Aislamiento y caracterización de células estromales mesenquimales cardiacas de Endomyocardial biópticos muestras de pacientes de miocardiopatía arritmogénica

Los objetivos generales de este protocolo son aislar células estromales mesenquimales cardíacas de pacientes con miocardiopatía arritmogénica, probar su aptitud para la diferenciación adipogénica y fenotipar sus marcadores de superficie. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la miocardiopatía arritmogénica, como la participación de las células estromales cardíacas en la adiposustitución, y subrayar los mecanismos moleculares. La principal ventaja de esta técnica es que el aislamiento de las células de estoma se puede realizar con pocos pasos simples de muestras de corazón muy pequeñas.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el estudio de la miocardiopatía arritmogénica. También se puede aplicar a otros sistemas, como el estudio de las enfermedades cardiovasculares, para las que está indicada una biopsia endomiocárdica. Estudiamos por primera vez la idea de este método cuando comprendimos que podíamos reducir el procedimiento de aislamiento de células de estoma para aplicarlo a las biopsias cardíacas y a la electrofisiología que nos podía proporcionar.

Para este protocolo, se recolectó una biopsia endomiocárdica del ventrículo derecho de un paciente con MCA mediante mapeo electroanatómico integrado y fluoroscopia cardíaca. Tome unos cinco gramos de tejido y envíelo al laboratorio en medio TMES. En el laboratorio, configure la cabina de seguridad biológica según sea necesario para llevar a cabo el procedimiento hasta la digestión ensomática.

A continuación, transfiera la biopsia a una placa y lávela dos veces con PBS. En este punto, la biopsia se puede documentar fotográficamente bajo un microscopio. A continuación, transfiera la biopsia a un tubo de dos mililitros que contenga un mililitro de la solución de colagenasa.

Allí, corta la muestra en pequeños fragmentos, de entre 0,5 y un milímetro de ancho. A continuación, incubar el tejido durante 90 minutos a 37 grados centígrados con agitación rotativa continua. A continuación, centrifuga la solución digerida, retira el sobrenadante y vuelve a suspender el pellet en un mililitro de PBS.

A continuación, vuelva a centrifugar el tubo, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en un mililitro de TMES. Ahora coloque la suspensión en una placa de 60 milímetros y llene la placa hasta tres mililitros con TMES, pero no más. A continuación, cultive y expanda las células de acuerdo con el protocolo de texto.

Antes de comenzar, tenga listo para usar el reactivo de disociación celular, el tampón de lavado y los anticuerpos necesarios. Cuando el número estimado de células del cultivo alcance los tres millones, lave la placa de 100 milímetros dos veces con 10 mililitros de PBS estéril. A continuación, agregue cinco mililitros de un reactivo de disociación celular a las células e incube la placa durante siete a 10 minutos a temperatura ambiente para separar las células.

Una vez que las celdas estén separadas, agregue 15 mililitros de PBS a las celdas y transfiera la suspensión a un tubo de 50 mililitros. Ahora, centrifuga las celdas y vuelve a suspender el pellet en un mililitro de tampón de lavado. Luego cuente las celdas y transfiera tres millones a un nuevo tubo en un volumen final de 1,5 mililitros de tampón de lavado.

A continuación, divida la suspensión en 12 tubos de fax. En cada tubo, agregue los anticuerpos utilizados para caracterizar las CMSC en las concentraciones recomendadas. Asegúrese de incluir los controles de isotipo.

Una vez preparados, incubar los tubos durante 15 minutos a temperatura ambiente, protegidos de la luz. Más tarde, agregue un mililitro de tampón de lavado a cada tubo para detener las reacciones. A continuación, centrifugar las células, eliminar el sobrenadante y volver a suspender los gránulos en 250 microlitros de tampón de lavado.

Ahora proceda a caracterizar las células mediante citometría de flujo. Después de la diferenciación adipogénica de las células, utilice la tinción con ORO para comprobar la acumulación de lípidos. Antes de comenzar, asegúrese de tener una solución de trabajo ORO.

Antes de teñir las células, retire el medio y lave las células dos veces con dos mililitros de PBS. A continuación, cubra las células con un 4% de paraformaldehído y déjelas fijar durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, deseche el paraformaldehído y lave las células dos veces con dos mililitros de PBS.

Después del segundo lavado, agregue suficiente solución de trabajo ORO para cubrir las celdas. A continuación, incubar la placa durante una hora a temperatura ambiente. Esta incubación debe llevarse a cabo en un entorno en el que la autosolución no funcione, por lo que no se recomiendan salas llenas.

Después de la incubación, aspire la solución de ORO y lave las células con dos mililitros de PBS varias veces hasta que la mancha no se pueda ver en el lavado de PBS y hasta que, al verlo bajo el microscopio, no se detecte una tinción inespecífica. Ahora, utilizando un microscopio de contraste de fase de cultivo de tejidos invertido, capture 20 imágenes de cada pocillo con un aumento de 20x. Los detalles se proporcionan en el protocolo de texto.

Las CMSC se aislaron de las biopsias endomiocárdicas descritas. Para confirmar su linaje mesenquimatoso, las células se incubaron con anticuerpos conjugados florofour apropiados y se analizaron mediante citometría de flujo. Las CMSC fueron positivas para los antígenos mesenquimales de superficie específicos CD29, CD44 y CD105.

Se sabe que la fracción de células CD90 positivas es variable. No se expresaron los marcadores de herencia endotelial, herencia de monocitos o macrófagos, herencia onomatopéyica y del complejo mayor de histocompatibilidad. A continuación, las CMSC se cultivaron en medio T.ADIPO para la diferenciación adipogénica y se tiñeron con ORO para buscar gotas de lípidos intracelulares.

Las CMSC de pacientes con miocardiopatía arritmogénica acumularon más gotas de lípidos que las células de controles sanos. Estas diferencias se midieron en condiciones de diferenciación a las 72 horas y a los siete días. Una vez dominado, la resolución de la celda se puede realizar en tres horas, la tinción se puede realizar en dos horas y el análisis de fax se puede completar en tres horas.

Siguiendo este procedimiento, se podrían realizar otros métodos, como las pruebas de drogas, para responder preguntas adicionales como si podemos usar células de estoma de los mismos pacientes para responder a diferentes estímulos. Después de su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la miocardiopatía arritmogénica exploren la participación de las células del estroma cardíaco humano en la patogénesis de la enfermedad.