Un modelo de ratón de cáncer de páncreas Syngeneic para estudiar los efectos de la electroporación Irreversible

El objetivo general de este modelo es estudiar los efectos de la electroporación irreversible o IRE, sobre el cáncer de páncreas en ratones inmunocompetentes. Este modelo puede ayudar a responder muchas preguntas clave sobre el papel de la IRE en el cáncer de páncreas. Por ejemplo, ¿cómo afecta la IRE al microambiente tumoral local?

La principal ventaja de este modelo es que facilita la evaluación precisa del crecimiento tumoral en un sistema inmunocompetente, sin necesidad de modelos de ratón knockout o mutantes. Este método puede proporcionar información sobre los efectos de la IRE en el sistema inmunitario, en un modelo de ratón inmunocompetente de cáncer de páncreas. Para la inducción de tumores subcutáneos, primero, afeitar el sitio de la inyección en un ratón C57 negro C57 macho anestesiado de seis semanas de edad, y usar un hisopo con alcohol para limpiar el sitio dos veces.

A continuación, cargue una jeringa fría de un mililitro con una o dos veces diez a las siete celdas por mililitro y 250 microlitros de matriz de membrana basal. Coloque una aguja de calibre 25 en la jeringa y cargue la aguja con la suspensión de células tumorales. Presione y retraiga el émbolo varias veces para eliminar las burbujas de aire.

Inserte con cuidado la aguja debajo de la piel del lugar de la inyección, en un ángulo de 30 grados. Con la aguja paralela al cuerpo, inyecte lentamente 50 microlitros de las células tumorales. Después de 10 segundos, retire lentamente la aguja, manteniéndola paralela sin ningún movimiento lateral, y limpie suavemente el lugar de la inyección con un hisopo con alcohol, antes de devolver al ratón a su jaula.

Cuando el tumor alcance de cinco a siete milímetros, utilice pinzas estériles y microtijeras para extirpar el tumor subcutáneo, en condiciones estériles en una capucha de bioseguridad de nivel dos, teniendo cuidado de no perforar la cavidad peritoneal. Lave inmediatamente el tumor extirpado, dos veces, en PBS estéril. Y use bisturíes estériles para picar el tumor en pedazos de uno o dos milímetros cúbicos.

Luego, transfiera las piezas tumorales a una placa de Petri, que contenga medio basal DMEM frío y estéril en hielo. Para implantar los fragmentos tumorales, después de confirmar una falta de respuesta al pinzamiento del dedo del pie, aplique ungüento en los ojos del animal receptor anestesiado y coloque el ratón en su lado derecho, de modo que el lado izquierdo del abdomen quede expuesto. Retirar el vello abdominal con crema depilatoria, y retirar la crema con gasa.

Después de desinfectar la piel expuesta con tres toallitas secuenciales de povidona al 10% más yodo y alcohol, use un bisturí estéril para hacer una incisión de 1,5 centímetros en la piel, un centímetro a la izquierda de la línea media, por debajo de la caja torácica y ligeramente medial al bazo. Exteriorice suavemente el bazo con pinzas de punta plana y un aplicador de algodón estéril, y use las pinzas para retraer lateralmente la cola del páncreas, en la parte inferior del bazo. Con pinzas estériles, agarre una pieza tumoral finamente picada y pase una aguja de sutura estéril 6-O fina a través de la pieza.

Inserte la aguja que contiene el fragmento tumoral en la cola del páncreas, pasando la sutura lentamente a través del tejido. Se debe tener cuidado de evitar el contacto entre el tumor y la musculatura de la pared abdominal y el peritoneo, para prevenir la siembra del tumor. Cuando se haya asegurado el fragmento tumoral, retire completamente la aguja del tejido y mantenga los órganos completamente externalizados, durante 60 segundos adicionales, mientras inspecciona si hay signos de hemorragia.

Si no se observa sangrado, use pinzas romas o un aplicador de punta de algodón para devolver suavemente el bazo, el páncreas y el tumor a la cavidad abdominal. Antes de que el tumor alcance los seis milímetros de diámetro, coloque al animal anestesiado en su lado derecho para permitir el acceso al tumor, y use una maquinilla y un hisopo con alcohol para limpiar el sitio del tumor. Con fórceps, eleve la piel directamente debajo del tumor e inserte dos electrodos de aguja a través de la piel, paralelos al cuerpo, para sujetar el tumor, teniendo cuidado de que los electrodos no penetren en la cavidad peritoneal.

Configure el electroporador para que entregue pulsos de 100 microsegundos a una frecuencia de un hercio, a 1500 voltios por centímetro, para un total de 150 pulsos, y use el pedal para entregar los pulsos, separando cada conjunto de 10 pulsos por 10 segundos, para permitir la disipación de calor entre cada conjunto de pulsos. Dado que los espasmos musculares se producen durante la administración de la IRE y son más pronunciados durante la serie inicial de pulsos, asegúrese de que los electrodos sigan en el lugar deseado y de que el animal siga sedado después de cada serie de pulsos. Después de no más de 200 segundos de dosificación, retire los electrodos y registre el voltaje real suministrado, tal como se muestra en el electroporador.

Luego, regresa el ratón a su jaula. Para la IRE de un tumor ortotópico, de ocho a 10 días después de la implantación del tumor, use pinzas de nariz roma para exteriorizar el tumor con las pinzas y capture firmemente el tumor con los electrodos de platino de la pinza, administre los pulsos de electroporación, como se acaba de demostrar, manteniendo el tumor exteriorizado durante el último conjunto de pulsos, durante al menos 60 segundos, para controlar cualquier signo de hemorragia. A continuación, devolver el tumor a la cavidad abdominal y cerrar la incisión, como se ha demostrado, vigilando al animal hasta que se haya recuperado por completo.

En este experimento representativo, los tumores subcutáneos, en casi el 50% de los ratones, retrocedieron completamente después de 150 pulsos de IRE, con solo una regresión menor después de 75 pulsos. El análisis histológico del tejido tumoral, una semana después de la IRE, reveló grandes regiones de necrosis tumoral central, que no se observaron en los tumores control, no tratados, y que estaban flanqueadas por tejido tumoral vivo, en los casos de regresión tumoral incompleta. El seguimiento de las tasas de crecimiento de los tumores ortotópicos implantados reveló un crecimiento tumoral constante a lo largo del tiempo en los animales receptores, que también podría ser interrumpido por la IRE, lo que demuestra la capacidad de este modelo para simular los efectos de la IRE, en un modelo de ratón inmunocompetente.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en 15 minutos por ratón, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe mantener el tamaño del tumor dentro de la distancia de trabajo de los electrodos IRE disponibles, ya que los tumores más grandes producirán respuestas inconsistentes debido a una ablación incompleta. Otros enfoques de tratamiento, como la radiación o las quimioterapias, también se pueden usar para responder preguntas adicionales sobre si la combinación de tratamientos puede mejorar las respuestas tumorales a la IRE.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo establecer cánceres de páncreas subcutáneos y ortotópicos en ratones, y cómo realizar IRE en estos tumores.