Sigma F8630-5G Constructs Trombina bovina Sigma T6634-250UN Constructs Aprotinina bovina Sigma 10820-25MG Constructos Cola de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rata colágeno I, 4 mg/mL</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5153-100MG</td><td>Constructos</td></tr><tr><td>Cloruro de Sodim</td><td>Fisher</td><td>BP358-10</td><td>Construye</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Construye pinzas finas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Construye</td></tr><tr><td>Sylgard 184 elastómero de silicona</td><td>Corning</td><td>4019862</td><td>Moldes PDMS Cinta de</td></tr><tr><td>laboratorio</td><td>Fisher</td><td>15-901-5R</td><td>Moldes PDMS</td></tr><tr><td>Acrílico, 1/4" grueso</td><td>McMaster-Carr</td><td>8560K356</td><td>PDMS Moldes</td></tr><tr><td>Tampón HEPES, 1 M</td><td>Sigma</td><td>H3537-100ML</td><td>Construye</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medio, polvo</td><td>Fisher</td><td>31800-089</td><td>Construye</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Fisher</td><td>AC423520250</td><td>Construye</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio hexahidratado</td><td>Fisher</td><td>M33 500</td><td>Construcciones</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td>Construcciones</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico heptahidratado</td><td>Sigma</td><td>S9390-500G</td><td>Construcciones Glucosa</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>G5767-25G</td><td>Construcciones</td></tr><tr><td>OCT</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>Histología</td></tr><tr><td>Moldes de bloques congelados</td><td>VWR</td><td>25608-916</td><td>Histología</td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Fisher</td><td>3530 1</td><td>Histología</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Fisher</td><td>AC152880250</td><td>Histología</td></tr><tr><td>Fast green FCF</td><td>Fisher AC410530250</td><td></td><td>Histología</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illustrator</td><td>Adobe Systems</td><td></td><td>Gráficos vectoriales</td></tr><tr><td>Inkscape</td><td>(Open Source)</td><td></td><td>Gráficos vectoriales</td></tr><tr><td>UCP (Panel de control universal)</td><td>Interfaz de corte láser</td> <td>de sistemas</td><td></td> láser</tr> <tr><td>universales<fuerte>equipo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLS6.75 Cortadora láser</td> Universal <td></td><td>Laser Systems</td><td></td></tr><tr><td>Analizador micromecánico</td><td>Aurora Scientific</td><td>1530A con celda de carga de 5 mN</td><td>Análisis mecánico</td></tr></tbody></table>

custom diseñado moldes de cultivo de tejidos de maestros grabado a láser

Custom Engineered Tissue Culture Molds from Laser-etched Masters

Como el campo de la ingeniería de tejidos ha seguido madurando, ha habido mayor interés en una amplia gama de parámetros de tejido, incluyendo forma de tejido. Manipulando la forma del tejido en el micrómetro a escala de centímetros puede dirigir alineación de celda, modificar propiedades mecánicas eficaces y abordar limitaciones relacionadas con la difusión de nutrientes. Además, el recipiente en el que se prepara un tejido puede impartir las limitaciones mecánicas sobre el tejido, resultando en áreas de estrés que más pueden influir en la célula y la matriz de estructura. Los tejidos en forma de dimensiones altamente reproducibles también tienen utilidad en vitro ensayos en que muestra las dimensiones son críticas, como el análisis mecánico de todo tejido.
Este manuscrito describe un método de fabricación alternativos utilizando moldes maestro negativo de acrílico grabada con láser: estos moldes realizar bien con polidimetilsiloxano (PDMS), permiten diseños con dimensiones en la escala de centímetros y la función tamaños menores a 25 μm y puede rápidamente diseñado y fabricado a un bajo costo y con mínimos conocimientos. Los requisitos de costo y tiempo mínimo permiten grabada con láser moldes rápidamente se itera sobre hasta determina un diseño óptimo y se adaptan fácilmente a cualquier ensayo de interés, los más allá del campo de la ingeniería de tejidos incluidos.

La óptica de la cortadora del laser puede causar áreas grabadas han disminuido muy ligeramente dimensiones como grabado de profundidad aumenta, y resultados en molde de paredes con un bisel muy sutil, debido al estrechamiento del haz láser. Esto ayudará a facilitar la remoción de la fundición de moldes de PDMS, pero debe considerar cuidadosamente si muy profundamente grabado moldes maestro negativo (&gt; 6 mm) son necesaria (figura 1).
<p class="jove_cont...

Aquí presentamos un método rápido, fácil y de bajo costo para la fabricación de moldes de polidimetilsiloxano personalizadas que pueden utilizarse para la producción de tejidos de ingeniería base de hidrogel con geometrías complejas. Asimismo, se describen los resultados de evaluaciones mecánicas e histológicos realizadas en ingeniería tejidos cardiacos producidos mediante esta técnica.

Custom diseñado moldes de cultivo de tejidos de maestros grabado a láser

As the field of tissue engineering has continued to mature, there has been increased interest in a wide range of tissue parameters, including tissue ...

Este método puede facilitar la investigación en el campo de la ingeniería de tejidos relacionada con el desarrollo de tejidos, la alineación celular y el análisis mecánico de polímeros y tejidos de ingeniería. La principal ventaja de esta técnica es que es de bajo costo, fácil de usar y rápida. Desarrollamos esta técnica en mi laboratorio porque el control geométrico de los tejidos modificados a escala milimétrica a centímetro no se realizaba en el campo, y vimos una necesidad crítica de pensar traslacionalmente en el aumento del tamaño de los tejidos modificados.Esta técnica nos permite aprovechar los beneficios de las colas geométricas en la fisiología celular y los tejidos de ingeniería a través de técnicas de fabricación que utilizan postes y una variedad de formas. Este método puede proporcionar información sobre la producción de tejidos de ingeniería con tamaño, forma y alineación controlados. También se puede aplicar a diversos modelos de enfermedades, medicina regenerativa personalizada y para la traslación de tejidos modificados a estudios preclínicos.Comience abriendo un programa de gráficos vectoriales en una computadora. Para preparar la geometría del molde y el formato vectorial deseados, abra un nuevo lienzo de dimensiones adecuadas con el formato de color RGB. A continuación, selecciona la herramienta de forma en el panel de la izquierda y crea la geometría deseada introduciendo las dimensiones en la parte superior de la ventana para definir con precisión los tamaños de las formas.Diseñe las geometrías del molde para permitir al menos un borde de seis milímetros desde el borde de las características más externas y la línea de corte para permitir el recorte del menisco PDMS después de la fundición del molde. Esto permitirá que el molde terminado quede al ras con el fondo de la placa de cultivo. A continuación, abra el selector de color en la esquina superior izquierda de la ventana y defina nuevas muestras de color que sean compatibles con el software de corte láser.Seleccione cada trazado y asígnele un color apropiado de la muestra de corte. Cuando haya terminado, asigne Ninguno para el color de relleno. Del mismo modo, asigne colores de muestra a los trazados de grabado seleccionando el objeto y, a continuación, seleccionando el trazado de grabado para el color de relleno y Ninguno para el color del trazado en el selector de color.Guarde los diseños como formatos de archivo ai or. pdf, dependiendo de cuál sea apropiado para el programa de gráficos vectoriales y la cortadora láser. Prepare la cortadora láser para el corte de acuerdo con las especificaciones del fabricante y asegúrese de que se utilice suficiente ventilación.A continuación, coloque una lámina de acrílico de 1/4 de pulgada sobre la base láser. Ajuste la altura de la cama para que quede correctamente calibrada con el acrílico. A continuación, abra el archivo de diseño en el ordenador conectado a la cortadora láser y abra el menú Imprimir.Asegúrese de que la cortadora láser esté configurada como la impresora y que la opción No escalar esté seleccionada en el menú desplegable Escala para evitar la distorsión del diseño. A continuación, haga clic en el botón Imprimir en la parte inferior del cuadro de diálogo Impresión. En la utilidad de impresión de la cortadora láser, haga clic en el botón de configuración para establecer los parámetros de grabado de corte para cada una de las características de diseño.Aquí, configure los parámetros de potencia, velocidad y pulsos por pulgada para cada uno de los colores elegidos anteriormente. Una vez introducidos los ajustes, haga clic en el botón verde grande del software de la cortadora láser. Esto hará que la cortadora láser comience a grabar y cortar los moldes maestros negativos.Finalmente, use un cepillo pequeño o aire comprimido para eliminar cualquier residuo de los moldes maestros negativos. Esto preparará la superficie para la fundición de PDMS. Prepare una mezcla de fundición PDMS de acuerdo con las especificaciones del fabricante.Desgasifique el PDMS preparado en una cámara de vacío conectada a un laboratorio de vacío de línea estándar durante una hora o hasta que se hayan eliminado todas las burbujas. Mientras se desgasifica el PDMS, tome el borde exterior del molde con vinilo o cinta adhesiva, de modo que la cinta se extienda al menos tres milímetros por encima de la cara grabada del molde maestro negativo. Asegúrese de presionar la cinta firmemente contra el costado del molde para evitar fugas más adelante.A continuación, vierta aproximadamente 0,35 mililitros por centímetro cuadrado de PDMS en el molde maestro para que el PDMS alcance un grosor mínimo de 1,5 milímetros. Coloque el molde maestro negativo recubierto de PDMS en una cámara de vacío y desgasifique nuevamente durante una hora o hasta que se hayan eliminado todas las burbujas. Luego, coloque el molde maestro negativo recubierto de PDMS desgasificado en un estante nivelado en un horno a 60 grados Celsius durante al menos seis horas para curar el PDMS.Una vez curado, use una cuchilla de afeitar para cortar los moldes individuales mientras aún están en el molde maestro negativo. Luego, despegue lenta y cuidadosamente cada molde PDMS del molde maestro negativo. Recorte cualquier región con un menisco de moldeo, lo que evitaría que el moho quede plano, así como cualquier exceso de material o desechos.Por último, autoclave los moldes utilizando un ciclo de autoclave estándar para esterilizarlos para el cultivo de tejidos. Para empezar, adhiera los moldes a placas de plástico sin tratar. Prepare el fibrinógeno, la trombina y las soluciones de colágeno neutralizado y coseche las células deseadas como se describe en el protocolo de texto adjunto.Combine el fibrinógeno, el colágeno neutralizado y la suspensión celular para crear una mezcla de fundición. Mantenga la mezcla de fundición en hielo. A continuación, utilice un generador de alta frecuencia portátil para tratar las superficies del molde que estarán expuestas a la mezcla de fundición para mitigar la hidrofobicidad del PDMS.Exponga las superficies al tratamiento con plasma durante tres a cinco segundos, unos cinco minutos antes de fundir el material. Inmediatamente antes de fundir la mezcla de células proteicas, añada la trombina a la mezcla de fundición y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo sin introducir burbujas. Trabajando rápidamente, pipetee la mezcla de fundición en los moldes con cuidado para depositar la mezcla en todas las esquinas y grietas del molde.Evite expulsar la mezcla más allá del primer tope de la pipeta para evitar la formación de burbujas dentro de las construcciones. Luego, coloque las muestras en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados durante 45 minutos. Después de 45 minutos, regrese los constructos a la campana y cúbralos con medios celulares antes de regresar a la incubadora.Cambie el medio de celda cada 48 a 72 horas según sea necesario para el tipo de celda y construcción. Por último, siga el protocolo de texto adjunto para cuantificar las propiedades de compactación y tracción de los tejidos, así como para preparar varias técnicas de tinción y medir la alineación de las células. Con el tiempo y la cultura, las construcciones celulares se compactan debido a la remodelación de la matriz.Esto ocurre a través de la reorganización y degradación de la matriz circundante y generalmente se asocia con un aumento en la rigidez mecánica. La compactación dirigida también puede inducir campos de tensión dentro del tejido, que pueden manipularse en construcciones celulares para fomentar la alineación celular. Estas dos imágenes se tomaron de construcciones de tejido cardíaco que crecieron en moldes rectangulares de tres milímetros por 17 milímetros con postes en cada extremo.Y estas dos imágenes son construcciones de tejido cardíaco que crecieron sin restricciones. Las dos construcciones que estaban restringidas solo pudieron compactarse en las dos direcciones restantes y condujeron a la alineación celular inducida por el estrés. Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar para diseñar, fabricar e implementar moldes de tejido personalizados en menos de un día.Después de la formación de tejidos, se pueden realizar otros métodos, como pruebas mecánicas e histología, para comprender mejor los efectos de la alineación en la morfología celular y la función de los tejidos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar moldes de tejido PDMS personalizados a partir de maestros acrílicos cortados con láser.

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