Name: Aislamiento y caracterización de células estromales mesenquimales cardiacas de Endomyocardial biópticos muestras de pacientes de miocardiopatía arritmogénica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Aprende a aislar células estromales mesenquimales cardiacas de biopsias endomiocárdicas de pacientes con miocardiopatía arritmogénica. Este método permite caracterizar marcadores de superficie y evaluar la diferenciación adipogénica.

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Este trabajo fue financiado por el Ministerio italiano de salud, Ricerca Corrente a Centro Cardiologico Monzino-IRCCS.

Este enfoque cumple con la declaración de Helsinki y la recogida de muestras ventriculares derecha fue aprobado (06/07/2012) por el Comité de ética "Centro Cardiologico Monzino IRCCS".
1. las soluciones
<ol><li>Hacer medio TMES cultura C-MSC con medio de modificado Dulbecco de Iscove (IMDM), suplementado con 20% suero bovino Fetal (FBS), 10 ng/mL del factor de crecimiento básico del fibroblasto, 10.000 U/mL de penicilina, estreptomicina de 10.000 μg/mL y 0.02 M L-glutamina. Filtrar el medio TMES utilizando una unidad de filtro estéril de 0,22 μm y almacenar a 4 ° C.</li>
	<li>Para preparar la solución de colagenasa, Resuspender el mix colagenasa NB4 en medio IMDM para obtener una solución final con una concentración de 3 mg/mL. Vórtice suavemente para disolver el polvo y filtrar la solución de colagenasa usando un filtro de jeringa de 0,2 μm. Volumen de alícuota de 1 mL en tubos estériles de 2 mL y conservar a-20 ° C hasta que se necesite para su uso.</li>
	<li>Para preparar medio T. ADIPO, hacer adipogenic medio con medio IMDM suplementado con 10% FBS, 0.5m m 3-isobutil-1-metilxantina (previamente diluido en dimetil sulfóxido (DMSO) a una concentración de 0,5 M y mantuvieron a-20 ° C hasta su uso), hidrocortisona 1 μm (previamente diluido en DMSO a 100 mM y más diluido a 10 mM en estéril agua destilada y mantuvieron a-20 ° C hasta su uso) y la indometacina 0,1 mM (previamente diluido en DMSO con una concentración de 0,5 M y mantuvieron a-20 ° C hasta su uso). Filtrar el medio T. ADIPO utilizando una unidad de filtro estéril 0,22 μm y almacenar a 4 ° C.</li>
	<li>Preparar el tampón de lavado compuesto de tampón fosfato salina 0,0067 M PO4 (PBS), etilendiamina tetra acético (EDTA) 5 mM y 5% albúmina de suero bovino y almacenar a 4 ° C.</li>
	<li>Preparar una solución de trabajo aceite rojo O (ORO) disolviendo polvo ORO de 1% en isopropanol al 60%, mezcla para 2 h y filtrado usando una unidad de filtro de 0,22 μm para eliminar precipitados. Almacenar la solución de trabajo a temperatura ambiente (RT).</li>
</ol>2. aislamiento de células estromales mesenquimales cardiacas
<ol><li>
Biopsia cardiaca recopilación y el procesamiento Nota: antes de comenzar, asegúrese de que la solución de la colagenasa y medio TMES y listo.<ol>
<li>Colocar la biopsia de endomyocardial ACM (generalmente alrededor de 5 mg de tejido) en un tubo estéril llena de TMES y transporte al laboratorio. Nota: Las biopsias de la ACM se recogen en el quirófano de electrofisiología, según anteriores informes10. Brevemente, la integración de mapeo electro anatómico y ecocardiografía intracardiaca en el ventrículo derecho (ver Video 1) se utiliza para guiar la biopsia endomiocárdica (ver Video 2, fluoroscopia) en correspondencia a la zona de frontera de la miocardio enfermo. Saludables muestras de Control (HC) son suministradas por un bio-Banco de tejidos de la pared libre ventricular derecha de donantes cadavéricos dentro de 24 h de la muerte (muerte accidental, sujetos sanos). Durante el transporte y antes de la disección, guarde la biopsia TMES a 4 ° C. Limitar el tiempo entre la biopsia recogida y tratamiento de tejido (max 24 h).</li>
		<li>Configurar la seguridad biológica con las soluciones necesarias para llevar a cabo el procedimiento hasta la digestión enzimática.</li>
		<li>Poner el esterilizador bajo el capó y encienda el aparato 15 minutos antes de su uso hasta que la temperatura eleva a 200-250 ° C.</li>
		<li>Esterilizar las tijeras y pinzas para hacer s. 10 seguro los instrumentos esterilizados fríos antes de su uso. Preparar bisturíes estériles desechables.</li>
		<li>Colocar los tubos con la biopsia en la campana estéril. Abra el tubo y transferir la biopsia en una placa estéril.</li>
		<li>Lave la biopsia del ventrículo derecho dos veces con 3 mL de PBS estéril. Si usted desea tomar una foto de la biopsia al microscopio.</li>
		<li>La transferencia de la biopsia del ventrículo derecho, utilizando pinzas estériles, en un tubo estéril de 2 mL que contiene 1 mL de la solución de la colagenasa.</li>
		<li>Cortar la muestra en 0,5 - 1 mm3 piezas con tijeras estériles.</li>
		<li>Incubar durante 1,5 h a 37 ° C bajo agitación continua rotación.</li>
		<li>Centrifugue la solución digerida a 400 x g durante 10 min a TA.</li>
		<li>Quite el sobrenadante y agregar 1 mL de PBS estéril para lavar el pellet.</li>
		<li>Centrifugar a 400 x g durante 10 min a TA.</li>
		<li>Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 mL de medio de TMES.</li>
		<li>La suspensión obtenida en cultivo de tejido 60 mm estériles tratado la placa de la placa y añadir medio TMES a volumen final de 3 mL. Incube la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 ° C con 5% CO2. Nota: Un volumen mayor de medio puede impedir la correcta adherencia de un fragmentos de biopsia digerido.</li>
		<li>Después de 24 h, deseche el medio para eliminar los residuos y las células no adherentes. Nota: Las células mesenquimales disociadas pueden fijar a la superficie de plástico y dan lugar a clones; también, fragmentos sin digerir la pequeña biopsia pueden colocar en el plato plástico y permiten brotar de la célula.</li>
		<li>Lave la placa dos veces con 5 mL de PBS estéril y añadir 3 mL de medio fresco de TMES.</li>
		<li>Reemplazar el medio TMES tres veces a la semana hasta que las células son 80% confluente. Nota: El número de células conectados depende de la calidad, cantidad de tejido y en la eficiencia de la digestión.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. célula expansión
Nota: Antes de comenzar Asegúrese de tienen TMES medio listo.
<ol><li>Cuando las células son 80% confluente, transferencia el pequeñas muestras bioptic digeridas en una nueva cultura de tejido estéril 60 mm lámina trataron y añadir 3 mL de medio fresco de TMES. Nota: Las muestras bioptic puede volver a utilizarse para el aislamiento de más C-MSC. Es posible repetir el procedimiento hasta que haya un número significativo de células aisladas.</li>
	<li>Lavar las células adjuntas dos veces con 3 mL de PBS estéril. Añadir solución de tripsina-EDTA (0,5 mL en un plato de 60 milímetros) e incubar a 37 ° C durante 3-5 min permitir la separación de la célula.</li>
	<li>Cuando las células están separadas de la superficie de la placa, Añadir 0,5 mL de SBF estéril para inactivar la tripsina y recoger las células en un tubo estéril nuevo de 50 mL.</li>
	<li>Lave la placa dos veces con 5 mL de PBS estéril agregar las células restantes en el mismo tubo.</li>
	<li>Centrifugar las células a 400 x g durante 10 min a TA.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 mL de medio de TMES.</li>
	<li>Cargar 10 μl de la suspensión de células en la célula cámara de conteo. Nota: Si las células son demasiado concentradas, diluir la suspensión inicial 1:10 en PBS y cargar 10 μl de las células diluidas en el celular con cámara.</li>
	<li>Bajo el microscopio, contar las células en 3 grandes plazas y en las líneas de dos de sus lados y calcular el número medio de células. Nota: Para obtener el número de células/mL, el promedio de células contadas se multiplica por 104, el factor de dilución de la célula cámara de conteo. Si las células han sido más diluidas, multiplicar por el factor de dilución. La relación entre el número de celular de la semilla y la concentración celular (número de células/mL) se corresponde con el volumen (en mL) de suspensión inicial de plateado para el siguiente paso (punto 3.9).</li>
	<li>Placa de la resuspensión en placas de cultivo de tejidos de 100 mm estériles tratado a una concentración final de 5.000-10.000 células/cm2 y añadir medio TMES a volumen final de 8 mL. Incube la placa en una incubadora de cultivo celular. Nota: Repita el procedimiento de expansión celular cuando las células son confluentes de 70-80%. En cada paso (P), se recomienda criopreservar parte de las células y la cantidad restante de la placa. Ampliar las células hasta la P3 o P4 y utilizar para análisis de clasificador (FACS) de células fluorescentes-activado (sección 4) y la diferenciación de adipogenic (sección 5).</li>
	<li>Para la criopreservación a la separación, centrifugar las células a 400 x g durante 10 min a TA.</li>
	<li>Cuenta células como describen (pasos 3.7-3.8) y resuspender 1 x 106 células en 900 μl de SBF estéril. Transferir a un frasco estéril de crio y añadir 100 μl de DMSO y mezcla estéril.</li>
	<li>Almacenar rápidamente los cryo-frascos en un recipiente de congelación a-80 ° C durante al menos 2 días y luego se transfieren los frascos en nitrógeno líquido.</li>
</ol>4. Caracterización de las células estromales mesenquimales cardiacas mediante citometría de flujo
Nota: Antes de comenzar, asegúrese de que el reactivo de disociación celular, lavado tampón y los anticuerpos específicos preparados.
<ol><li>Cuando el número de células llega a por lo menos 3 x 106 (conteo de las células como se describen en 3.7-3.8), lave la placa de 100 mm dos veces con 10 mL de PBS estéril.</li>
	<li>Añadir 5 mL de un reactivo de disociación celular y esperar 7-10 min a temperatura ambiente para permitir la separación de la célula.</li>
	<li>Cuando las células están separadas de la superficie de la placa, añadir 15 mL de tampón de lavado estéril y recoger la suspensión en un tubo estéril nuevo de 50 mL.</li>
	<li>Lave la placa dos veces con 10 mL de tampón de lavado y añadir las células restantes en el mismo tubo.</li>
	<li>Centrifugar las células a 400 x g durante 10 min a temperatura ambiente y resuspender el precipitado en 1 mL de tampón de lavado.</li>
	<li>Contar las células como se describe (pasos 3.7-3.8) y transferencia de 3 x 106 células en un tubo estéril nuevo y añadir tampón de lavado hasta el volumen final de 1.5 mL. Nota: El número total de la célula y el volumen total de tampón de lavado depende del número de marcadores seleccionados utilizados para el análisis (3 x 105 células en 100 μl de cada tubo de poliestireno de FACS).</li>
	<li>Distribuir 100 μl de suspensión celular en 12 diferentes tubos de poliestireno de FACS y añadir el anticuerpo específico a la concentración indicada en la hoja de datos de producto. Nota: Anticuerpos utilizados para la caracterización de la C-MSC son CD34, CD105, CD45, CD29, CD90, CD44, CD31, CD14 y HLA-DR (tabla 1). Es importante preparar una muestra de control compuesta por 100 μl de células resuspendidas teñidas con el control de isotipo para comprobar la especificidad de la señal.</li>
	<li>Incubar las muestras durante 15 min en la oscuridad.</li>
	<li>Añadir 1 mL de tampón de lavado estéril a cada tubo para detener la reacción.</li>
	<li>Centrifugar las células a 400 x g durante 10 min a TA.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado en 250 μl de tampón de lavado.</li>
	<li>Proceder a la caracterización de la C-MSC con citometría de flujo.</li>
</ol>5. Adipogenic diferenciación de las células estromales mesenquimales cardiacas
Nota: Antes de comenzar, asegúrese de que han preparado medio T. ADIPO y solución de trabajo de ORO.
<ol><li>
Cultura en medio T. ADIPO
	<ol>
<li>Separar y contar las células como se describe en la sección 3.</li>
		<li>Células de5 placa de 3 x 10 en cada pocillo de un cultivo de tejido estéril 6-bien tratan placa en 2 mL de medio de T. ADIPO.</li>
		<li>Que C-MSC distinguir en medio T. ADIPO 72 h o 1 semana, cambiando el medio cada 2-3 días.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aceite rojo O manchas Nota: uso aceite rojo O (ORO) tinción para probar la acumulación lipídica en C-MSC.<ol>
<li>Lugar el cultivo de tejidos 6-bien plateunder la campana.</li>
		<li>Retire el medio de adipogenic y lavan las células dos veces con 2 mL de PBS.</li>
		<li>Añadir el suficiente volumen del 4% paraformaldehido (PFA) para cubrir cada uno bien. Fijar las células durante 5 min a TA.</li>
		<li>Deseche la PFA y lavan las células dos veces con 2 mL de PBS.</li>
		<li>Incube las células fijas con solución de trabajo de ORO por 1 h a temperatura ambiente, con suficiente volumen para cubrir cada uno bien. Nota: No mantenga la placa de cultivo de tejido 6-bien debajo de la campana de humo durante la incubación de ORO para evitar la evaporación de la solución de trabajo de ORO.</li>
		<li>Eliminar la solución de trabajo de ORO todos y lavar con 2 mL de PBS 3 - 5 veces hasta que la placa se limpia completamente; descarte los lavados. Dejar los lavados cuando el PBS utilizado es claro y no aparece, al microscopio, no específicos de tinción de las células.</li>
		<li>Capturar 20 imágenes con 20 aumentos para cada pocillo utilizando el microscopio de contraste de fases invertido cultivo de tejidos.</li>
		<li>Abrir las imágenes con el programa de procesamiento de imagen para cuantificar la acumulación de ORO de la célula.</li>
		<li>Separar los canales de color diferentes con la función "split canales" para cuantificar solamente la luminancia en el canal 255-rojo.</li>
		<li>Contar el número de células para cada foto contando los núcleos. Normalizar la intensidad de la señal ORO en el número de celular.</li>
		<li>Calcule el promedio de los resultados obtenidos para cada imagen de la misma muestra.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

C-MSC y MSC: MSC son células pluripotentes en la fracción estromal de diversos tejidos adultos, tales como la médula ósea, tejido adiposo, cartílago, cerebro, piel, anexos fetales y corazón12. Se han realizado diferentes estudios para aislar y caracterizar para posibles aplicaciones en investigación básica y traslacional12,13.
En condiciones saludables, MSC son quietos, renovado en tasas bajas14. Ya que están expuestos a cambios ambientales patológicos, reaccionan promoviendo remodelación tisular mediante transdiferenciación directa, deposición de matriz o el efecto paracrino del14.
El MSC cardiaco (C-MSC) representan una población de células grandes no miocito del corazón4. Se originan desde el epicardio y migrar en el miocardio en el proceso de transición epitelial-a-mesenquimales15. Contribuyen a la integridad mecánica y eléctrica de la estructura cardiaca, tanto fisiológicas y estados patológicos, a través de interacciones con cardiomiocitos y matriz extracelular homeostasis7,16. Sin embargo, aún no totalmente entiende las funciones de la amplia gama de C-MSC. Un conocimiento más profundo de su papel que tanto en condiciones fisiológicas y patológicas pueden facilitarse mediante estudios en vitro realizada después de su aislamiento.
C-MSC han sido obtenidos de diferentes distritos del corazón humano, como los orejuela2,17 y18de ventrículo derecho.
Recientemente, C-MSC de muestras bioptic endomyocardial ventricular derecho humano han obtenido8, demostrando que el tejido de la fuente podría ser tan poco como 3-5 mg.
Posibles aplicaciones: El método descrito en este manuscrito permite obtener células con pocos pasos simples, como la digestión y selección para la adhesión de plástico, de muestras de corazón muy pequeño.
C-MSC puede considerarse un modelo de celular, ya que son fáciles de ampliar y mantener en vitroy son capaces de diferenciarse en células de estirpe mesenquimal (endotelio, osteocitos y adipocitos). Además, la posibilidad de obtención de células de pacientes constituye una herramienta de gran en vitro para el estudio de mecanismos en el contexto de la medicina personalizada y precisión. De hecho, estas células llevan el fondo genético y mutaciones específicas finalmente de los donantes y son influenciadas por las características específicas de los pacientes, tales como las condiciones clínicas, edad, sexo, estilo de vida y medicamentos. Por otra parte, la posibilidad de clasificación para los diferentes marcadores puede permitir el estudio de determinados subconjuntos de C-MSC19.
C-MSC son conocidos por ser actores activos en diferentes enfermedades cardiovasculares, sobre todo caracterizadas por el remodelado adverso del corazón. Por lo tanto, representan objetivos de candidato para nuevas estrategias terapéuticas contrarrestar enfermedades del corazón8,20.
C-MSC vástago-como propiedades y su falta de inmunogenicidad significativa sugiere su potencial aplicación en terapia celular en medicina regenerativa cardiaca. De hecho, como MSC de médula ósea u otras fuentes, MSC C podría potencialmente usarse en autólogo y en configuración de alógeno, sin necesidad de coincidencia entre donante y receptor21.
Por otra parte, C-MSC, siendo aislado de tejido cardíaco, tiene la ventaja de ser precondicionada por el micro-ambiente cardiaco y perfil epigenético. En el contexto de la medicina regenerativa cardiaca, esto podría ser particularmente importante para obtener resultados exitosos.
Hasta la fecha, los estudios preclínicos de la medicina regenerativa identifican potencial terapéutico útil en el C-MSC y sus paracrina actividad18,22,23. Lo importante, los ensayos clínicos en los que el origen de la célula es el corazón están en marcha con células derivadas de cardiosfere o subpoblaciones de C-MSC13,24,25. Sin embargo, en cuanto a MSC de médula ósea, diferentes protocolos pueden ser necesarios para obtener el grado clínico C MSC26.
C-MSC en ACM: El protocolo presentado es sobre todo conveniente para el estudio de las patologías para las que está indicada una biopsia endocárdica. Pacientes de la ACM se someten a procedimientos biópticos para propósitos de diagnóstico27. Su miocardio es sustituido gradualmente por tejido cicatricial, un tejido eléctricamente inerte compuesta por adipocitos y fibrosis. Para orientar el muestreo biópticos para el área de la cicatriz, donde el rendimiento diagnóstico es máximo, mapeo de endomyocardial es usado10,28,29. Las muestras utilizadas en el presente Protocolo se toman en la zona fronteriza del miocardio enfermo.
Sommariva et al recientemente ha definido un papel fundamental de C-MSC en la patogenesia de la ACM8demostrar que C-MSC son jugadores activos en ACM corazón adipogénesis, preadipocytes en esos corazones son de origen mesenquimal. Por otra parte, C-MSC aisladas con el presente Protocolo de biopsias de pacientes de la ACM demostrada más propensión a la acumulación de lípidos y adipogénesis que controles. Por esta razón, estas células podrían utilizarse para confirmar algunos de los mecanismos moleculares de ACM, demostrando su idoneidad como modelo celular para el estudio de mecanismos9.
Limitaciones y pasos críticos: A pesar de las ventajas de obtener MSC C directamente de pacientes (ver el párrafo "Posibles aplicaciones"), este protocolo se sujeta a distintas limitaciones.
En primer lugar, el procedimiento de biópticos cardiaco es invasivo y a menudo se evita si no es estrictamente necesaria. En efecto, muestras de tejido cardíaco es ética y técnicamente problemático. Razones para realizar una biopsia cardiaca pueden ser la realización de un diagnóstico definitivo en el contexto de las miocardiopatías en diagnosis diferenciada, supervisar el estado de los trasplantes cardiacos, o determinar la presencia de un tumor de corazón30. Por lo tanto, sólo los pacientes que se indica una biopsia endomyocardial por consenso declaración31 pueden estar inscrito para la investigación en C-MSC. Por otra parte, el procedimiento de biópticos cardiaco puede tener complicaciones clínicas, sobre todo en cardiomyopathic corazones. Por lo tanto, los muestreos del electrofisiólogo siempre son cautelosos y muestras bioptic podrían ser muy pequeñas, comprometer el aislamiento de las células. Futuros experimentos podrían resolver este problema por tuning concentración colagenasa o tiempo de la digestión.
C-MSC, como todas las células humanas primarias, muestran una alta variabilidad entre sujetos diferentes en todos los fenotipos. De hecho, células de diferentes temas son no sólo genéticamente diferentes, sino también sometidos al condicionamiento ambiental variable. Específicamente, dentro de este experimento, se observa una alta variabilidad en diferenciación adipogenic, aislamiento y crecimiento celular.
Pasos críticos del presente Protocolo tienen que ser reconocido. Si la muestra biópticos incluye capilares, deben eliminarse para evitar el aislamiento paralelo de las células endoteliales, que pueden contaminar la cultura C-MSC y puede ser evidenciado por el análisis FACS (positividad para CD31). Para obtener una diferenciación de adipogenic eficiente, las células deben estar en una fase de crecimiento activo. El grado de confluencia también puede influir en la acumulación de lípidos.
Importancia del método: Con respecto a anteriores métodos de aislamiento de células estromales mesenquimales, esta es la primera vez donde se propone la descripción de obtención C MSC directamente de muestras bioptic ventriculares humanas en detalle. Aunque este método es sugerido para el procesamiento de las muestras pacientes de la ACM, es potencialmente aplicable a todos los pacientes para los que está indicada una biopsia cardiaca.
Este protocolo representa una útil aplicación de los métodos anteriores para la obtención de las células que requieren mayores muestras cardiacas32, que a menudo son difíciles de recoger.
Además, la fuente de la muestra constituye una interesante innovación. Mientras que la biopsia ventricular se realiza generalmente en el septo33, este protocolo tiene en cuenta las muestras obtenidas de la pared libre ventricular derecha. Las células derivadas de la zona ventricular derecha enferma pueden ser más representativo de la situación patológica de enfermedades que implican RV
Además, algunos de los reactivos utilizados en el presente Protocolo son diferentes con respecto a otro C-MSC aislamiento y diferenciación métodos32. Por ejemplo, el tipo de colagenasa propuesto en este manuscrito es una mezcla de clase I y clase colagenasas II con una relación equilibrada de actividades proteolíticas. Por otra parte, la solución de digestión se compone del mix colagenasa disuelto en el mismo medio basal (IMDM) utilizado para la preparación de medio de cultivo C-MSC, permitiendo aislado C-MSC para adaptarse a las condiciones de crecimiento futuro.
Además, aunque los procedimientos de clasificación podría estandarizar el lote de la célula, utilizando el conjunto de la población C-MSC, aislada sólo a través de la propiedad de plástico de la adherencia de estas células, constituye una simplificación sin alterar la immunophenotypic características del C-MSC. La composición del T. ADIPO propuesto en este manuscrito es capaz de conducir a la diferenciación de adipogenic, evitando el dysregulation metabólico inducido por otros componentes como la insulina.
Por otra parte, el método propuesto de cuantificación de acumulación de lípidos, que se basa en la evaluación de la intensidad colorimétrica de ORO, proporciona más información sobre la cantidad de los lípidos acumulados, si se compara con métodos basados únicamente en el porcentaje de células positivas a la tinción de ORO. A menudo la acumulación del lípido se cuantifica mediante la extracción del ORO constituida por células con isopropanol y medir su absorbancia. Sin embargo, este método requiere más pasos y se sujeta a la variabilidad debida a la evaporación de isopropanol.

Las células mesenquimales estromales (MSC) son células adultas con una función de apoyo importante en muchos de los tejidos1. Médula ósea representa la fuente histórica de MSC, pero pueden ser aisladas de diferentes tejidos incluyendo la placenta, tejido adiposo, sangre, hígado y corazón1,2.
En 2006, la sociedad internacional de terapia celular (ISCT) especifica, por primera vez, los criterios mínimos para definir MSC humanas3. En particular, MSC debe tener la capacidad de adherirse al plástico. Expresan antígenos de superficie específicos: la positividad para marcadores mesenquimales CD44, CD105, CD29 y CD90 y la negatividad para CD45, CD14, CD34, CD31 marcadores endoteliales y hematopoyéticos caracterizan a MSC. Debido a la expresión de la ausencia de HLA-DR, MSC son incapaces de activar la Alorreactividad. Por otra parte, son células multipotentes con potencial para diferenciarse hacia adipogenic, condrocitos y osteoblastos linajes1,3.
Centrarse en la composición celular cardiaca, cardiacas células estromales mesenquimales (C-MSC) son abundantes en un corazón adulto normal4,5. Juegan un papel crítico en la función cardiaca normal y en condiciones patológicas. Mientras que, fisiológicamente, C-MSC proporciona un microambiente que apoya la integridad estructural y funcional del miocardio, en enfermedades del corazón se activan en respuesta a la lesión de corazón, participa en la cicatrización de heridas y remodelación fibrótica6 ,7.
Recientemente, la participación de C-MSC en arritmogénica sustitución adiposa de cardiomiopatía (ACM) ha sido demostrada8. En particular, la ACM es un trastorno genético causado por mutaciones en genes desmosomal que llevan al reemplazo de fibro-grasos del miocardio, principalmente en el ventrículo derecho9principalmente. Esta sustitución, que se extiende desde epicardio a endocardio, crea un sustrato no conductor que provoca insuficiencia cardíaca progresiva y empeora las arritmias ventriculares, que pueden conducir, en casos severos, a muerte súbita. Sommariva et al. demostró el origen mesenquimal de los pre adipocitos en las secciones de corazón explanted de pacientes de la ACM. Además, C-MSC aislados de biopsias endomiocárdicas de genes ACM corazones desmosomal expresa y por lo tanto puede verse afectada por sus mutaciones. En particular, en condiciones de adipogenic, ACM C-MSC acumulan más lípidos que los corazones control. Esta evidencia lleva a la conclusión de que C-MSC tiene un papel activo en la patogénesis de la enfermedad y representa un modelo de celular válido para el estudio de ACM.
Para facilitar la investigación futura en este contexto o en otras enfermedades del corazón que está indicada una biopsia cardiaca, se presenta un protocolo detallado para el aislamiento de C-MSC de pequeños fragmentos de tejido endomiocárdica, su expansión, su inmuno-fenotípicas caracterización y diferenciación de adipogenic.

<table><tbody><tr><td>IMDM</td><td>Gibco por Life Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td>12440053</tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>PENICILLINA ESTREPTOMICINA</td><td>Life Technologies Italia</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa NB4</td><td>Serva</td><td>17454.02</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento básico de fibroblastos</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Tryple select 1X (reactivo de disociación celular)</td><td>Gibco</td><td>12563029</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tripsina-EDTA&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6689</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>3-isobutil-1-metilxantina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>Hidrocortisona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>Indometacina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>Aceite rojo O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Solución de paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS</td><td>D.b.a. Italia S.r.l.</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo CD14-FITC (M&phi; P9)</td><td>Becton Dickinson</td><td>345784</td><td></td></tr><tr><td>Integrina de anticuerpos y beta; 1 (CD29)-PE (clon MAR4)</td><td>Becton Dickinson</td><td>561795</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo PECAM-1 (CD31)- APC&nbsp; (clon 9G11)</td><td>R& D Systems</td><td>FAB3567A</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Antígeno de células progenitoras hematopoyéticas (CD34)-APC (clon 581)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>CD34-581-05</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo H-CAM (CD44)-PE&nbsp; (clon G44-26)</td><td>Becton Dickinson</td><td>561858</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo L-CA (CD45)-APC (clon HI30)</td><td>Anticuerpo Thermo Fisher Scientific</td><td>MHCD4505-4</td><td></td></tr><tr><td>THY1 (CD90)-FITC (clon 5E10)</td><td>Becton Dickinson</td><td>561969</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Endoglin (CD105)-APC (clon 266)</td><td>Becton Dickinson</td><td>562408</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo HLA-DR-FITC (clon L243)</td><td>Becton Dickinson</td><td> 347400</td><td></td></tr><tr><td>Gima Quick Plus esterilizador</td><td>Gima&nbsp;</td><td>35642</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de banco Sigma 3-16K</td><td>Centrífugas Sigma</td><td>10330</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty Contenedor de congelación</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio AxioVert 200M&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>B 40-080 e 03/01</td><td></td></tr><tr><td>FACS Gallios</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>773231AF</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ (programa de procesamiento de imágenes)</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unidades de filtro Stericup</td><td>Merck S.P.A.&nbsp;</td><td></td><td></td>SCGPU05RE</tr><tr><td>Tubos cónicos, 50 mL</td><td>Tubos cónicos Eppendorf</td><td>30122178</td><td></td></tr><tr><td>, 15 mL</td><td>Tubos Eppendorf</td><td>30122151</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Placa de cultivo celular tratada con TC</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Placa de cultivo celular tratada con TC</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>Placas de pocillos múltiples tratadas con TC de 6 pocillos</td> Tubos de fondo redondo de poliestireno <td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>, 5 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>MARCA&nbsp; cámara de recuento BLAUBRAND B&uuml; rker-T&uuml; rk</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR719520</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento y caracterización de células estromales mesenquimales cardiacas de endomyocardial biópticos muestras de pacientes de miocardiopatía arritmogénica

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

Un corazón adulto normal se compone de varios diversos tipos celulares, entre los que las células estromales mesenquimales cardiacas representan una población abundante. El aislamiento de estas células ofrece la posibilidad de estudiar su implicación en enfermedades cardíacas y, además, proporciona un modelo de célula primaria útil para investigar los mecanismos biológicos.
Aquí, se describe el método para el aislamiento de C-MSC de muestras bioptic pacientes de la miocardiopatía arritmogénica. La toma de muestras de biopsia endomiocárdica es guiado en las zonas ventriculares derecha adyacentes a la cicatriz visualizada por mapeo electro anatómico. La digestión de las biopsias en la colagenasa y sus placas en un plato de plástico en medio de cultivo para permitir el crecimiento de C-MSC se describe. Las células aisladas pueden ampliarse en la cultura de varios pasajes. Para confirmar su fenotipo mesenquimal, se proporciona la descripción de la caracterización inmuno-fenotípicas. C-MSC son capaces de diferenciarse en varios tipos celulares como adipocitos, condrocitos y osteoblastos: en el contexto de ACM, caracterizado por depósitos de adipocitos en corazones de pacientes, los protocolos para la diferenciación de adipogenic de C-MSC y la caracterización de la acumulación de gotas de lípido se describen.

Cardiaco stromal células de aislamiento: El aislamiento de MSC C del procedimiento de las biopsias endomiocárdicas se resume en la figura 1.
Cardiaco stromal células mesenquimal caracterización: Según lo establecido por la sociedad internacional de terapia celular (ISCT), los criterios mínimos para la definición de células estromales mesenquimales multipotentes incluye su caracterización inmuno fenotípica3. En particular, para confirmar su estirpe mesenquimal, las células son incubadas con anticuerpos conjugados FITC/PE/APC apropiados y analizadas por citometría de flujo. Todos los anticuerpos utilizados en la caracterización de la C-MSC se enumeran en la Tabla de materiales.
Como se ilustra en la figura 2, C-MSC obtenida de biopsias son positivas para los antígenos de superficie mesenquimales específicos CD29, CD44 y CD105. El porcentaje de células positivas CD90 es variable, como se informó anteriormente11. La endotelial (CD31, CD34,) complejo principal de histocompatibilidad (HLA-DR), monocitos/macrófagos (CD14) y hematopoyéticas (CD45) marcadores no son expresado (figura 2).
Diferenciación de adipogenic cardiaco las células estromales mesenquimales: Para pedir su diferenciación adipogenic, C-MSC obtenida de pacientes afectados por la ACM y HC tienen que ser cultivados en medio T. ADIPO (vea la sección de soluciones). Las células se mantienen en cultivo por 72 h o 1 semana, sustituyendo el medio dos veces a la semana.
La acumulación de gotas lipídicas intracelulares se evidencia por manchas (figura 3) de ORO. Se observan diferencias en la capacidad, así como en el grado de diferenciación entre las células obtenidas de ACM y HC. Como se muestra en las imágenes representativas, ACM C-MSC acumula más gotitas del lípido que HC C-MSC después de 72 h de cultivo en medio de adipogenic (figura 3). Estas diferencias se mantienen también cuando las células son expuestas a condiciones de diferenciación adipogenic durante un largo periodo (1 semana) (figura 3).
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/57263/57263video1.jpg"> Video 1: Integración de la ecocardiografía intracardiaca y mapa electroanatómico. Mapas de electroanatómicos unipolar endocárdico del ventrículo derecho (izquierdos anteriores oblicuas anteriores derecha oblicuas vistas y) en un paciente que se somete a la biopsia endomiocárdica (paneles inferiores). Áreas limitadas de baja tensión (rojo/verde) son accesibles en el ápice. Muestras bioptic endomiocárdica (etiquetadas como círculo) se recogen en correspondencia el miocardio enfermo y el septo interventricular. Ecocardiografía intracardiaca en tiempo real permite comprobar la posición correcta del biotomo en el área de la blanco (panel superior). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57263/Video_1.avi" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/57263/57263video2.jpg"> Video 2: video fluoroscopia en vista oblicua derecha anterior. El biotomo se inserta a través de una vaina larga cuadripolar y avanzada en el ventrículo. Después de una cuidadosa verificación del biotomo contacto con el miocardio, las mandíbulas se abren y entonces cerradas para recolectar la muestra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57263/Video_2.avi" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)</a>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57263/57263fig1.jpg"> Figura 1: proyecto procedimiento. La muestra de biópticos endomiocárdica se recoge usando un catéter del biotomo, un instrumento pequeño en forma de pinza de corte. El peso de la biopsia obtenida es aproximadamente 5 mg (A). La muestra de biópticos endomyocardial es picada en 0.5 - fragmentos de 1 mm3 , con las tijeras estériles (B), y una solución de colagenasa. La muestra se coloca en una incubadora de 37 ° C en un mezclador de plataforma giratoria para 1,5 h de digestión (C). La solución digerida es centrifugada y de TMES en un plato de plástico (D). C-MSC se obtienen gracias a sus propiedades de adherencia de plástico en las células o clones o brotes de pequeños fragmentos bioptic no digeridos (E). C-MSC se caracterizan entonces por citometría de flujo (F). C-MSC se platean en adipogenic medio y acumulación de gotas de lípido se prueba con aceite rojo O manchas (G). Indican barras de escala 50 μm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57263/57263fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57263/57263fig2.jpg"> Figura 2: Perfil de cito-fluorimétrica representante de C-MSC. Cada histograma muestra el número de células frente a la intensidad de fluorescencia en el canal indicado (PE: ficoeritrina; APC: allophycocyanin; FITC: fluoresceína-isothyocyanate). En cada gráfico de una muestra y el control de isotipo (blanco) conjugados con la célula específica aparecen anticuerpo superficial del marcador (rojo). C-MSC son positivas para los antígenos superficie mesenquimales CD29, CD44, CD105 y, parcialmente, CD90, considerando que no expresan CD31, CD34, CD14, CD45 y HLA-DR. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57263/57263fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57263/57263fig3.jpg"> Figura 3: diferenciación de Adipogenic de C-MSC. Imágenes representativas de ACM y HC C-MSC, cultivadas en medio adipogenic para 72 h y 1 semana, teñidas con ORO (fotos izquierdas; n = 3). En los gráficos de la derecha, se divulga la cuantificación de la luminancia de la tinción de rojo 255 canal: intensidad se expresa en unidades arbitrarias (A.U.). ACM C-MSC acumulan más gotitas de lípido que en controles. Se utilizó la prueba T de Student, *: p &lt; 0.05. Indican barras de escala 50 μm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57263/57263fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

En este artículo, se proporciona un método para aislar células estromales mesenquimales cardiacas de endomyocardial biópticos muestras de pacientes de miocardiopatía arritmogénica. Su caracterización y el protocolo para impulsar su diferenciación adipogenic se describen.

Aislamiento y caracterización de células estromales mesenquimales cardiacas de Endomyocardial biópticos muestras de pacientes de miocardiopatía arritmogénica

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

Los objetivos generales de este protocolo son aislar células estromales mesenquimales cardíacas de pacientes con miocardiopatía arritmogénica, probar su aptitud para la diferenciación adipogénica y fenotipar sus marcadores de superficie. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la miocardiopatía arritmogénica, como la participación de las células estromales cardíacas en la adiposustitución, y subrayar los mecanismos moleculares. La principal ventaja de esta técnica es que el aislamiento de las células de estoma se puede realizar con pocos pasos simples de muestras de corazón muy pequeñas.Aunque este método puede proporcionar información sobre el estudio de la miocardiopatía arritmogénica. También se puede aplicar a otros sistemas, como el estudio de las enfermedades cardiovasculares, para las que está indicada una biopsia endomiocárdica. Estudiamos por primera vez la idea de este método cuando comprendimos que podíamos reducir el procedimiento de aislamiento de células de estoma para aplicarlo a las biopsias cardíacas y a la electrofisiología que nos podía proporcionar.Para este protocolo, se recolectó una biopsia endomiocárdica del ventrículo derecho de un paciente con MCA mediante mapeo electroanatómico integrado y fluoroscopia cardíaca. Tome unos cinco gramos de tejido y envíelo al laboratorio en medio TMES. En el laboratorio, configure la cabina de seguridad biológica según sea necesario para llevar a cabo el procedimiento hasta la digestión ensomática.A continuación, transfiera la biopsia a una placa y lávela dos veces con PBS. En este punto, la biopsia se puede documentar fotográficamente bajo un microscopio. A continuación, transfiera la biopsia a un tubo de dos mililitros que contenga un mililitro de la solución de colagenasa.Allí, corta la muestra en pequeños fragmentos, de entre 0,5 y un milímetro de ancho. A continuación, incubar el tejido durante 90 minutos a 37 grados centígrados con agitación rotativa continua. A continuación, centrifuga la solución digerida, retira el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet en un mililitro de PBS.A continuación, vuelva a centrifugar el tubo, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de TMES. Ahora coloque la suspensión en una placa de 60 milímetros y llene la placa hasta tres mililitros con TMES, pero no más. A continuación, cultive y expanda las células de acuerdo con el protocolo de texto.Antes de comenzar, tenga listo para usar el reactivo de disociación celular, el tampón de lavado y los anticuerpos necesarios. Cuando el número estimado de células del cultivo alcance los tres millones, lave la placa de 100 milímetros dos veces con 10 mililitros de PBS estéril. A continuación, agregue cinco mililitros de un reactivo de disociación celular a las células e incube la placa durante siete a 10 minutos a temperatura ambiente para separar las células.Una vez que las celdas estén separadas, agregue 15 mililitros de PBS a las celdas y transfiera la suspensión a un tubo de 50 mililitros. Ahora, centrifuga las celdas y vuelve a suspender el pellet en un mililitro de tampón de lavado. Luego cuente las celdas y transfiera tres millones a un nuevo tubo en un volumen final de 1,5 mililitros de tampón de lavado.A continuación, divida la suspensión en 12 tubos de fax. En cada tubo, agregue los anticuerpos utilizados para caracterizar las CMSC en las concentraciones recomendadas. Asegúrese de incluir los controles de isotipo.Una vez preparados, incubar los tubos durante 15 minutos a temperatura ambiente, protegidos de la luz. Más tarde, agregue un mililitro de tampón de lavado a cada tubo para detener las reacciones. A continuación, centrifugar las células, eliminar el sobrenadante y volver a suspender los gránulos en 250 microlitros de tampón de lavado.Ahora proceda a caracterizar las células mediante citometría de flujo. Después de la diferenciación adipogénica de las células, utilice la tinción con ORO para comprobar la acumulación de lípidos. Antes de comenzar, asegúrese de tener una solución de trabajo ORO.Antes de teñir las células, retire el medio y lave las células dos veces con dos mililitros de PBS. A continuación, cubra las células con un 4% de paraformaldehído y déjelas fijar durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, deseche el paraformaldehído y lave las células dos veces con dos mililitros de PBS.Después del segundo lavado, agregue suficiente solución de trabajo ORO para cubrir las celdas. A continuación, incubar la placa durante una hora a temperatura ambiente. Esta incubación debe llevarse a cabo en un entorno en el que la autosolución no funcione, por lo que no se recomiendan salas llenas.Después de la incubación, aspire la solución de ORO y lave las células con dos mililitros de PBS varias veces hasta que la mancha no se pueda ver en el lavado de PBS y hasta que, al verlo bajo el microscopio, no se detecte una tinción inespecífica. Ahora, utilizando un microscopio de contraste de fase de cultivo de tejidos invertido, capture 20 imágenes de cada pocillo con un aumento de 20x. Los detalles se proporcionan en el protocolo de texto.Las CMSC se aislaron de las biopsias endomiocárdicas descritas. Para confirmar su linaje mesenquimatoso, las células se incubaron con anticuerpos conjugados florofour apropiados y se analizaron mediante citometría de flujo. Las CMSC fueron positivas para los antígenos mesenquimales de superficie específicos CD29, CD44 y CD105.Se sabe que la fracción de células CD90 positivas es variable. No se expresaron los marcadores de herencia endotelial, herencia de monocitos o macrófagos, herencia onomatopéyica y del complejo mayor de histocompatibilidad. A continuación, las CMSC se cultivaron en medio T.ADIPO para la diferenciación adipogénica y se tiñeron con ORO para buscar gotas de lípidos intracelulares.Las CMSC de pacientes con miocardiopatía arritmogénica acumularon más gotas de lípidos que las células de controles sanos. Estas diferencias se midieron en condiciones de diferenciación a las 72 horas y a los siete días. Una vez dominado, la resolución de la celda se puede realizar en tres horas, la tinción se puede realizar en dos horas y el análisis de fax se puede completar en tres horas.Siguiendo este procedimiento, se podrían realizar otros métodos, como las pruebas de drogas, para responder preguntas adicionales como si podemos usar células de estoma de los mismos pacientes para responder a diferentes estímulos. Después de su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la miocardiopatía arritmogénica exploren la participación de las células del estroma cardíaco humano en la patogénesis de la enfermedad.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

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tejido cardíaco humano alberga poblaciones de células precursoras multipotentes perivasculares que pueden ser adecuados para la regeneración miocárdica. La técnica descrita aquí permite el aislamiento simultáneo y purificación de dos poblaciones de células estromales multipotentes asociados con vasos nativos sangre, es decir CD146 + CD34 - pericitos y CD34 + CD146 - células adventicias, desde el miocardio humano.

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Un Método De Perfusión Anterógrada Para El Aislamiento De Cardiomiocitos De Ratones

Aprende a aislar células estromales mesenquimales cardiacas de biopsias endomiocárdicas de pacientes con miocardiopatía arritmogénica. Este método permite caracterizar marcadores de superficie y evaluar la diferenciación adipogénica.

Aislamiento y caracterización de células estromales mesenquimales cardiacas de Endomyocardial biópticos muestras de pacientes de miocardiopatía arritmogénica (Video) | JoVE Journal

Aislamiento y caracterización de células estromales mesenquimales cardiacas de Endomyocardial biópticos muestras de pacientes de miocardiopatía arritmogénica

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