Alto rendimiento identificación de combinaciones de fármacos sinérgicos por el método de superposición²

El objetivo general de esta metodología es identificar las moléculas sinérgicas, que amplifican la actividad de las demás, cuando se combinan a través del cribado de alto rendimiento. Los pares sinérgicos de fármacos son una estrategia prometedora para combatir las infecciones resistentes a los fármacos, pero son difíciles de identificar. Este método puede identificar moléculas que interactúan con los medicamentos antimicrobianos existentes utilizados para tratar enfermedades infecciosas.

A largo plazo, estas combinaciones pueden entrar en la evaluación preclínica y, finalmente, mejorar la atención al paciente. La principal ventaja de esta técnica es que se puede hacer con cualquier organismo de interés y con cualquiera con cualquier biblioteca de moléculas pequeñas. Las implicaciones de esta técnica, se extienden hacia la terapia de múltiples enfermedades infecciosas ya que trabaja con cualquier organismo de interés.

Utilice una hoja de cálculo estándar para calcular la puntuación media de crecimiento y la desviación estándar de todos los mutantes, en presencia de una concentración particular de la pequeña molécula añadida. A continuación, calcule las puntuaciones Z para cada una de las concentraciones de moléculas pequeñas. A continuación, resalte los mutantes genéticos con puntuaciones Z significativas.

Primero, cultive un cultivo de E. coli en un medio mínimo M9, durante toda la noche a 37 grados centígrados. Luego, disuelva las moléculas pequeñas en dimetilsulfóxido a una alta concentración superior a 10 miligramos por mililitro. A continuación, agregue 100 microlitros de medio M9 a cada pocillo en una placa de 96 pocillos.

Pipetee 100 microlitros adicionales de medio M9 en la columna uno, de modo que el volumen en esa columna sea de 200 microlitros. Luego, agregue aproximadamente 10 microlitros de la solución concentrada de molécula pequeña, en la columna uno. Después de agregar las moléculas pequeñas, comience a diluirlas en el eje X de la placa.

Continúe diluyendo hasta que haya, 100 microlitros en la columna 11. Después de mezclar la columna 11, deseche 100 microlitros de esa columna. Deje que solo haya medio en la columna 12 para normalizar los datos.

A continuación, registre el valor de densidad óptica a 600 nanómetros del cultivo durante la noche cultivado en medio mínimo M9. Luego, agregue dos microlitros del cultivo en cada pocillo. De tal manera que hay 1000 celdas por pozo.

Luego, agite el plato suavemente. Y observe la lectura de densidad óptica a 600 nanómetros para el punto de tiempo de cero horas. Una vez registrada la lectura, incubar la placa a 37 grados centígrados durante un día.

Nuevamente, mida el valor de densidad óptica a 600 nanómetros durante un punto de tiempo de 24 horas. Para realizar el ensayo de tablero de ajedrez, cultive un cultivo de E. coli en un medio mínimo M9 durante toda la noche a 37 grados centígrados. Luego, agregue 100 microlitros de medio M9 a cada pocillo y agregue 100 microlitros adicionales del mismo medio en la columna uno de una placa de 96 pocillos.

A continuación, agregue las pruebas de moléculas pequeñas, en cada pocillo en la columna uno. Y añadir el doble de concentración en el pocillo A1. A continuación, cree un gradiente de dilución a lo largo del eje X transfiriendo 100 microlitros, de la columna uno a la columna dos. Continúe el proceso de dilución, hasta agregar 100 microlitros en la columna 11.

Después de mezclar la columna 11, deseche 100 microlitros de esa columna y deje la columna 12 solo con medio sin ningún medicamento. Cree otro degradado para la segunda dilución del fármaco. Para hacer esto, agregue 100 microlitros del medio que contiene dos X, concentración inhibitoria mínima de la molécula de entrada en la fila A. Luego, transfiera 100 microlitros de la fila A a la B. Continúe el proceso de dilución, hasta agregar 100 microlitros en la fila G. Después de mezclar la fila G, deseche 100 microlitros del pocillo.

A continuación, inocular la placa con dos microlitros del cultivo en cada pocillo. De tal manera que hay 1000 celdas por pozo. Luego, mida la lectura de densidad óptica a 600 nanómetros para el punto de tiempo de cero horas.

Una vez registrada la lectura, incubar la placa a 37 grados centígrados durante 24 horas. Y luego, mida el valor de densidad óptica a 600 nanómetros durante un punto de tiempo de 24 horas. Para llevar a cabo el cribado de alto rendimiento, para fármacos sinérgicos, cultive células mutantes de tipo salvaje y predicción de sinergia en medio M9 mínimo.

Luego, agregue los medicamentos de la biblioteca al medio. A continuación, inocule una placa de medicamentos de biblioteca con el tipo salvaje y otra placa con bacterias mutantes de predicción de sinergia. Esta placa representa el ensayo de tablero de ajedrez utilizado para investigar combinaciones sinérgicas de fármacos.

En esta placa, el pozo F9 con la puntuación FICI más baja de 0,07 indica que el par de moléculas pequeñas es sinérgico. Esta placa representa el ensayo de tablero de ajedrez para investigar la combinación de fármacos que no interactúan. En esta placa, el pocillo C3 con la puntuación FICI más baja de 1,0 indica que el par de moléculas pequeñas no interactúa entre sí.

Esta placa representa el ensayo de tablero de ajedrez utilizado para investigar combinaciones de fármacos antagonistas. En esta placa, el pocillo A1 con la puntuación FICI más baja de 8,0 indica que la interacción entre las moléculas del fármaco es antagónica. A continuación, Befeldin A, un fármaco de molécula pequeña en fluconazol, se utiliza para estudiar el crecimiento de las forminas C y U.

El gráfico muestra que el crecimiento tanto del tipo salvaje como del mutante de predicción de sinergia se inhibe ligeramente y en la misma medida. Esto indica que la befeldina A y el fluconazol son socios farmacológicos no sinérgicos. Por el contrario, el crecimiento del mutante de predicción de sinergias de las forminas C y U se inhibe significativamente, en presencia de Refromisyn y Fluconazol.

Lo que indica que los medicamentos son socios sinérgicos. Curiosamente, el crecimiento del tipo salvaje no se inhibe en absoluto. Aquí se observa la mayor diferencia de crecimiento, entre 32 y 49 horas después de la inoculación.

Una vez dominada, esta técnica puede acortar el tiempo para identificar interacciones sinérgicas con los medicamentos. Al llevar a cabo este procedimiento, es importante recordar que no se deben combinar medicamentos en la última columna de la última fila del ensayo de tablero de ajedrez. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos de identificación sinérgica de moléculas con el fin de identificar interacciones sinérgicas farmacológicas adicionales.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar la metodología O2M para identificar marcadores de sinergia putativos con el fin de encontrar interacciones sinérgicas de medicamentos con su organismo de interés. No olvide que si bien trabajar con algunas moléculas pequeñas puede ser peligroso y cualquier precaución en la MSDS, debe seguirse mientras se realiza este protocolo.