Name: Un modelo de ratón de cáncer de páncreas Syngeneic para estudiar los efectos de la electroporación Irreversible (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Aprende a establecer un modelo de ratón síngénico para estudiar los efectos de la electroporación irreversible en cáncer de páncreas. Este método permite evaluar el crecimiento tumoral y la respuesta inmune en un sistema inmunocompetente.

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RRW ha recibido el apoyo para este trabajo de una beca de investigación aplicada colaborativa financiado por el C3 San Diego Padres Pedal la causa (#PTC2017).

Todos los experimentos con animales realizan siguiendo que este protocolo debe ser aprobado por el respectivo cuidado de Animal institucional y Comité uso (IACUC). Todos los procedimientos aquí descritos han sido aprobados por la UCSD IACUC.
1. adquirir animales receptores
Nota: La línea celular de KPC-Luc 4580 fue establecida de un tumor que se presenta en un LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; ROSA26 de LSL Luc / + ratón (KPC), que es un modelo genéticamente de PC sobre un fondo de C57BL/6. La ventaja de esta línea celular es que expresa constitutivamente permitiendo luciferase tumor monitoreo en modelos ortotópicos. Sin embargo, otras líneas celulares pueden usarse siempre y cuando sean compatibles con el fondo genético de los ratones receptores.
<ol><li>Determinar de antemano los grupos experimentales y el número de animales por grupo.</li>
	<li>Elija la edad (6 - 10 - vieja de semana ratones recomendadas) y sexo de los animales según la hipótesis y la línea celular utilizada.</li>
</ol>2. la cultura de las células
<ol><li>Dulbecco uso de modificado medio de eagle (DMEM): mezcla de nutrientes F12 (50: 50) medios que contienen 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% antibiótico de penicilina-estreptomicina (medios de crecimiento completa) para hacer crecer las células 4580 KPC-Luc.</li>
	<li>Si se congela, descongelar las células 4 días antes de la implantación del tumor.</li>
	<li>Crecen las células a 37 ° C con 5% CO2 y 95% de humedad bajo condiciones asépticas.</li>
	<li>Trypsinize las células con 0.25% tripsina durante 5 min a 37 ° C antes de llegar a > 80% de confluencia y neutralizar la tripsina añadiendo dos veces el volumen de medio de crecimiento completo. Nota: Estas células no establecen tumores eficientemente en ratones si se utilizan en el 100% de confluencia o si son pasados para más de 12 veces. Por lo tanto, es aconsejable congelar las células en pasajes anteriores bajo confluencia óptima.</li>
	<li>Contar las células usando un hemocitómetro y proceder a la inducción de tumor si hay números apropiados (0.5 - 1 x 106 células/ratón). Si no, expandir las células para un paso más hasta que se obtenga un número adecuado de células.</li>
</ol>3. inducción de tumores SQ
<ol><li>Preparar los materiales necesarios: P1000 y P100 pipetas y las puntas de la jeringa de 1 mL, 25G agujas, matriz de la membrana del sótano (BMM), tubos de centrífuga de medio basal de DMEM, 1,5 mL. Guardar todo el material estéril y frío (4 ° C) hasta el final del procedimiento. También mantener el cortapelo e hisopos de alcohol listo para uso animal.</li>
	<li>Trypsinize (según el paso 2.4) y contar las células y resuspender en una concentración de 2-4 x 107 células/mL de DMEM frío.</li>
	<li>Añadir un volumen igual de 100% BMM para hacer una suspensión definitiva en el 50% BMM. El volumen final debe ascender a 50 μl de suspensión celular para cada ratón necesaria. Preparar el 10% en exceso para acomodar el espacio muerto de la jeringa y los errores de pipeteo.</li>
	<li>Alícuota la suspensión en volúmenes de 550 μL en tubos de centrífuga de 1.5 mL se coloca en hielo.</li>
	<li>Refrenar los animales (ratones machos 6 - semana viejos de C57BL/6) utilizando un limitador o manualmente. Nota: Como alternativa, ratones pueden ser anestesiados con isoflurano de 2.5% en gas de oxígeno a un caudal de 2 L/min utilizando un vaporizador de precisión.</li>
	<li>Afeitar el sitio de inyección, que está en un flanco sobre una pierna, utilizando preferentemente un clipper. Limpie con un algodón embebido en alcohol el sitio de inyección dos veces.</li>
	<li>Dibujar 250 μl de suspensión celular a una concentración final de 1-2 x 107 células/mL en una jeringa de 1 mL frío y eliminar las posibles burbujas de aire al mover el pistón hacia arriba y hacia abajo. Conecte una aguja de 25G en la jeringa y llenar el espacio dentro de la aguja.</li>
	<li>Inserte cuidadosamente la aguja bajo la piel en un ángulo de 30° con el cuerpo cerca de los costados, asegurándose de que la aguja no perforar la cavidad peritoneal o la musculatura de las extremidades.</li>
	<li>Aplanar la aguja paralela al cuerpo y aplanar las arrugas en la piel. Lentamente inyectar 50 μl de suspensión celular. Mantenga la aguja en el sitio de la inyección para 10 s para permitir que el BMM se solidifique para evitar cualquier fuga.</li>
	<li>Retire lentamente la aguja manteniendo paralelos sin cualquier movimiento hacia un lado. Suavemente Limpie el sitio de inyección con un algodón embebido en alcohol y suelte el ratón para su vivienda. Nota: Si el ratón fue anestesiado durante el procedimiento, supervisar al animal hasta que recupere sus adrizamiento reflejos.</li>
	<li>Vigilar el crecimiento del tumor usando pinzas de hasta 5 mm de diámetro.</li>
</ol>4. inducción de tumores ortotópicos
<ol><li>Preparar los materiales necesarios. Autoclave el quirúrgico herramientas como tijeras, bisturís, aguja de controladores y puntas y pinzas de punta plana. Mantener prácticas Suturas estériles (6-0 absorbible y no absorbible 4-0), torundas de alcohol, cortapelos, crema depilatoria, lubricante ocular, gasa de algodón, solución de yodo povidona 10%, cortinas quirúrgicas, almohadillas, buprenorfina y agentes anestésicos.</li>
	<li>Eutanasia a un ratón de donantes (preferiblemente del mismo fondo para el modelo ortotópico) llevando un tumor SQ KPC con una cámara de llenado lento CO2 . Suprimir el tumor SQ cuidadosamente bajo condiciones estériles en una campana de BSL-2 utilizando pinzas estériles y microscissors poco antes de la implantación ortotópica. Durante la supresión del tumor tenga cuidado de no perforar la cavidad peritoneal y lavado el tumor inmediatamente con 2 intercambios de PBS estéril.</li>
	<li>Utilizando bisturís estériles, pique el tumor suprimido en trozos de 1 mm3 , colocarlos en una placa Petri que contiene media basal del DMEM estéril fría y almacenar en hielo hasta la implantación.</li>
	<li>Administrar el ratón receptor 0.05 - 1 mg/kg de buprenorfina analgésico SQ, de 30 min antes de la cirugía.</li>
	<li>Anestesiar los ratones receptores con 2-3% de isoflurano en oxígeno (2 L/min) con un vaporizador de precisión (o de otros agentes anestésicos). Mantenga ratones a 37 ° C cojín para la totalidad del procedimiento de calefacción. Aplicar lubricante en los ojos para evitar la desecación. Prueba la profundidad de la anestesia por la falta de una sorprendente reflejo inicialmente y confirmar la anestesia quirúrgica plano por la falta del reflejo pedal a un pellizco suave del dedo del pie. Mantener la anestesia durante todo el procedimiento quirúrgico.</li>
	<li>Coloque el ratón sobre su espalda y suavemente gire hacia su derecha para que quede expuesto el lado izquierdo del abdomen. Eliminar el vello abdominal de ratón con crema depilatoria y limpie con una gasa para no pelo libre entra en la incisión de abdomen post. Preparar el abdomen izquierdo para la cirugía con 3 ciclos de yodo povidona 10% seguido de toallitas de alcohol para desinfectar la piel.</li>
	<li>Con un bisturí estéril, hacer una incisión oblicua o transversal de 1.5 cm en la piel, 1 cm a la izquierda de la línea media, debajo de la caja torácica, ligeramente medial al bazo. Luego, extender la incisión a través de la musculatura abdominal, reflejo de la incisión superficial suprayacente.</li>
	<li>Localizar el bazo mediante plano con punta pinzas y suavemente lo extraer de la cavidad abdominal. Retraiga el bazo mediante un aplicador de algodón estéril y encontrar la cola del páncreas en la parte inferior del bazo.</li>
	<li>Con unas pinzas de punta plana, retraer lateralmente la cola del páncreas.</li>
	<li>Recoger pieza un tumor picada desde el ratón de donantes con la punta de una aguja de sutura estéril fina (6-0) y colocar con pinzas estériles.</li>
	<li>Mientras que suavemente contrae cuerpo y cola del páncreas lateralmente, inserte la aguja de la sutura que contiene el fragmento de tumor en la cola del páncreas. Pase la sutura lentamente a través del tejido, manteniendo el tumor en contacto con la cola pancreática. Aplicar una o dos suturas adicionales según la orientación del fragmento en relación con el tejido.</li>
	<li>Retire la aguja completamente el tejido y mantener el bazo páncreas exteriorizado por un adicional 60 s mientras la inspecciona para detectar cualquier signo de hemorragia o fuga. Entonces, internalizar suavemente les en la cavidad abdominal utilizando fórceps romos.</li>
	<li>Cierre la musculatura abdominal con una sutura absorbible de 6-0 o una puntada continua o interrumpida y cierre la piel con un 3-0 a 6-0 no absorbible sutura interrumpida. Descontinuar la anestesia en este punto.</li>
	<li>Permitir que el ratón se recupere en su casa jaula con libre acceso al alimento y agua. Coloque la jaula en una almohada para facilitar la recuperación. Monitor signos vitales como respiración, etc., de la perfusión durante el proceso de recuperación.</li>
	<li>Confirman los signos de enderezamiento reflejo una vez que el ratón se recupera, y la jaula luego volver puede a la vivienda habitual.</li>
	<li>Administrar buprenorfina 0.05 - 0.1 mg/kg 8-12 h después de la cirugía y cada 8-12 h después del procedimiento según sea necesario para las muestras de dolor.</li>
	<li>Monitorear el crecimiento del tumor utilizando una bioluminiscencia en vivo sistema de imagen (véase la Tabla de materiales).<ol>
<li>Seguir el crecimiento del tumor por proyección de imagen a partir del día 4 después de la implantación ortotópica y realizar proyección de imagen dos veces a la semana.</li>
		<li>En el día de la proyección de imagen, administrar (inyección intraperitoneal) 30 mg/kg D luciferin a una anestesia ratón receptor (2-3% de isoflurano en oxígeno (2 L/min)) 10 minutos antes de la proyección de imagen.</li>
		<li>Imagen de actividad de luciferasa utilizando el ajuste de la luminosidad sin filtros emisión durante un mínimo de 5 exposición en un sensor de luminiscencia con libre calefactada auto fluorescencia y manteniendo la anestesia para los ratones.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ira de tumores SQ
<ol><li>Preparar los materiales necesarios: cuadrada onda electroporator, pedal de seguridad, electrodos (matriz de aguja y pinzas-trode) y adaptadores. Mantener Suturas estériles (no absorbible 4-0), torundas de alcohol, cortar el pelo, crema depilatoria, lubricante de ojos, gasa de algodón, buprenorfina y anestésicos también está cerca.</li>
	<li>Esterilizar la pinza o aguja electrodos matriz utilizando la esterilización con gas. No se recomienda el autoclave. Usar un esterilizador de bolas de vidrio para esterilizar los electrodos entre animales.</li>
	<li>Administre buprenorfina 0.05 - 0.1 mg/Kg a los ratones con tumores 30 min antes del procedimiento.</li>
	<li>Siga los pasos de 4.4-4.5 para inducir la anestesia en ratones con éxito una vez que el implante tumoral cuadrados alcanza los 5 mm de diámetro.</li>
	<li>Coloque el ratón anestesiado en su lado al tumor SQ en el flanco. Eliminar el vello con tijeras y piel limpia con un algodón embebido en alcohol.</li>
	<li>Para los tumores cuadrados, utilizar electrodos de aguja 2 matriz. Elevar la piel directamente en el sitio del tumor con unas pinzas y colocar los electrodos a través de la piel paralelo al cuerpo asegurándose de que no penetran en la cavidad peritoneal. Una vez a través de la piel, coloque los electrodos de manera tal que soporte el tumor.</li>
	<li>Programa electroporator para entregar 100 μs pulsos a una frecuencia de 1 Hz a 1.500 V/cm para un total de 150 pulsaciones. Entregar los pulsos con el pedal de pie. Separado cada conjunto de 10 impulsos en 10 s, con el fin de permitir la disipación de calor y confirmar la posición correcta de los electrodos. Nota: Sin el uso de agentes paralíticos, ratones experimentará contracciones musculares con ira que puede causar el desplazamiento de los electrodos a menos que manualmente aseguradas.</li>
	<li>Retire los electrodos después de la dosis completa, que no deben exceder de 200 s. registro entrega la tensión de corriente, que se muestra en el electroporator. Permitir que los ratones a recuperar después de ira según pasos 4.14-4.16.</li>
</ol>6. ira de tumores ortotópicos
Nota: IRE de orthotopic tumores implica una segunda cirugía de supervivencia en el mismo ratón así que requieren especial aprobación del IACUC local antes de empezar.
<ol><li>Preparar materiales requeridos: autoclave las herramientas quirúrgicas tales como tijeras, bisturís, aguja controladores, señaló fórceps y con punta plana de fórceps. Tenga la siguiente cerca así: Suturas estériles (6-0 absorbible y no absorbible 4-0), torundas de alcohol, cortar el pelo, crema depilatoria, lubricante ocular, gasa de algodón, solución yodo povidona al 10%, cortinas quirúrgicas, almohadillas, electroporator de onda cuadrada, interruptor de pedal de seguridad, electrodos y sus adaptadores, buprenorfina y anestésicos.</li>
	<li>Evaluar los ratones para el crecimiento del tumor ortotópico por proyección de imagen en vivo (ver paso 4.17) mediante la inyección intraperitoneal de 30 mg/kg de D-Luciferin. Nota: Los tumores ortotópicos son ideales para IRE tratamiento 8 a 10 días post implantación cuando los tumores son claramente visibles y todavía confinado al páncreas como puede verse en las imágenes de luminiscencia luciferasa (ver Resultados de representante).</li>
	<li>Siga los pasos 4.4-4.9, para localizar el tumor implantado. Si el tumor no es fácil de localizar, utilizar pinzas de punta romas para mover el estómago y bazo con cuidado para identificar el tumor.</li>
	<li>Extraer el tumor con pinzas de punta romas y capturar el tumor con los electrodos de platino de la pinzas-trode. Entregar los pulsos de electroporación conforme a lo programado en el paso 5.7 utilizando la onda cuadrada electroporator en sets de 10 pulsos controlados por el interruptor de pie.</li>
	<li>Mantener el tumor exteriorizado por al menos 60 post s IRE a monitorear para detectar cualquier signo de hemorragia. Inserte el tumor en la cavidad abdominal y cerrar la incisión como la descrita anteriormente (pasos 4.13 4.16) y controlar el ratón hasta que recupera.</li>
	<li>Monitorear los efectos de la ira sobre el crecimiento tumoral mediante imágenes en vivo de luciferase según paso 4.17.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen divulgaciones financieras pertinentes.

En este estudio, hemos demostrado un modelo con ratones inmunocompetentes para PC que se puede utilizar para estudiar los efectos de la ira en el crecimiento del tumor. Actualmente, IRE se utiliza como una técnica de ablación termal no sólo en pacientes de PC localmente avanzados altamente seleccionados que no tienen progresión de la enfermedad distante después de meses de la terapia preoperatoria. Su uso ha sido limitado porque la mayoría de los pacientes con PC localmente avanzado desarrollar enfermedad metastásica dis...

Adenocarcinoma ductal pancreática (PC) se proyecta para convertirse en la segunda causa de muerte por cáncer en los Estados Unidos alrededor de 20201. La gran mayoría de pacientes diagnosticados de PC eventualmente morirán de enfermedad metastásica distante2. El microambiente de la PC es notoriamente inmunosupresor y quimioresistente. Su tejido conectador desmoplastic contiene una escasez de células de T effector (antitumoral) y una prominencia de los inmunosupresores leucocitos, incluyendo los macrófagos asociados a tumor (TAMs), (MDSCs) de las células supresoras derivadas mieloides y células de T reguladora (Tregs)3 . Estas subyacen a la necesidad de desarrollar estrategias multimodales que contrarrestar estos efectos del microambiente.
IRE ha sido desarrollado como un método no térmico de la ablación del tumor. A diferencia de técnicas de ablación térmica, IRE no causa necrosis coagulativa rápida pero en cambio resulta en progresiva apoptosis celular muerte4. Lo que es importante para los tumores pancreáticos, ira no es vulnerable a los efectos de "disipador" y puede realizarse justo al lado de los vasos sanguíneos5. Esta tecnología tiene 510 (k) de la FDA6 y está siendo usada clínicamente, para pacientes seleccionados con localmente avanzado o borderline resecable cáncer de páncreas. En la mayor serie publicada de IRE para PC7, la supervivencia mediana de pacientes que experimentan ira era aproximadamente doble de la supervivencia de los pacientes tratados con la quimioterapia moderna sola sin resección8,9.
Varios estudios han demostrado que la ablación térmica induce una respuesta inmune sistémica en otros tipos de tumor (revisado en Chu et al. 10). la ablación por radiofrecuencia (RFA) en tumor animal modelos conduce a mayor T cell infiltra11,12, incluyendo un aumento en células activadas asesino natural (NK) en hepatocelular cáncer pacientes13, 14y una disminución de Tregs inmunosupresoras en cáncer de pulmón pacientes15. Un número mucho más pequeño de estudios ha examinado inmune microambiental y respuestas de lesión a IRE16. IRE se ha demostrado para estimular una respuesta inmune sistémica en modelos con ratones inmunocompetentes en el que el crecimiento de los allografts secundaria de células renales (contralateral) fue reducido o impedido por la ira de un tumor primario dos semanas anterior17. También observaron que ratones inmunocompetentes requieren menos voltaje para la regresión completa de ratones inmunodeprimidos. Se ha presumido que IRE puede resultar en la presentación del antígeno mejorada en comparación con la necrosis coagulativa de la ablación térmica, pero esto no ha sido específicamente estudiado.
Hemos desarrollado un modelo de ratón syngeneic de la PC de la línea celular de KPC-Luc 4580 (regalo de J.J. Yeh en Universidad de Carolina del norte), que fue derivada de un tumor que se convirtió en un hombre LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; ROSA26 de LSL Luc / + ratón, para estudiar los efectos locales y sistémicos de IRE18,19. Esta línea celular expresan luciferasa es inmunogénica y también tumorígeno en ratones C57BL/6 inmunocompetentes cuando inyectan SQ o orthotopically y confiablemente produce metástasis hepáticas cuando se inyecta en el bazo. Hemos utilizado un generador de pulsos de onda cuadrada programable para entregar 100 μs pulsos de electricidad en una relación de tensión y distancia de 1.500 V/cm, utilizando una sonda de dos agujas matriz (separados por 5 mm) o platino pinzas-ARRODEO a tumores SQ u ortotópico, respectivamente, en ratones para modelar los efectos de la ira en un animal pequeño.

<table><tbody><tr><td>Electroporador de onda cuadrada ECM 830</td><td>Aparato de Harvard BTX</td><td># 45-0002 ( 58018-004 )</td><td></td></tr><tr><td>2 electrodo de matriz de aguja</td><td>Aparato de Harvard</td><td>45-0167</td><td></td></tr><tr><td>Interruptor de pie de seguridad</td><td>Aparato de Harvard</td><td>45-0211</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de platino</td><td>Aparato de Harvard</td><td>&nbsp; 45-0486</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>medios ThermoFisher Scientific</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td></td><td></td>792632</tr><tr><td>Lacrilube</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>19090646</tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>NC1292810</tr><tr><td>D-luciferrina</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&nbsp; Sistema de imágenes Spectrum In Vivo</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Cepa de ratón C57BL/6J</td><td>El Laboratorio Jackson&nbsp;</td><td>Línea de 6</td><td></td>células 000664/Black</tr><tr><td>(KPC-Luc 4580)</td><td>J.J. Yeh Lab en la Universidad de Carolina</td><td></td><td></td>del Norte</tr><tr><td>Agujas de jeringa BD Precisionglide</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td></td><td></td>Z192406</tr><tr><td>Hisopo con alcohol (70% de alcohol isopropílico)</td><td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Calibradores digitales</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-648-17</td><td></td></tr><tr><td>Bisturíes desechables, estériles</td><td>VWR</td><td>21909</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores con punta de algodón</td><td>VWR</td><td>89198</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de sutura, 45 cm, tamaño 6-0</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-3308</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de sutura, 45 cm, tamaño 4-0</td><td>Harvard Apparatus</td><td>72-3314</td><td></td></tr><tr><td>Povidona yodada 10%</td><td>BD</td><td>29900-404</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica desechable&nbsp;</td><td>KENT SCIENTIFIC CORP.</td><td>TP-3E</td><td></td></tr><tr><td>CORTADORA DE PELO PARA RATÓN</td><td>KENT SCIENTIFIC CORP.</td><td>CL8787</td><td></td></tr><tr><td>Paño quirúrgico</td><td>Harvard Apparatus</td><td>59-7421</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo de ratón de cáncer de páncreas syngeneic para estudiar los efectos de la electroporación irreversible

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Cáncer pancreático (PC), una enfermedad que mata a aproximadamente 40.000 pacientes cada año en los Estados Unidos, ha evadido con éxito varios enfoques terapéuticos incluyendo las prometedoras estrategias de inmunoterapia. Electroporación irreversible (IRE) es una técnica de ablación no térmico que induce la muerte de la célula del tumor sin la destrucción de las estructuras colágenas adyacentes, permitiendo así que el procedimiento que se realiza en tumores muy cerca de los vasos sanguíneos. A diferencia de técnicas de ablación térmica, IRE resulta en la muerte celular apoptótica gradual, junto con la necrosis inducida por la ablación inmediata y está actualmente en uso clínico para pacientes seleccionados con PC localmente avanzado. Un ablativo procedimiento específico no objetivo como IRE puede inducir una gran variedad de respuestas en el microambiente del tumor. Unos pocos estudios han abordado los efectos de la ira sobre el crecimiento tumoral en otros tipos de tumor, pero ninguno se han centrado en la PC. Hemos desarrollado un modelo de ratón syngeneic de la PC en que subcutánea (SQ) y el trasplante orthotopic del tumores pueden ser tratados con éxito con ira en un entorno altamente controlado, facilitando diversos estudios longitudinales post procedimiento. Este modelo animal sirve como un sistema robusto para el estudio de los efectos de la ira y las formas de mejorar la eficacia clínica de ira.

Seguimos el procedimiento descrito anteriormente y genera tumores cuadrados en 5-6 semana viejo tipo salvaje C57BL/6 ratones inoculados con 1 x 106 células con 50% BMM. Cuando el tamaño de tumor alcanza 5-6 mm de diámetro, algunos de los ratones fueron sacrificados y sus tumores fueron suprimidos, implantaron orthotopically en un receptor ratones C57BL/6. IRE fue realizada 10 días post implante, como se muestra en la línea de tiempo en la figura 1....

Electroporación irreversible (IRE) es una técnica de ablación térmica no utilizada para el tratamiento de cáncer de páncreas localmente avanzado. Ser una técnica relativamente nueva, los efectos de la ira en el crecimiento del tumor están mal entendidos. Hemos desarrollado un modelo de ratón syngeneic que facilita el estudio de los efectos de la ira en el cáncer de páncreas.

Un modelo de ratón de cáncer de páncreas Syngeneic para estudiar los efectos de la electroporación Irreversible

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

El objetivo general de este modelo es estudiar los efectos de la electroporación irreversible o IRE, sobre el cáncer de páncreas en ratones inmunocompetentes. Este modelo puede ayudar a responder muchas preguntas clave sobre el papel de la IRE en el cáncer de páncreas. Por ejemplo, ¿cómo afecta la IRE al microambiente tumoral local?La principal ventaja de este modelo es que facilita la evaluación precisa del crecimiento tumoral en un sistema inmunocompetente, sin necesidad de modelos de ratón knockout o mutantes. Este método puede proporcionar información sobre los efectos de la IRE en el sistema inmunitario, en un modelo de ratón inmunocompetente de cáncer de páncreas. Para la inducción de tumores subcutáneos, primero, afeitar el sitio de la inyección en un ratón C57 negro C57 macho anestesiado de seis semanas de edad, y usar un hisopo con alcohol para limpiar el sitio dos veces.A continuación, cargue una jeringa fría de un mililitro con una o dos veces diez a las siete celdas por mililitro y 250 microlitros de matriz de membrana basal. Coloque una aguja de calibre 25 en la jeringa y cargue la aguja con la suspensión de células tumorales. Presione y retraiga el émbolo varias veces para eliminar las burbujas de aire.Inserte con cuidado la aguja debajo de la piel del lugar de la inyección, en un ángulo de 30 grados. Con la aguja paralela al cuerpo, inyecte lentamente 50 microlitros de las células tumorales. Después de 10 segundos, retire lentamente la aguja, manteniéndola paralela sin ningún movimiento lateral, y limpie suavemente el lugar de la inyección con un hisopo con alcohol, antes de devolver al ratón a su jaula.Cuando el tumor alcance de cinco a siete milímetros, utilice pinzas estériles y microtijeras para extirpar el tumor subcutáneo, en condiciones estériles en una capucha de bioseguridad de nivel dos, teniendo cuidado de no perforar la cavidad peritoneal. Lave inmediatamente el tumor extirpado, dos veces, en PBS estéril. Y use bisturíes estériles para picar el tumor en pedazos de uno o dos milímetros cúbicos.Luego, transfiera las piezas tumorales a una placa de Petri, que contenga medio basal DMEM frío y estéril en hielo. Para implantar los fragmentos tumorales, después de confirmar una falta de respuesta al pinzamiento del dedo del pie, aplique ungüento en los ojos del animal receptor anestesiado y coloque el ratón en su lado derecho, de modo que el lado izquierdo del abdomen quede expuesto. Retirar el vello abdominal con crema depilatoria, y retirar la crema con gasa.Después de desinfectar la piel expuesta con tres toallitas secuenciales de povidona al 10% más yodo y alcohol, use un bisturí estéril para hacer una incisión de 1,5 centímetros en la piel, un centímetro a la izquierda de la línea media, por debajo de la caja torácica y ligeramente medial al bazo. Exteriorice suavemente el bazo con pinzas de punta plana y un aplicador de algodón estéril, y use las pinzas para retraer lateralmente la cola del páncreas, en la parte inferior del bazo. Con pinzas estériles, agarre una pieza tumoral finamente picada y pase una aguja de sutura estéril 6-O fina a través de la pieza.Inserte la aguja que contiene el fragmento tumoral en la cola del páncreas, pasando la sutura lentamente a través del tejido. Se debe tener cuidado de evitar el contacto entre el tumor y la musculatura de la pared abdominal y el peritoneo, para prevenir la siembra del tumor. Cuando se haya asegurado el fragmento tumoral, retire completamente la aguja del tejido y mantenga los órganos completamente externalizados, durante 60 segundos adicionales, mientras inspecciona si hay signos de hemorragia.Si no se observa sangrado, use pinzas romas o un aplicador de punta de algodón para devolver suavemente el bazo, el páncreas y el tumor a la cavidad abdominal. Antes de que el tumor alcance los seis milímetros de diámetro, coloque al animal anestesiado en su lado derecho para permitir el acceso al tumor, y use una maquinilla y un hisopo con alcohol para limpiar el sitio del tumor. Con fórceps, eleve la piel directamente debajo del tumor e inserte dos electrodos de aguja a través de la piel, paralelos al cuerpo, para sujetar el tumor, teniendo cuidado de que los electrodos no penetren en la cavidad peritoneal.Configure el electroporador para que entregue pulsos de 100 microsegundos a una frecuencia de un hercio, a 1500 voltios por centímetro, para un total de 150 pulsos, y use el pedal para entregar los pulsos, separando cada conjunto de 10 pulsos por 10 segundos, para permitir la disipación de calor entre cada conjunto de pulsos. Dado que los espasmos musculares se producen durante la administración de la IRE y son más pronunciados durante la serie inicial de pulsos, asegúrese de que los electrodos sigan en el lugar deseado y de que el animal siga sedado después de cada serie de pulsos. Después de no más de 200 segundos de dosificación, retire los electrodos y registre el voltaje real suministrado, tal como se muestra en el electroporador.Luego, regresa el ratón a su jaula. Para la IRE de un tumor ortotópico, de ocho a 10 días después de la implantación del tumor, use pinzas de nariz roma para exteriorizar el tumor con las pinzas y capture firmemente el tumor con los electrodos de platino de la pinza, administre los pulsos de electroporación, como se acaba de demostrar, manteniendo el tumor exteriorizado durante el último conjunto de pulsos, durante al menos 60 segundos, para controlar cualquier signo de hemorragia. A continuación, devolver el tumor a la cavidad abdominal y cerrar la incisión, como se ha demostrado, vigilando al animal hasta que se haya recuperado por completo.En este experimento representativo, los tumores subcutáneos, en casi el 50% de los ratones, retrocedieron completamente después de 150 pulsos de IRE, con solo una regresión menor después de 75 pulsos. El análisis histológico del tejido tumoral, una semana después de la IRE, reveló grandes regiones de necrosis tumoral central, que no se observaron en los tumores control, no tratados, y que estaban flanqueadas por tejido tumoral vivo, en los casos de regresión tumoral incompleta. El seguimiento de las tasas de crecimiento de los tumores ortotópicos implantados reveló un crecimiento tumoral constante a lo largo del tiempo en los animales receptores, que también podría ser interrumpido por la IRE, lo que demuestra la capacidad de este modelo para simular los efectos de la IRE, en un modelo de ratón inmunocompetente.Una vez dominada, esta técnica se puede completar en 15 minutos por ratón, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe mantener el tamaño del tumor dentro de la distancia de trabajo de los electrodos IRE disponibles, ya que los tumores más grandes producirán respuestas inconsistentes debido a una ablación incompleta. Otros enfoques de tratamiento, como la radiación o las quimioterapias, también se pueden usar para responder preguntas adicionales sobre si la combinación de tratamientos puede mejorar las respuestas tumorales a la IRE.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo establecer cánceres de páncreas subcutáneos y ortotópicos en ratones, y cómo realizar IRE en estos tumores.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

El video explica un método quirúrgico escalonado para la implantación ortotópica de un fragmento de tumor de un donante canceroso al páncreas de un ratón receptor no canceroso para el desarrollo de cáncer de páncreas. El PDAC implantado ortotópicamente podría recapturar el microambiente tisular de los cánceres de páncreas humanos con mayor precisión que los modelos subcutáneos (SC) convencionales.

Trasplante de tumor ortotópico con homoinjerto: una técnica para generar modelos de ratón de tumores pancreáticos

Este video describe el procedimiento para realizar electroporación irreversible (IRE) para la ablación no térmica de tumores pancreáticos en ratones. Tanto los tumores subcutáneos (SQ) como los ortotópicos se pueden tratar con éxito con IRE en un entorno altamente controlado, lo que facilita varios estudios posteriores al procedimiento.

Electroporación irreversible: una técnica para extirpar un tumor de páncreas en ratones

Este video muestra el protocolo para implantar ortotópicamente células de cáncer de páncreas que expresan proteínas fluorescentes verdes en el páncreas del ratón. El modelo ortotópico de ratón ayuda a investigar la eficacia de nuevas terapias en tumores primarios y metastásicos.

Modelo de ratón ortotópico fluorescente: implantación de células cancerosas que expresan GFP en ratones para evaluar la progresión tumoral in vivo

Este video muestra un modelo ortotópico de cáncer de páncreas que utiliza Matrigel para la administración celular localizada e imágenes de bioluminiscencia in vivo para el monitoreo no invasivo de la progresión tumoral. El modelo ortotópico es adecuado tanto para modelos singénicos como de xenoinjertos y podría utilizarse en ensayos preclínicos para investigar el impacto de nuevas terapias contra el cáncer en el crecimiento del tumor pancreático primario y la metástasis.

Modelo de ratón ortotópico bioluminiscente para cáncer de páncreas: una técnica no invasiva para monitorear la progresión del cáncer en ratones

Un modelo preclínico, murino de metástasis hepáticas realiza a través de una técnica de inyección hemispleen.

A preclínicos modelo murino de metástasis hepática

El objetivo de este protocolo es aplicar imágenes de resonancia magnética mejorada con contraste dinámico (DCE-MRI) para xenoinjertos ortotópicos de tumores pancreáticos en ratones. La DCE-MRI es un método no invasivo para analizar la microvasculatura en un tejido diana, y útil para evaluar la respuesta vascular en un tumor después de una terapia novedosa.

Dynamic Contrast mejorada de imagen de resonancia magnética de un modelo ortotópico de cáncer pancreático del ratón

Aquí se presenta un procedimiento para implantar células de cáncer de páncreas que expresan proteínas fluorescentes verdes (PANC-1 GFP) ortotópicamente en el páncreas de ratones Balb-c Ola Hsd-Fox1nu para evaluar la progresión tumoral y la metástasis.

Fluorescente modelo de ratón ortotópico de cáncer de páncreas

Describimos un protocolo para la implantación guiada por ultrasonido de líneas celulares de adenocarcinoma ductal pancreático derivados de la murino directamente en el sitio del tumor nativo. Este enfoque resultó en tumores pancreáticos detectables por la ecografía dentro de 2-4 semanas de la inyección, y redujo significativamente la proporción de la sesión de células tumorales en la pared peritoneal en comparación con la implantación ortotópica quirúrgica.

Ultrasonido-Guiado Implantación Ortotópica de Adenocarcinoma Ductal Pancreático Murino

En el contexto clínico, los pacientes con cáncer de páncreas localizado se someterán a pancreatectomía seguida de tratamiento adyuvante. Este protocolo divulgado aquí apunta establecer un método seguro y de manera efectiva de modelar este escenario clínico en ratones desnudos, con la implantación orthotopic del cáncer pancreático seguido por pancreatectomy y splenectomy distales.

Un modelo ortotópico de ratón reseccional de cáncer de páncreas

Los aloinjertos ortotópicos singénicos de ratón del adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) recapitulan la biología, los fenotipos y las respuestas terapéuticas de los subtipos de enfermedades. Debido a su progresión tumoral rápida y reproducible, son ampliamente utilizados en estudios preclínicos. Aquí, mostramos prácticas comunes para generar estos modelos, inyectando cultivos singénicos murinos de PDAC en el páncreas.

Aloinjertos ortotópicos singénicos de ratón para modelar el cáncer de páncreas

El presente protocolo describe un enfoque novedoso para modelar la pancreatitis obstructiva crónica, que implica la visualización del conducto pancreático y la electrocoagulación del conducto pancreático para causar obstrucción del conducto pancreático.

Un modelo de pancreatitis crónica obstructiva establecido mediante electrocoagulación

Aprende a establecer un modelo de ratón síngénico para estudiar los efectos de la electroporación irreversible en cáncer de páncreas. Este método permite evaluar el crecimiento tumoral y la respuesta inmune en un sistema inmunocompetente.

Un modelo de ratón de cáncer de páncreas Syngeneic para estudiar los efectos de la electroporación Irreversible

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